半重疊式多重引物PCR和基因掃描技術(shù)在T細胞淋巴瘤診斷中的應(yīng)用

1、半重疊式多重引物PCR和基因掃描技術(shù)在T細胞淋巴瘤診斷中的應(yīng)用 作者：金貴善 ，全成旭 ，劉福生 ，柴奇 【摘要】 目的 探討半重疊式多重熒光多重引物PCR和基因掃描技術(shù)在T細胞淋巴瘤診斷中的應(yīng)用. 方法 從普通石蠟切片組織標本中提取基因組DNA，用半重疊式多重熒光多重引物PCR擴增，利用DNA測序儀對其產(chǎn)物進行基因掃描分析. 結(jié)果 37例T細胞淋巴瘤中27例檢測出有克隆性重排;25例B細胞淋巴瘤中2例呈陽性;10例何杰金氏淋巴瘤和7例反應(yīng)性增生病例均呈陰性. 結(jié)論 在T細胞受體基因重排克隆性檢測中，半重疊式多重熒光多重引物PCR及基因掃描技術(shù)具有樣本來源便利，靈敏度高，特異性強，耗時短等優(yōu)點

2、，可作為T細胞淋巴瘤的診斷及鑒別診斷的輔助檢測手段. 【關(guān)鍵詞】 聚合酶鏈反應(yīng);淋巴瘤，T細胞;受體，抗原，T細胞，-;基因重排，T淋巴細胞 免疫球蛋白基因和T細胞受體（TCR）基因克隆性重排已成為診斷淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤常用的基因 標志，而TCR基因重排檢測可輔助診斷T細胞淋巴瘤.由于TCR的基因重排可出現(xiàn)在幾乎所有的T淋巴細胞及T淋巴細胞瘤，且結(jié)構(gòu)相對簡單，故常用于T細胞的克隆性檢測 1 .Southern雜交和聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）均為重要的克隆性檢測手段，其中Southern雜交法雖敏感且有特異性，但由于存在操作繁雜、耗時長及需使用新鮮組織等缺點，故廣泛應(yīng)用被受到限制.本實驗采用可覆蓋所

3、有TCR-鏈可變區(qū)（V）和連接鏈（J）的多重通用引物，經(jīng)過半重疊式PCR擴增及基因掃描，給經(jīng)HE形態(tài)學、免疫組織化學和Southern雜交法確診的淋巴瘤患者石蠟包埋組織標本的TCR-基因重排進行了檢測，探討了它在T細胞淋巴瘤診斷中的應(yīng)用價值. 1 材料與方法 1.1 標本來源及病理分類 79例病理石蠟組織標本取自北京市神經(jīng)外科研究所病理室，按照WHO1999年標準進行病理分類，其中T細胞淋巴瘤為37例，B細胞淋巴瘤為25例，何杰金氏淋巴瘤為10 例，淋巴組織反應(yīng)性增生為7例. 1.2 DNA的提取 常規(guī)方法提取石蠟標本中的組織DNA，制作410m厚的普通石蠟切片標本，常規(guī)脫蠟處理，對照HE染色

4、標本，將適量大小的腫瘤組織用刀片刮下，放入2050L裂解液中（10mmol TE buffer，1mmol EDTA），同時加入蛋白酶K使終濃度達到200mg/L，56恒溫水浴孵育過夜，經(jīng)94，10min滅活處理后，以12000r/min離心2min，上清液用作PCR模板.在重排測定前給所有模板進行球蛋白的PCR擴增，呈陽性者用于重排檢測，陰性者用前述方法重新提取. 1.3 引物選擇 采用半巢式多重引物PCR方法對TCR-基因的重排進行檢測.PCR所采用的通用引物包括覆蓋所有可變區(qū)家族（V V ）的4個正向引物和連接鏈（J ）的4個反向引物，引物序列見Table1.第2輪PCR中用V /B代替

