醫(yī)療器械無(wú)菌檢查(共61頁(yè)).ppt

1、1 醫(yī)療器械醫(yī)療器械- -無(wú)菌檢查無(wú)菌檢查 江蘇省醫(yī)療器械檢驗(yàn)所江蘇省醫(yī)療器械檢驗(yàn)所 2 主要內(nèi)容主要內(nèi)容n無(wú)菌定義及無(wú)菌檢查定義無(wú)菌定義及無(wú)菌檢查定義 n無(wú)菌檢驗(yàn)依據(jù)無(wú)菌檢驗(yàn)依據(jù)n試驗(yàn)主要設(shè)備試驗(yàn)主要設(shè)備n實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件及人員要求實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件及人員要求n培養(yǎng)基種類及配制要求培養(yǎng)基種類及配制要求n培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基適用性檢查n試驗(yàn)菌種及菌液制備試驗(yàn)菌種及菌液制備n無(wú)菌檢查方法驗(yàn)證無(wú)菌檢查方法驗(yàn)證n供試品無(wú)菌檢查及結(jié)果判斷供試品無(wú)菌檢查及結(jié)果判斷 3 無(wú)菌定義無(wú)菌定義: :無(wú)活微生物的狀態(tài)。無(wú)活微生物的狀態(tài)。無(wú)菌檢查定義無(wú)菌檢查定義 ： 無(wú)菌檢查法系用于檢查無(wú)菌檢查法系用于檢查藥典要求無(wú)菌的藥

2、品、原料、輔料及其藥典要求無(wú)菌的藥品、原料、輔料及其他品種是否無(wú)菌的一種方法。若供試品他品種是否無(wú)菌的一種方法。若供試品符合無(wú)菌檢查法的規(guī)定，僅表明了供試符合無(wú)菌檢查法的規(guī)定，僅表明了供試品在該檢驗(yàn)條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。品在該檢驗(yàn)條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。（1）無(wú)菌定義）無(wú)菌定義4 （2）無(wú)菌檢驗(yàn)依據(jù)無(wú)菌檢驗(yàn)依據(jù)本規(guī)范選用于本規(guī)范選用于中國(guó)藥典中國(guó)藥典20102010年版二年版二部附錄部附錄XI HXI H無(wú)菌檢查法。無(wú)菌檢查法。GB/T 14233.2-2005GB/T 14233.2-2005 醫(yī)用輸液、輸血、醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗(yàn)方法注射器具檢驗(yàn)方法 ，第二部分：生物，第二部分：生

3、物試驗(yàn)方法中規(guī)定的無(wú)菌試驗(yàn)方法。試驗(yàn)方法中規(guī)定的無(wú)菌試驗(yàn)方法。5 （3）試驗(yàn)主要設(shè)備）試驗(yàn)主要設(shè)備超凈工作臺(tái)超凈工作臺(tái)細(xì)菌培養(yǎng)箱細(xì)菌培養(yǎng)箱霉菌培養(yǎng)箱霉菌培養(yǎng)箱立式高壓蒸汽滅菌器立式高壓蒸汽滅菌器臺(tái)式高壓蒸汽滅菌器臺(tái)式高壓蒸汽滅菌器顯微鏡顯微鏡生物安全柜生物安全柜電熱恒溫干燥箱電熱恒溫干燥箱集菌儀集菌儀6試驗(yàn)儀器（試驗(yàn)儀器（1 1） - - 超凈工作臺(tái)超凈工作臺(tái)7試驗(yàn)設(shè)備試驗(yàn)設(shè)備（2）-隔水式恒溫培養(yǎng)箱隔水式恒溫培養(yǎng)箱8試驗(yàn)設(shè)備（試驗(yàn)設(shè)備（3 3）-霉菌培養(yǎng)箱霉菌培養(yǎng)箱9試驗(yàn)設(shè)備試驗(yàn)設(shè)備（4）-立式高壓蒸汽滅菌器立式高壓蒸汽滅菌器10試驗(yàn)設(shè)備（試驗(yàn)設(shè)備（5 5）-臺(tái)式蒸汽滅菌器臺(tái)式蒸汽滅菌器11

4、試驗(yàn)設(shè)備（試驗(yàn)設(shè)備（6 6）- 顯顯 微微 鏡鏡12試驗(yàn)設(shè)備（試驗(yàn)設(shè)備（7 7）- -生物安全柜生物安全柜13試驗(yàn)設(shè)備（8）Equinox 全自動(dòng)無(wú)菌檢驗(yàn)系統(tǒng)14（4 4）實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件要求：）實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件要求： 無(wú)菌檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度無(wú)菌檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度10 00010 000級(jí)下的級(jí)下的局部潔凈度局部潔凈度100100級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進(jìn)行，其全過(guò)程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌離系統(tǒng)中進(jìn)行，其全過(guò)程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止微生物污染。單向流空氣區(qū)、工操作，防止微生物污染。單向流空氣區(qū)、工作臺(tái)面及環(huán)境應(yīng)定期按作臺(tái)面及環(huán)境應(yīng)定期按醫(yī)藥工業(yè)潔凈室醫(yī)藥工業(yè)潔凈室( (區(qū)

