核酸環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)原理及引物設(shè)計與實例

1、核酸環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)原理及引物設(shè)計與實例煙頭整理1LAMP 引物的設(shè)計：LAMP引物的設(shè)計主要是針對靶基因的六個不同的區(qū)域，基于靶基因3 端的F3c、F2c和Flc區(qū)以及5 端的Bl、B2和B3區(qū)等6個不同的位點設(shè)計4種引物。FIP(Forward Inner Primer：上游內(nèi)部引物，由F2區(qū)和F1C區(qū)域組成，F(xiàn)2區(qū)與靶基因3端的F2c區(qū)域互補，F(xiàn)1C區(qū)與靶基因5端的Flc區(qū)域序列相同。F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer，由F3區(qū)組成，并與靶基因的F3c區(qū)域互補。 BIP引物：下游內(nèi)部引物(Backward Inner Primer ，由B1C和B2區(qū)域組成

2、，B2區(qū)與靶基因3 端的B2c區(qū)域互補，B1C域與靶基因5端的Blc區(qū)域序列相同。B3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer ，由B3區(qū)域組成，和靶基因的B3c區(qū)域互補。如圖所示： 2擴增原理6065是雙鏈DNA復(fù)性及延伸的中間溫度，DNA在65左右處于動態(tài)平衡狀態(tài)。因此，DNA在此溫度下合成是可能的。利用4種特異引物依靠一種高活性鏈置換DNA聚合酶。使得鏈置換DNA合成在不停地自我循環(huán)。擴增分兩個階段。第1階段為起始階段，任何一個引物向雙鏈DNA的互補部位進(jìn)行堿基配對延伸時，另一條鏈就會解離，變成單鏈。上游內(nèi)部引物FIP的F2序列首先與模板F2c結(jié)合（如圖B所示），在

3、鏈置換型DNA聚合酶的作用下向前延伸啟動鏈置換合成。外部引物F3與模板F3c結(jié)合并延伸，置換出完整的FIP連接的互補單鏈（如圖C所示）。FIP上的F1c與此單鏈上的Fl為互補結(jié)構(gòu)。自我堿基配對形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)（如圖C所示）。以此鏈為模板。下游引物BIP與B3先后啟動類似于FIP和F3的合成，形成啞鈴狀結(jié)構(gòu)的單鏈。迅速以3末端的Fl區(qū)段為起點以自身為模板，進(jìn)行DNA合成延伸形成莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)是LAMP基因擴增循環(huán)的起始結(jié)構(gòu)。第2階段是擴增循環(huán)階段。以莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)為模板，F(xiàn)IP與莖環(huán)的F2c區(qū)結(jié)合。開始鏈置換合成，解離出的單鏈核酸上也會形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。迅速以3末端的B1區(qū)段為起點，以自身為模板。進(jìn)行D

4、NA合成延伸及鏈置換形成長短不一的2條新莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)的DNA，BIP引物上的B2與其雜交。啟動新一輪擴增。且產(chǎn)物DNA長度增加一倍。在反應(yīng)體系中添加2條環(huán)狀引物L(fēng)F和LB，它們也分別與莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)結(jié)合啟動鏈置換合成，周而復(fù)始。擴增的最后產(chǎn)物是具有不同個數(shù)莖環(huán)結(jié)構(gòu)、不同長度DNA的混合物。且產(chǎn)物DNA為擴增靶序列的交替反向重復(fù) 序列。 3 LAMP的特點LAMP與以往的核酸擴增方法相比具有如下優(yōu)點：(1操作簡單，LAMP核酸擴增是在等溫條件下進(jìn)行，對于中小醫(yī)院只需要水浴鍋即可，產(chǎn)物檢測用肉眼觀察或濁度儀檢測沉淀濁度即可判斷。對于RNA的擴增只需要在反應(yīng)體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶就可同步進(jìn)行(RTLAMP，不

5、需要特殊的試劑及儀器。(2快速高效，因為不需要預(yù)先的雙鏈DNA熱變性避免了溫度循環(huán)而造成的時間損失核酸擴增在l h內(nèi)均可完成，添加環(huán)狀引物后時間可以節(jié)省12，多數(shù)情況在20。30 rain均可檢測到擴增產(chǎn)物。且產(chǎn)物可以擴增至109倍，達(dá)0.5 mgmL應(yīng)用專門的濁度儀可以達(dá)到實時定量檢測。(3高特異性，由于是針對靶序列6個區(qū)域設(shè)計的4種特異性引物。6個區(qū)域中任何區(qū)域與引物不匹配均不能進(jìn)行核酸擴增。故其特異性極高。(4高靈敏度，對于病毒擴增模板可達(dá)幾個拷貝，比PCR高出數(shù)量級的差異。缺點：由于LAMP擴增是鏈置換合成，靶序列長度最好在300 bp以內(nèi)。500 bp則較難擴增。故不能進(jìn)行長鏈DNA

6、的擴增。由于靈敏度高。極易受到污染而產(chǎn)生假陽性結(jié)果。故要特別注意嚴(yán)謹(jǐn)操作，以及在產(chǎn)物的回收鑒定、克隆、單鏈分離方面均遜色于傳統(tǒng)的PCR方法。4 引物設(shè)計實例LAMP引物設(shè)計的在線網(wǎng)站(http:/primerexplorer.jp/e/，只要導(dǎo)入靶基因就能自動生成成組引物。以某一微生物的鞭毛基因為例講解一下LAMP 相物設(shè)計的過程：首先單擊瀏覽按鈕選擇靶基因序列文件，靶序列默認(rèn)的是小于2 2 kbp。支持三個類型的文件，普通文本格式（僅含序列）, FASTA格式和GenBank 格式文件。第二，從下面三個選項中選擇定參數(shù)設(shè)定（引物設(shè)計條件）條件?；贕C含量的自動判斷, 起始的參數(shù)是特定的：如

7、果GC含量小于或等于45%.，則選取AT豐度高的區(qū),如果GC含量高于60%，則選取GC豐度高的區(qū),其它情況是標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定狀態(tài)。 關(guān)于引物設(shè)計的更多詳細(xì)資料請參考官方網(wǎng)站 http:/primerexplorer.jp/e/v3_manual/index.html 參考文獻(xiàn)： http:/primerexplorer.jp/e/v3_manual/index.html 唐畢峰.環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展.實用醫(yī)學(xué)雜志.2008.24（22）:3972-3974 蔡哲鈞.核酸環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志.2006。27(l2:1092-1096 Fukuta, S., et al., Real-time loop-mediated isothermal amplification for the CaMV-35S promoter as a scr