5、第1輪中的V /A，同時在4個正向引物的5端均標記熒光染料，其中V ，V 標記同顏色熒光.用此多重引物擴增V V 的預(yù)期片段大小分別為260，180，160，150bp.因V 與V 的片段相差110bp，故雖為同顏色熒光，但并不影響相互區(qū)分.1.4 半重疊式多重熒光多重引物PCR 向25L反應(yīng)體系中加入模板DNA、多重引物、Ampli Taq Gold聚合酶、dNTP、10PCR緩沖液.PCR反應(yīng)條 件:94變性5min，擴增溫度9430s，6545s，7230s，共30個循環(huán)，最后72延伸7min.第2輪PCR中取1L第1輪PCR的產(chǎn)物為模板，同時用熒光染料標記的正向引物替代第1輪中的相應(yīng)引

6、物.取5L PCR產(chǎn)物在20g/L瓊脂糖凝膠中電泳，同時加入PhiX174DNA分子質(zhì)量標準，對PCR產(chǎn)物進行初步鑒定. 1.5 PCR產(chǎn)物序列測定 為驗證本實驗中所采用的半巢式多重引物PCR反應(yīng)的有效性和準確性，取4例經(jīng)Southern Blot證實有單克隆受體重排，并且經(jīng)多重引物PCR后，其產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳中片段大小有明顯差異的T細胞淋巴瘤DNA樣本（Fig1中Lane1，9，11，2的樣本），進行基因掃描和基因序列測定.樣本的準備:以基因組DNA為模板，用未作熒光標記的多重引物經(jīng)半重疊式PCR后，取2.5L PCR產(chǎn)物加入1L ExoSAP（Amer-sham Biosciences

7、），37孵育30min，去除多余的dNTPs和引物，再經(jīng)80，20min滅活處理，用未做標記的正向引物進行DNA序列測定. 1.6 基因掃描 給用熒光引物擴增的PCR產(chǎn)物進行基因掃描，上樣總量為5L，其中含有0.5L PCR產(chǎn)物、0.5L堿基長度標準參照物（Genescan-500ROX，PE/Applied Biosystems）、2L甲酰胺及0.5L上樣緩沖液.樣本經(jīng)95，2min變性處理后迅速置于冰塊中冷卻，上樣至ABI DNA序列測定儀.PCR產(chǎn)物經(jīng)分離膠分離后，用GENESCANTM672（ABI373A，Applied Biosystems，Weiterstadt，Germany）

8、掃描分析軟件進行分析. 2 結(jié)果 2.1 瓊脂糖凝膠電泳 組織標本基因組DNA首先經(jīng)-球蛋白引物擴增，證實所提取的DNA樣本可用于下游實驗時，再用TCR-的多重引物進行半重疊式PCR，擴增產(chǎn)物用20g/L瓊脂糖凝膠電泳作初步鑒定，結(jié)果見Fig1. 2.2 DNA序列分析 4例T細胞淋巴瘤樣本的PCR產(chǎn)物片段經(jīng)基因掃描結(jié)果分別顯示綠色、藍色、黃色和淡黃色的尖銳單峰，大小分別為258，182，162，150bp，根據(jù)顏色和bp大小判斷應(yīng)分別為V ，V ，V ，V 可變區(qū)的重排.經(jīng)序列測定，并與基因庫中T細胞受體基因序列（序列號為NG001336）進行比對，證實分別為V 2J 2，V 9J 2，V

9、10J 2和V 11J p1區(qū)間序列，與基因掃描結(jié)果一致.此結(jié)果囊括了4種可變區(qū)的序列，提示本項實驗中所用多重引物可靠. 2.3 基因掃描 選擇瓊脂糖凝膠電泳中陽性結(jié)果的樣本，進行基因掃描分析.掃描圖中，狹窄的銳利單峰表示有克隆性重排;2個銳利的峰表示有2個等位基因的重排;多克隆重排顯示為非特異性的寬峰;見Fig2.掃描圖中黑色代表黃色熒光，紅色峰為內(nèi)參堿基長度標準Genescan-500ROX.37例T細胞淋巴瘤中27例檢測出有受體的克隆性重排;25 例B細胞淋巴瘤中2例檢測出有TCR-受體的克 隆性重排;10例何杰金氏淋巴瘤中和7例反應(yīng)性增生病例標本中均未檢出有TCR-受體的克隆性重排;見