5、區(qū)) )懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測(cè)試方法懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測(cè)試方法的現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度驗(yàn)證。隔離系統(tǒng)的現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度驗(yàn)證。隔離系統(tǒng)按相關(guān)的要求進(jìn)行驗(yàn)證，其內(nèi)部環(huán)境的潔凈按相關(guān)的要求進(jìn)行驗(yàn)證，其內(nèi)部環(huán)境的潔凈度須符合無(wú)菌檢查的要求。度須符合無(wú)菌檢查的要求。15 （4 4）實(shí)驗(yàn)人員要求：實(shí)驗(yàn)人員要求： 菌檢人員必須具備微生物專業(yè)知識(shí)，并菌檢人員必須具備微生物專業(yè)知識(shí)，并 經(jīng)過(guò)無(wú)菌技術(shù)培訓(xùn)。經(jīng)過(guò)無(wú)菌技術(shù)培訓(xùn)。 16（5 5）培養(yǎng)基）培養(yǎng)基種類及要求種類及要求 n硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基n改良馬丁培養(yǎng)基改良馬丁培養(yǎng)基2012年12月1717（5 5）培養(yǎng)基）培養(yǎng)基

6、種類及要求種類及要求 n無(wú)菌檢查：硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基無(wú)菌檢查：硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基2012年12月1818（5 5）培養(yǎng)基）培養(yǎng)基種類及要求種類及要求 無(wú)菌檢查無(wú)菌檢查 ：改良馬丁培養(yǎng)基：改良馬丁培養(yǎng)基：19（5 5）培養(yǎng)基）培養(yǎng)基種類及要求種類及要求 保存時(shí)間：保存時(shí)間： 制備好的培養(yǎng)基應(yīng)保存在：制備好的培養(yǎng)基應(yīng)保存在：2 2 2525、避光避光 n 非密閉容器中：一般在三周內(nèi)使用非密閉容器中：一般在三周內(nèi)使用n 密閉容器中：一般可在一年內(nèi)使用密閉容器中：一般可在一年內(nèi)使用20（5 5）培養(yǎng)基）培養(yǎng)基種類及要求種類及要求 一般采用商品脫水培養(yǎng)基一般采用商品脫水培養(yǎng)基，臨用時(shí)按照臨用時(shí)按照使

7、用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行配制，配制時(shí)須迅速，使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行配制，配制時(shí)須迅速，以免吸潮影響稱量的準(zhǔn)確性，同時(shí)需注以免吸潮影響稱量的準(zhǔn)確性，同時(shí)需注意滅菌后培養(yǎng)基的意滅菌后培養(yǎng)基的pHpH值值應(yīng)符合規(guī)定，否應(yīng)符合規(guī)定，否則必須校正后滅菌使用。則必須校正后滅菌使用。新鮮配制的培養(yǎng)基，應(yīng)符合新鮮配制的培養(yǎng)基，應(yīng)符合中國(guó)藥典中國(guó)藥典規(guī)定的配方，對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行挑選。規(guī)定的配方，對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行挑選。21（5 5）培養(yǎng)基）培養(yǎng)基種類及要求種類及要求 硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基：硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基：屬于流體培養(yǎng)基，屬于流體培養(yǎng)基，即在液體培養(yǎng)基中加入即在液體培養(yǎng)基中加入0.05%0.05%0.07%0.07%的的瓊脂瓊脂，增加了培養(yǎng)基的

8、粘度，降低培養(yǎng)，增加了培養(yǎng)基的粘度，降低培養(yǎng)基中的含氧量，使培養(yǎng)基在一段時(shí)間內(nèi)基中的含氧量，使培養(yǎng)基在一段時(shí)間內(nèi)保持厭氧的條件，有利于厭氧菌的生長(zhǎng)。保持厭氧的條件，有利于厭氧菌的生長(zhǎng)。硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基分裝在適宜的容器中，硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基分裝在適宜的容器中，其粉紅色的其粉紅色的氧化層氧化層適合需氣菌的生長(zhǎng)，適合需氣菌的生長(zhǎng)，在供試品接種前，培養(yǎng)基的氧化層的顏在供試品接種前，培養(yǎng)基的氧化層的顏色不得超過(guò)培養(yǎng)基深度的色不得超過(guò)培養(yǎng)基深度的1 15 5，調(diào)，調(diào)PHPH值值滅菌后為滅菌后為7.17.10.20.2，分裝，滅菌。，分裝，滅菌。硫乙醇酸鹽培養(yǎng)管置：硫乙醇酸鹽培養(yǎng)管置：30303535培養(yǎng)培養(yǎng)

9、1414天。天。22（5 5）培養(yǎng)基）培養(yǎng)基種類及要求種類及要求 n改良馬丁培養(yǎng)基：改良馬丁培養(yǎng)基：取培養(yǎng)基成分混合，微取培養(yǎng)基成分混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)溫溶解，調(diào)節(jié)PHPH值約為值約為6.86.8，煮沸，搖勻，煮沸，搖勻，調(diào)調(diào)PHPH值滅菌后為值滅菌后為6.46.40.20.2，分裝，滅菌。，分裝，滅菌。n 改良馬丁培養(yǎng)基：改良馬丁培養(yǎng)基：置置23232828培養(yǎng)培養(yǎng)1414天。天。23（5 5）培養(yǎng)基）培養(yǎng)基種類及要求種類及要求 培養(yǎng)基裝量培養(yǎng)基裝量：n對(duì)于采用直接接種法檢查的對(duì)于采用直接接種法檢查的液體液體樣品，培樣品，培養(yǎng)基的裝量與供試品裝量相關(guān)，應(yīng)根據(jù)供養(yǎng)基的裝量與供試品裝量相關(guān)，應(yīng)根

10、據(jù)供試品接種量確定培養(yǎng)基的裝量，使供試品試品接種量確定培養(yǎng)基的裝量，使供試品接種體積不大于培養(yǎng)基的接種體積不大于培養(yǎng)基的10%10%。n對(duì)于采用直接接種法檢查的對(duì)于采用直接接種法檢查的固體固體樣品，培樣品，培養(yǎng)基的裝量均為養(yǎng)基的裝量均為100ml100ml；一次性醫(yī)用材料；一次性醫(yī)用材料及醫(yī)療器具，若醫(yī)療器具體積過(guò)大，培養(yǎng)及醫(yī)療器具，若醫(yī)療器具體積過(guò)大，培養(yǎng)基的裝量可基的裝量可2000ml2000ml以上，已將其完全浸沒(méi)以上，已將其完全浸沒(méi)為準(zhǔn)。為準(zhǔn)。n對(duì)于采用對(duì)于采用薄膜過(guò)濾法薄膜過(guò)濾法檢查的樣品，封閉式檢查的樣品，封閉式薄膜濾器的培養(yǎng)基裝量為薄膜濾器的培養(yǎng)基裝量為100ml 100ml 。

11、24 （6）培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基適用性檢查n新購(gòu)的培養(yǎng)基或自配的新鮮培養(yǎng)基要求：新購(gòu)的培養(yǎng)基或自配的新鮮培養(yǎng)基要求：n無(wú)菌性檢查：無(wú)菌性檢查：n每批培養(yǎng)基隨機(jī)取不少于每批培養(yǎng)基隨機(jī)取不少于5 5支（瓶），培養(yǎng)支（瓶），培養(yǎng)1414天，天，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。n靈敏度檢查：靈敏度檢查：n其質(zhì)量均應(yīng)符合其質(zhì)量均應(yīng)符合靈敏度檢查要求靈敏度檢查要求。用于培養(yǎng)基靈敏。用于培養(yǎng)基靈敏度檢查的菌種如下：菌種的傳代的次數(shù)不得超過(guò)度檢查的菌種如下：菌種的傳代的次數(shù)不得超過(guò)5 5代代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為0 0代代）。）。25（6）培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基適用

12、性檢查菌種：試驗(yàn)用菌株及菌液制備：菌種：試驗(yàn)用菌株及菌液制備：n金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003CMCC(B)26003n銅綠色假單胞菌銅綠色假單胞菌CMCC(B)10104 CMCC(B)10104 n大腸埃希菌大腸埃希菌CMCC(B)44102CMCC(B)44102n枯草桿菌枯草桿菌CMCC(B)63501 CMCC(B)63501 n生孢梭菌生孢梭菌CMCC(B)64941 CMCC(B)64941 n白色念珠菌白色念珠菌CMCC(F)98001 CMCC(F)98001 n黑曲霉黑曲霉CMCC(F)98003 CMCC(F)98003 菌種的要求：菌種的要求： 不

13、得超過(guò)不得超過(guò)5 5代。采用適代。采用適宜的方法保存；并以保證試驗(yàn)菌宜的方法保存；并以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。株的生物學(xué)特性。 26（6）培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基適用性檢查 菌液制備菌液制備 n一般當(dāng)日使用。一般當(dāng)日使用。n取取金黃金黃色葡萄球菌、色葡萄球菌、銅綠銅綠假單胞菌、假單胞菌、枯草枯草芽孢桿菌，少許接芽孢桿菌，少許接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯基中，種至營(yíng)養(yǎng)肉湯基中，生孢生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物少許接種至硫乙梭菌的新鮮培養(yǎng)物少許接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30303535培養(yǎng)培養(yǎng)18 18 24h24h；n白色白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物接種改良馬丁培養(yǎng)基中，念珠菌的新鮮培養(yǎng)物接種改良馬

14、丁培養(yǎng)基中， 23232828培養(yǎng)培養(yǎng)24 24 48h48h，上述培養(yǎng)物用，上述培養(yǎng)物用0.9%0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成含菌無(wú)菌氯化鈉溶液制成含菌量小于量小于100cfu/ml100cfu/ml菌懸液；菌懸液；n黑曲黑曲霉霉 菌斜面的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基菌斜面的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，上， 23232828培養(yǎng)培養(yǎng)5 5 7 7天，使大量的孢子成熟。加入天，使大量的孢子成熟。加入3 3 5ml5ml含含0.05%0.05%（ml/mlml/ml）聚山梨酯）聚山梨酯8080的的0.9%0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后用適宜的方法吸