10、Table2.此結(jié)果與本室常規(guī)用Southern雜交方法檢測的結(jié)果基本一致.3 討論 以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的克隆性檢測已成為淋巴瘤診斷的重要輔助診斷手段.正常人或反應(yīng)性增生癥等疾病病人淋巴細胞起源于多個克隆，基因重排方式多樣，故PCR擴增產(chǎn)物片段長短不一，電泳后成彌散狀，而腫瘤細胞為單克隆細胞，具有同一形式的基因重排，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后呈特異性條帶.T細胞受體基因的重排發(fā)生在T細胞分化的早期，2種不同表型的T淋巴細胞（和）都存在著TCR-基因的重排，同時由于參與TCR-重排的基因片段數(shù)目少，故檢測相對容易，被廣泛應(yīng)用于T細胞的克隆性檢測.但是，由于TCR-受體重排時連接方式的有限性，導(dǎo)致TCR-

11、不同克隆之間基因擴增產(chǎn)物的長度差別很小，有時僅在1個或數(shù)個堿基之間，普通的瓊脂糖凝膠電泳很難將其區(qū)分開，容易造成假陽性.本研究中所采用的Gene-Scan分析方法具有高分辨能力，可檢測出即使1個堿基差異的基因擴增產(chǎn)物，可有效地避免假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，與傳統(tǒng)的SSCP方法相比具有明顯優(yōu)勢 2 .同時，由于采用了熒光標記引物，可更直觀地判斷重排發(fā)生所在可變區(qū)域，可用于疾病的追蹤性研究.以往的許多研究多以V J為引物進行TCR-基因片段的擴增，但由于少數(shù)T細胞淋巴瘤的重排是由V -J 1/2 以外的基因片段參與的重排 3 ，多重引物PCR方法可有效地避免由于引物設(shè)計缺陷造成的假陰性 4 .本研究所設(shè)計

12、的引物PCR產(chǎn)物片段最大的在260bp左右，因此即使是普通的組織石蠟切片標本也完全可以成為其DNA樣品來源.本研究中，27例有TCR-基因重排的T細胞淋巴瘤樣本中12例檢測出有V V 區(qū)的重排，其中6例與V 區(qū)的重排并存，另外6例為單獨的V /V /V 區(qū)的重排，在與V 區(qū)重排并存的6例樣本中，2例被證實為寡克隆.提示單純應(yīng)用V 區(qū)引物擴增TCR-片段不僅降低檢出率，造成假陰性， 而且使部分寡克隆的樣本被誤認為是單克隆的重 排.上述2例寡克隆樣本通過其他檢查證實為T細胞淋巴瘤，寡克隆發(fā)生可能與腫瘤組織中炎性細胞浸潤或腫瘤的發(fā)展進程相關(guān) 5，6 .用半重疊式多重引物PCR-基因掃描分析技術(shù)對石蠟

13、包埋組織標本進行檢測的結(jié)果與我室常規(guī)Southern雜交檢測結(jié)果基本一致，提示此方法不僅與Southern雜交檢測一樣具有高度靈敏性和特異性，而且由于適用于石蠟標本，故不僅可作為臨床輔助診斷的檢測手段，還可用于回顧性研究.經(jīng)免疫組織化學及Southern雜交檢測證實為B細胞淋巴瘤的病例中2例檢測出TCR-基因重排，可能為異型基因重排，即B淋巴細胞惡性腫瘤中存在TCR-克隆性基因重排 7 ，可能是由惡性淋巴細胞在分化過程中出現(xiàn)錯誤的雙重排及分化幼稚的腫瘤細胞基因重排調(diào)控失常所致.因此認為TCR-基因重排并非克隆性T細胞增生所特有，還應(yīng)結(jié)合其他檢查進行綜合判斷.總之，半重疊式多重引物PCR和基因掃

14、描技術(shù)具有病理材料來源便利，檢出率高，操作簡便等優(yōu)點，可作為T細胞淋巴瘤的診斷及鑒別診斷的輔助檢測手段.【參考文獻】 1 Khalil SH，Hamadah IR.The applicability of T-cell re-ceptor gamma gene rearrangement as an adjuvant diag-nostic tool in skin biopsies for cutaneous T-cell lymphoma J.Saudi Med J，2006，27（7）:951.2 Wickham CL，Lynas C，Ellard S.Detection of clon

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