15、出孢子懸液至無(wú)菌試管中，孢子洗脫。然后用適宜的方法吸出孢子懸液至無(wú)菌試管中，用含用含0.05%0.05%（ml/mlml/ml）聚山梨酯）聚山梨酯8080的的0.9%0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成無(wú)菌氯化鈉溶液制成小于小于100cfu/ml 100cfu/ml 的孢子懸液。（見(jiàn)表）的孢子懸液。（見(jiàn)表）27 （6）培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基適用性檢查 中國(guó)藥典中國(guó)藥典20102010年無(wú)菌檢查驗(yàn)證試驗(yàn)中使用年無(wú)菌檢查驗(yàn)證試驗(yàn)中使用7 7株菌見(jiàn)下表株菌見(jiàn)下表菌菌 種種 接種培養(yǎng)基接種培養(yǎng)基 培養(yǎng)溫度培養(yǎng)溫度 培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)時(shí)間金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌 營(yíng)養(yǎng)肉湯或者普通營(yíng)養(yǎng)肉湯或者普通斜面斜面 30303

16、535 181824h24h銅綠假單孢菌銅綠假單孢菌 枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌 大腸埃希菌大腸埃希菌 （無(wú)）（無(wú)）生孢梭菌生孢梭菌硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基白色念珠菌白色念珠菌 改良馬丁或者普通改良馬丁或者普通斜面斜面 23232828 242448h48h黑曲霉黑曲霉 改良馬丁斜面改良馬丁斜面 232328285 57d 7d 28（6）培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基適用性檢查 培養(yǎng)基接種培養(yǎng)基接種 金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌2 2支支 銅綠假單胞菌銅綠假單胞菌2 2支支硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌2 2支支 生孢梭菌生孢梭菌2 2支支 9 9支培養(yǎng)基裝

17、量支培養(yǎng)基裝量12ml12ml，空白對(duì)照空白對(duì)照1 1支。支。 分別接種小于分別接種小于100cfu/ml100cfu/ml金葡、銅綠、枯草、生孢金葡、銅綠、枯草、生孢各各2 2管管，另，另1 1支不接種做空白對(duì)照，支不接種做空白對(duì)照，培養(yǎng)培養(yǎng)3 3天，逐日觀察天，逐日觀察結(jié)果。結(jié)果。29（5）培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基適用性檢查 培養(yǎng)基接種培養(yǎng)基接種 白色念株菌白色念株菌2 2支支改良馬丁培養(yǎng)改良馬丁培養(yǎng) 黑曲霉黑曲霉2 2支支 （5 5支培養(yǎng)基裝量支培養(yǎng)基裝量9ml9ml，其中，其中1 1支做空白對(duì)照）支做空白對(duì)照） 分別接種小于分別接種小于100cfu/ml100cfu/ml白色、黑曲各兩支

18、白色、黑曲各兩支，另另1 1支不接種做空白對(duì)照。支不接種做空白對(duì)照。培養(yǎng)培養(yǎng)5 5天，逐日觀察結(jié)天，逐日觀察結(jié)果。果。30（6）培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基適用性檢查結(jié)果判斷結(jié)果判斷 空白對(duì)照管應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)，若加菌的培養(yǎng)管均生空白對(duì)照管應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)，若加菌的培養(yǎng)管均生長(zhǎng)良好，判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。長(zhǎng)良好，判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。31（7）試驗(yàn)）試驗(yàn)(驗(yàn)證驗(yàn)證)菌種及菌液制備菌種及菌液制備菌種：試驗(yàn)用菌株及菌液制備：菌種：試驗(yàn)用菌株及菌液制備：n金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003CMCC(B)26003n大腸埃希菌大腸埃希菌CMCC(B)44102CMCC(B)4410

19、2n枯草桿菌枯草桿菌CMCC(B)63501 CMCC(B)63501 n生孢梭菌生孢梭菌CMCC(B)64941 CMCC(B)64941 n白色念珠菌白色念珠菌CMCC(F)98001 CMCC(F)98001 黑曲霉黑曲霉CMCC(F)98003 CMCC(F)98003 32（6）試驗(yàn)菌種及菌液制備）試驗(yàn)菌種及菌液制備n1010倍梯度稀釋倍梯度稀釋n選擇適宜的選擇適宜的3 3個(gè)稀釋級(jí)別個(gè)稀釋級(jí)別n要求要求100cfu/ml100cfu/ml33（7）無(wú)菌檢查方法驗(yàn)證）無(wú)菌檢查方法驗(yàn)證n驗(yàn)證準(zhǔn)備條件：驗(yàn)證準(zhǔn)備條件： n 稀釋液、沖洗液及其制備方法稀釋液、沖洗液及其制備方法n 0.10.1

20、蛋白胨水溶液蛋白胨水溶液n pH7.0pH7.0氯化鈉氯化鈉蛋白胨緩沖液蛋白胨緩沖液1.1. 制備的菌液，應(yīng)當(dāng)日使用。制備的菌液，應(yīng)當(dāng)日使用。34（7）無(wú)菌檢查方法驗(yàn)證）無(wú)菌檢查方法驗(yàn)證 目的目的: :n證明所采用的方法適合于該供試品的無(wú)菌檢查證明所采用的方法適合于該供試品的無(wú)菌檢查n確認(rèn)供試品在該實(shí)驗(yàn)條件下無(wú)抑菌活性或其抑菌活性確認(rèn)供試品在該實(shí)驗(yàn)條件下無(wú)抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不計(jì)?？梢院雎圆挥?jì)。1.1.確保在實(shí)際檢驗(yàn)條件下，該供試品的無(wú)菌檢查法的準(zhǔn)確保在實(shí)際檢驗(yàn)條件下，該供試品的無(wú)菌檢查法的準(zhǔn)確性、有效性和重現(xiàn)性。確性、有效性和重現(xiàn)性。 驗(yàn)證時(shí)，按驗(yàn)證時(shí)，按“供試品的無(wú)供試品的無(wú)菌檢查

21、菌檢查”的規(guī)定及下列要求進(jìn)行操作。對(duì)每一試驗(yàn)菌的規(guī)定及下列要求進(jìn)行操作。對(duì)每一試驗(yàn)菌應(yīng)逐一進(jìn)行驗(yàn)證。應(yīng)逐一進(jìn)行驗(yàn)證。35（7）無(wú)菌檢查方法驗(yàn)證）無(wú)菌檢查方法驗(yàn)證菌種及菌液制備菌種及菌液制備 ：除大腸埃希菌除大腸埃希菌（Escherichia coli）CMCC(B) 4 4102外，外，金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌 、 枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌 、 生孢梭生孢梭菌、菌、 白色念珠菌、黑曲霉同培養(yǎng)基靈敏度檢查。白色念珠菌、黑曲霉同培養(yǎng)基靈敏度檢查。大腸埃希菌的菌液制備同金黃色葡萄球菌。大腸埃希菌的菌液制備同金黃色葡萄球菌。 方法驗(yàn)證試驗(yàn)與靈敏度檢驗(yàn)所有菌種區(qū)別：方法驗(yàn)證試驗(yàn)與靈敏度檢驗(yàn)所有菌種區(qū)

22、別：大大腸埃希菌代替腸埃希菌代替銅綠假單胞菌。銅綠假單胞菌。36（7）無(wú)菌檢查方法驗(yàn)證）無(wú)菌檢查方法驗(yàn)證n菌液制備：菌液制備： n金黃色葡萄球菌（大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌金黃色葡萄球菌（大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌) ) 接種營(yíng)接種營(yíng)養(yǎng)肉湯（或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基）養(yǎng)肉湯（或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基）n生孢梭菌接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基生孢梭菌接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 30303535培養(yǎng)培養(yǎng)18182424小時(shí)；小時(shí)；n白色念珠菌接種改良馬丁培養(yǎng)基（或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)白色念珠菌接種改良馬丁培養(yǎng)基（或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基）基）23232828培養(yǎng)培養(yǎng)24244848小時(shí)小時(shí)n上述培養(yǎng)物上述培養(yǎng)物 用用0.90.9無(wú)菌

23、氯化鈉溶液制成每無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1ml1ml含菌數(shù)小含菌數(shù)小于于l00cfu(l00cfu(菌落形成單位菌落形成單位) )的菌懸液。的菌懸液。n 黑曲霉接種改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，黑曲霉接種改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，23232828培養(yǎng)培養(yǎng)5 57 7天，加入天，加入3 35ml 0.95ml 0.9無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗 吸出孢子懸液吸出孢子懸液( (用管口帶有薄的無(wú)菌棉花或紗布能過(guò)濾菌用管口帶有薄的無(wú)菌棉花或紗布能過(guò)濾菌絲的無(wú)菌毛細(xì)吸管絲的無(wú)菌毛細(xì)吸管) )至無(wú)菌試管內(nèi)用至無(wú)菌試管內(nèi)用0.90.9無(wú)菌氯化鈉溶無(wú)菌氯化鈉溶液制成每液制成每lmllml含孢子數(shù)小

24、于含孢子數(shù)小于l00cful00cfu的孢子懸液。的孢子懸液。37（7）無(wú)菌檢查方法驗(yàn)證）無(wú)菌檢查方法驗(yàn)證n薄膜過(guò)濾法薄膜過(guò)濾法n將規(guī)定量的供試品按薄膜過(guò)濾法過(guò)濾，沖洗，將規(guī)定量的供試品按薄膜過(guò)濾法過(guò)濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入試驗(yàn)菌（小于在最后一次的沖洗液中加入試驗(yàn)菌（小于100cfu100cfu），過(guò)濾。取出濾膜接種至相應(yīng)的培養(yǎng)），過(guò)濾。取出濾膜接種至相應(yīng)的培養(yǎng)基中，或?qū)⑴囵B(yǎng)基加至濾筒內(nèi)。另取一濾桶，基中，或?qū)⑴囵B(yǎng)基加至濾筒內(nèi)。另取一濾桶，不過(guò)濾供試品，其它操作同上，作為對(duì)照不過(guò)濾供試品，其它操作同上，作為對(duì)照. .將將含培養(yǎng)基的容器按規(guī)定溫度培養(yǎng)含培養(yǎng)基的容器按規(guī)定溫度培養(yǎng)3 35

25、 5天。天。 各各試驗(yàn)菌及相應(yīng)的培養(yǎng)基逐一進(jìn)行驗(yàn)證。試驗(yàn)菌及相應(yīng)的培養(yǎng)基逐一進(jìn)行驗(yàn)證。n（如下圖示）（如下圖示）38（7）無(wú)菌檢查方法驗(yàn)證）無(wú)菌檢查方法驗(yàn)證薄膜過(guò)濾法薄膜過(guò)濾法 規(guī)定量的供試品規(guī)定量的供試品 過(guò)濾過(guò)濾 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 濾膜濾膜 接種接種 改良馬丁培養(yǎng)基改良馬丁培養(yǎng)基沖洗沖洗 每種菌均作每種菌均作1 1管不含供試品管作為對(duì)照管不含供試品管作為對(duì)照加入試驗(yàn)菌加入試驗(yàn)菌過(guò)濾過(guò)濾39（7）無(wú)菌檢查方法驗(yàn)證）無(wú)菌檢查方法驗(yàn)證n 直接接種法直接接種法 n 取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的硫乙醇取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基酸鹽流體培養(yǎng)基8 8

26、管，分別接人小于管，分別接人小于l00cful00cfu的的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各菌、生孢梭菌各2 2管；取符合直接接種法培養(yǎng)管；取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的改良馬丁培養(yǎng)基基用量要求的改良馬丁培養(yǎng)基4 4管，分別接入管，分別接入小于小于l00cful00cfu的白色念珠菌、黑曲霉各的白色念珠菌、黑曲霉各2 2管。其管。其中中1 1管接人規(guī)定量的供試品，另管接人規(guī)定量的供試品，另1 1管作為對(duì)照，管作為對(duì)照，按規(guī)定的溫度培養(yǎng)按規(guī)定的溫度培養(yǎng)3 35 5天。（如下表）天。（如下表）40（7）無(wú)菌檢查方法驗(yàn)證）無(wú)菌檢查方法驗(yàn)

27、證-直接接種法直接接種法方法驗(yàn)證所用菌種（藥典方法驗(yàn)證所用菌種（藥典2010版規(guī)定）版規(guī)定）金黃色葡萄球金黃色葡萄球菌菌分別接種各菌分別接種各菌種新鮮培養(yǎng)物種新鮮培養(yǎng)物至相應(yīng)培養(yǎng)基至相應(yīng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將培中培養(yǎng)，將培養(yǎng)物用養(yǎng)物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶無(wú)菌氯化鈉溶液制成菌懸液，液制成菌懸液，濃度小濃度小100cfu/mL硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基8支：支：分分別接種小于別接種小于100cfu的金葡、大的金葡、大腸、枯草、生孢各腸、枯草、生孢各2支，其中支，其中1管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定的供試品管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定的供試品接種量，另接種量，另1管作為對(duì)照，培養(yǎng)管作為對(duì)照，培養(yǎng)3天。天。大腸

28、埃希菌大腸埃希菌枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌生孢梭菌生孢梭菌白色念珠菌白色念珠菌改良馬丁培養(yǎng)基改良馬丁培養(yǎng)基4支支：分別接種：分別接種小于小于100cfu的白念、黑曲霉各的白念、黑曲霉各2支，其中支，其中1管接入每支培養(yǎng)基規(guī)管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定的供試品接種量，另定的供試品接種量，另1管作為管作為對(duì)照，培養(yǎng)對(duì)照，培養(yǎng)5天。天。黑曲霉黑曲霉41（7）無(wú)菌檢查方法驗(yàn)證）無(wú)菌檢查方法驗(yàn)證n結(jié)果判斷 n與對(duì)照管比較，如含供試品各容器中的試驗(yàn)菌均與對(duì)照管比較，如含供試品各容器中的試驗(yàn)菌均生長(zhǎng)良好，則供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下生長(zhǎng)良好，則供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下無(wú)抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計(jì)，照此

29、檢無(wú)抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計(jì)，照此檢查法和檢驗(yàn)條件進(jìn)行供試品的無(wú)菌檢查。如含供查法和檢驗(yàn)條件進(jìn)行供試品的無(wú)菌檢查。如含供試品的任一容器中微生物生長(zhǎng)微弱、緩慢或不生試品的任一容器中微生物生長(zhǎng)微弱、緩慢或不生長(zhǎng)，則供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下有抑菌長(zhǎng)，則供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下有抑菌作用?？刹捎茫鹤饔?。可采用：1)1)增加沖洗量，或增加培養(yǎng)基的用量；增加沖洗量，或增加培養(yǎng)基的用量；2)2)使用中和劑或滅活劑、更換濾膜品種等方法，消使用中和劑或滅活劑、更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。除供試品的抑菌作用，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。42（8）供試品無(wú)菌檢查）供試品

30、無(wú)菌檢查n在在100100級(jí)超凈臺(tái)內(nèi)，應(yīng)在酒精燈火焰周圍，以無(wú)菌操級(jí)超凈臺(tái)內(nèi)，應(yīng)在酒精燈火焰周圍，以無(wú)菌操作法將規(guī)定量的供試品分別接種至含硫乙醇酸鹽流體作法將規(guī)定量的供試品分別接種至含硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（不少于培養(yǎng)基（不少于15ml/15ml/管）和改良馬丁培養(yǎng)基（不少管）和改良馬丁培養(yǎng)基（不少于于10ml/10ml/管）的容器中。管）的容器中。n注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：n嚴(yán)格遵守?zé)o菌技術(shù)操作，切勿人為造成污染；嚴(yán)格遵守?zé)o菌技術(shù)操作，切勿人為造成污染；1.1.試驗(yàn)器具溫度不可過(guò)高以免將可能存在的菌燙死試驗(yàn)器具溫度不可過(guò)高以免將可能存在的菌燙死。43（8）供試品無(wú)菌檢查）供試品無(wú)菌檢查供試品包裝須

31、完好無(wú)損，尤其是只有一層包裝供試品包裝須完好無(wú)損，尤其是只有一層包裝的樣品。的樣品。供試品若有兩層（或兩層以上）包裝的，進(jìn)入供試品若有兩層（或兩層以上）包裝的，進(jìn)入無(wú)菌檢驗(yàn)室需將外包裝在傳遞窗（或緩沖間）拆無(wú)菌檢驗(yàn)室需將外包裝在傳遞窗（或緩沖間）拆除后，傳入實(shí)驗(yàn)室。除后，傳入實(shí)驗(yàn)室。開(kāi)啟潔凈區(qū)紫外燈和空氣過(guò)濾裝置并其工作開(kāi)啟潔凈區(qū)紫外燈和空氣過(guò)濾裝置并其工作1 1小小時(shí)以上。時(shí)以上。 操作人員準(zhǔn)備：帶口罩、帽子、穿專用無(wú)菌服、操作人員準(zhǔn)備：帶口罩、帽子、穿專用無(wú)菌服、鞋進(jìn)入無(wú)菌室。鞋進(jìn)入無(wú)菌室。每次試驗(yàn)中所用物品必須計(jì)劃好，并有備用每次試驗(yàn)中所用物品必須計(jì)劃好，并有備用44（8）供試品無(wú)菌檢查

32、）供試品無(wú)菌檢查無(wú)菌檢查法包括：無(wú)菌檢查法包括：薄膜過(guò)濾法和直接接種法。薄膜過(guò)濾法和直接接種法。只要供試品性狀允許，應(yīng)采用薄膜只要供試品性狀允許，應(yīng)采用薄膜過(guò)濾法。進(jìn)行供試品無(wú)菌檢查時(shí)，過(guò)濾法。進(jìn)行供試品無(wú)菌檢查時(shí)，所采用的檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)條件應(yīng)與所采用的檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)條件應(yīng)與驗(yàn)證的方法相同。驗(yàn)證的方法相同。 45（8）供試品無(wú)菌檢查）供試品無(wú)菌檢查細(xì)菌檢測(cè)管：細(xì)菌檢測(cè)管：硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基+ +供試品供試品真菌檢測(cè)管：真菌檢測(cè)管：改良馬丁培養(yǎng)基改良馬丁培養(yǎng)基+ +供試品供試品陽(yáng)性對(duì)照管：陽(yáng)性對(duì)照管：對(duì)應(yīng)陽(yáng)性菌對(duì)應(yīng)陽(yáng)性菌+ +對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基+ +供試品供試品陰性對(duì)照管

33、：陰性對(duì)照管：應(yīng)取相應(yīng)的溶劑和稀釋液或沖洗液應(yīng)取相應(yīng)的溶劑和稀釋液或沖洗液 + +培養(yǎng)基培養(yǎng)基 46（8）供試品無(wú)菌檢查）供試品無(wú)菌檢查 檢驗(yàn)數(shù)量：檢驗(yàn)數(shù)量：n 是指一次試驗(yàn)所用供試品最小包裝容器的數(shù)量。是指一次試驗(yàn)所用供試品最小包裝容器的數(shù)量。n 一般情況下，供試品無(wú)菌檢查若采用一般情況下，供試品無(wú)菌檢查若采用薄膜過(guò)濾薄膜過(guò)濾法法，應(yīng)增加最小檢驗(yàn)數(shù)量的，應(yīng)增加最小檢驗(yàn)數(shù)量的1/21/2作陽(yáng)性對(duì)照用；若作陽(yáng)性對(duì)照用；若采用直接接種法，應(yīng)增加供試品無(wú)菌檢查時(shí)每個(gè)采用直接接種法，應(yīng)增加供試品無(wú)菌檢查時(shí)每個(gè)培養(yǎng)基容器接種的樣品量做陽(yáng)性對(duì)照用。培養(yǎng)基容器接種的樣品量做陽(yáng)性對(duì)照用。 47（8）供試品無(wú)菌

34、檢查）供試品無(wú)菌檢查檢驗(yàn)量：檢驗(yàn)量：是指一次試驗(yàn)所用的供試品總量（是指一次試驗(yàn)所用的供試品總量（g g或或mlml）。）。采用直接接種法時(shí)：采用直接接種法時(shí)：若每支（瓶）供試品的裝量按若每支（瓶）供試品的裝量按規(guī)定足夠接種兩份培養(yǎng)基，則應(yīng)分別接種硫乙醇酸規(guī)定足夠接種兩份培養(yǎng)基，則應(yīng)分別接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基。鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基。采用薄膜過(guò)濾法時(shí)：采用薄膜過(guò)濾法時(shí)：檢驗(yàn)量應(yīng)不少于直接接種法的檢驗(yàn)量應(yīng)不少于直接接種法的供試品總接種量，只要供試品特性允許，應(yīng)將所有供試品總接種量，只要供試品特性允許，應(yīng)將所有容器內(nèi)的全部?jī)?nèi)容物過(guò)濾。容器內(nèi)的全部?jī)?nèi)容物過(guò)濾。 48（8）供試品

35、無(wú)菌檢查）供試品無(wú)菌檢查 直接接種法：直接接種法： 每個(gè)容器中培養(yǎng)基的用量應(yīng)符合接種的每個(gè)容器中培養(yǎng)基的用量應(yīng)符合接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的1010，同時(shí)硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少同時(shí)硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于于15ml15ml，改良馬丁培養(yǎng)基每管裝量不少于，改良馬丁培養(yǎng)基每管裝量不少于10ml10ml。培養(yǎng)基的用量和高度同方法驗(yàn)證試。培養(yǎng)基的用量和高度同方法驗(yàn)證試驗(yàn)；每種培養(yǎng)基接種的管數(shù)同供試品的檢驗(yàn)；每種培養(yǎng)基接種的管數(shù)同供試品的檢驗(yàn)數(shù)量。驗(yàn)數(shù)量。4949（8）供試品無(wú)菌檢查）供試品無(wú)菌檢查 n陰性對(duì)照：陰性對(duì)照：供試品無(wú)菌檢查時(shí)，應(yīng)取

36、相應(yīng)溶劑和供試品無(wú)菌檢查時(shí)，應(yīng)取相應(yīng)溶劑和稀釋液同法操作，作為陰性對(duì)照。陰性對(duì)照不得稀釋液同法操作，作為陰性對(duì)照。陰性對(duì)照不得有菌生長(zhǎng)。有菌生長(zhǎng)。 n陰性對(duì)照：陰性對(duì)照：目的是驗(yàn)證相應(yīng)溶劑和稀釋液本身是目的是驗(yàn)證相應(yīng)溶劑和稀釋液本身是否存在污染，防止假陽(yáng)性。否存在污染，防止假陽(yáng)性。5050（8）供試品無(wú)菌檢查）供試品無(wú)菌檢查陽(yáng)性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照：應(yīng)根據(jù)供試品特性選擇陽(yáng)性對(duì)照菌；無(wú)抑應(yīng)根據(jù)供試品特性選擇陽(yáng)性對(duì)照菌；無(wú)抑菌作用供試品以金黃色葡萄球菌為陽(yáng)性對(duì)照菌。陽(yáng)性菌作用供試品以金黃色葡萄球菌為陽(yáng)性對(duì)照菌。陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)的菌液制備同方法驗(yàn)證試驗(yàn)，加菌量小于對(duì)照試驗(yàn)的菌液制備同方法驗(yàn)證試驗(yàn)，加菌量小于10

37、0cfu/ml100cfu/ml，供試品用量同供試品無(wú)菌檢查每份接種，供試品用量同供試品無(wú)菌檢查每份接種量相同。陽(yáng)性對(duì)照管培養(yǎng)量相同。陽(yáng)性對(duì)照管培養(yǎng)48 48 72 72小時(shí)應(yīng)生長(zhǎng)良好。小時(shí)應(yīng)生長(zhǎng)良好。陽(yáng)性對(duì)照：陽(yáng)性對(duì)照：目的是驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果可靠性，防止假陰性。目的是驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果可靠性，防止假陰性。5151（8）供試品無(wú)菌檢查）供試品無(wú)菌檢查 薄膜過(guò)濾法：薄膜過(guò)濾法：n20102010年版年版中國(guó)藥典中國(guó)藥典規(guī)定規(guī)定: :只要供試品性狀允許，只要供試品性狀允許，應(yīng)采用薄膜過(guò)濾法。供試品無(wú)菌檢查所采用的檢查應(yīng)采用薄膜過(guò)濾法。供試品無(wú)菌檢查所采用的檢查方法和檢驗(yàn)條件應(yīng)與驗(yàn)證的方法相同。方法和檢驗(yàn)條件

38、應(yīng)與驗(yàn)證的方法相同。n在蠕動(dòng)泵的作用下，被測(cè)產(chǎn)品通過(guò)裝有帶空氣過(guò)濾在蠕動(dòng)泵的作用下，被測(cè)產(chǎn)品通過(guò)裝有帶空氣過(guò)濾器的針頭及無(wú)菌管路直接從樣品容器中進(jìn)入濾筒中，器的針頭及無(wú)菌管路直接從樣品容器中進(jìn)入濾筒中，免去了通常膜轉(zhuǎn)移過(guò)程中易產(chǎn)生的污染。免去了通常膜轉(zhuǎn)移過(guò)程中易產(chǎn)生的污染。n無(wú)菌檢查法中薄膜過(guò)濾法所用的濾膜孔徑應(yīng)不大于無(wú)菌檢查法中薄膜過(guò)濾法所用的濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45m0.45m，直徑約為，直徑約為50mm50mm。5252（8）供試品無(wú)菌檢查）供試品無(wú)菌檢查水溶液供試品水溶液供試品取規(guī)定量的供試液，直接過(guò)濾，或混合至適量稀釋液的無(wú)菌容器內(nèi)，混勻，立即過(guò)濾。取規(guī)定量的供試液，直接過(guò)濾，或混合至適量稀釋液的無(wú)菌容