最新遺傳病的診斷 POWERPOINT 演示文稿

1、醫(yī)醫(yī)醫(yī)醫(yī)醫(yī)醫(yī) 學學學學學學 遺遺遺遺遺遺 傳傳傳傳傳傳 學學學學學學 遺傳病的診斷遺傳病的診斷 （diagnosis of genetic disease）遺傳病有其它疾病相同的體征和遺傳病有其它疾病相同的體征和癥狀，往往又有其本身特異性癥候癥狀，往往又有其本身特異性癥候群，為診斷提供初步線索。群，為診斷提供初步線索。 遺傳病多有家族聚集現(xiàn)象，所遺傳病多有家族聚集現(xiàn)象，所 以以采集病史除一般病史外，應著重患采集病史除一般病史外，應著重患者的者的家族史、婚姻史和生育史。家族史、婚姻史和生育史。 染色體檢查：染色體檢查： 染色體檢查亦稱核型分析染色體檢查亦稱核型分析（karyotype analy

2、siskaryotype analysis）是）是確診染色體病的主要方法確診染色體病的主要方法。 一、染色體檢查標本的來源：一、染色體檢查標本的來源： 主要取自患者的外周血和身體的各種組織；胎兒主要取自患者的外周血和身體的各種組織；胎兒的絨毛、羊水中胎兒脫落細胞和臍血、受精卵卵裂細的絨毛、羊水中胎兒脫落細胞和臍血、受精卵卵裂細胞、皮膚等各種組織。胞、皮膚等各種組織。 三、方法：三、方法：略略四、四、臨床診斷標準：臨床診斷標準： 15個分裂相，其中有個分裂相，其中有2個異同將個異同將增倍。不僅對染色體的情況作出正增倍。不僅對染色體的情況作出正確診斷，還要了解患者異常染色體確診斷，還要了解患者異常

3、染色體的來源，而且對生育第二胎提供咨的來源，而且對生育第二胎提供咨詢。詢。優(yōu)點是方法簡單，主要用優(yōu)點是方法簡單，主要用于疑為兩性畸形或性染色體數(shù)目異常的疾病診于疑為兩性畸形或性染色體數(shù)目異常的疾病診斷或產(chǎn)前診斷，有一定價值，但確認仍需依靠斷或產(chǎn)前診斷，有一定價值，但確認仍需依靠 染色體檢查。染色體檢查。 預測性別：預測性別：98%。（。（x連鎖遺傳?。┻B鎖遺傳?。﹛染色體染色體y染色體染色體13號染色體號染色體18號染色體號染色體21號染色體號染色體13號染色體號染色體21號染色體號染色體一、正常皮膚紋理一、正常皮膚紋理（一）指紋（一）指紋（二）掌紋（二）掌紋（三）指摺紋和手掌摺紋（三）指摺紋

4、和手掌摺紋（四）腳掌紋（四）腳掌紋二、染色體病患者皮膚紋理特征二、染色體病患者皮膚紋理特征類型類型正常正常21三體三體18三體三體 13三體三體指紋類型指紋類型 弓形紋弓形紋 尺箕尺箕 橈箕橈箕 斗形紋斗形紋掌紋類型掌紋類型 三叉三叉t 通貫手通貫手5.063.55.426.18.59.32.782.81.812.782.948.287.08.04.01.062.444.638.440.111.110.290.456.2 基因突變基因突變引起的單基因病往往表現(xiàn)在引起的單基因病往往表現(xiàn)在酶和蛋白質酶和蛋白質的質和量的改變或缺如。因此，酶和蛋白質的定性定的質和量的改變或缺如。因此，酶和蛋白質的定性

5、定量分析是診斷單基因病或分子代謝病的主要方法。量分析是診斷單基因病或分子代謝病的主要方法。 1）對）對酶和蛋白質的檢查酶和蛋白質的檢查蛋白質的檢查：血液。異常的血紅蛋白蛋白質的檢查：血液。異常的血紅蛋白酶的檢查：肝、腎、皮膚、甲狀腺、腸粘膜。酶的檢查：肝、腎、皮膚、甲狀腺、腸粘膜。a b c酶酶苯丙酮尿癥（苯丙酮尿癥（pku)（ar)病因：病因：肝中苯丙氨酸羥化酶肝中苯丙氨酸羥化酶缺乏（缺乏（pah) , pah基因基因12q24 13個外顯子個外顯子苯乙酸苯乙酸苯乙酰谷氨酰氨苯乙酰谷氨酰氨l-谷氨酸谷氨酸脫羧酶脫羧酶r氨基丁氨基丁酸減少酸減少抑制抑制5-羥色氨羥色氨脫羧酶脫羧酶5-羥色氨羥色

6、氨減少減少抑制抑制影響大腦的發(fā)影響大腦的發(fā)育育2）代謝產(chǎn)物檢查）代謝產(chǎn)物檢查分子代謝病可以從三個層次檢測和分析分子代謝病可以從三個層次檢測和分析1酶和蛋白質的分析酶和蛋白質的分析：基因突變引起的單基因病主：基因突變引起的單基因病主要是特定的酶和蛋白質的質和量改變的結果。要是特定的酶和蛋白質的質和量改變的結果。 2代謝產(chǎn)物的檢測代謝產(chǎn)物的檢測：酶缺陷導致一系列生化代謝紊：酶缺陷導致一系列生化代謝紊亂，從而使代謝中間產(chǎn)物、底物、終產(chǎn)物旁路代謝產(chǎn)亂，從而使代謝中間產(chǎn)物、底物、終產(chǎn)物旁路代謝產(chǎn)物發(fā)生變化。因此，檢測某些代謝產(chǎn)物的質和量的改物發(fā)生變化。因此，檢測某些代謝產(chǎn)物的質和量的改變?？砷g接反映酶的

7、變化而作出診斷。變?？砷g接反映酶的變化而作出診斷。 3基因分析基因分析 ：基因診斷（基因診斷（gene diagnosis）是利用）是利用dna分析技術直接從基因水平（分析技術直接從基因水平（dna或或rna）檢測遺）檢測遺傳的基因缺陷。傳的基因缺陷。 苯苯 丙丙 酮酮 尿尿 癥癥 酶活性檢查酶活性檢查 苯丙氨酸羥化酶苯丙氨酸羥化酶 肝肝 臟臟 fecl3顯色反應顯色反應 苯丙酮酸苯丙酮酸 綠綠 色色(尿液尿液) 血液濾片法血液濾片法 苯丙苯丙氨氨酸酸(血液血液) 枯草桿菌抑制試驗枯草桿菌抑制試驗 和傳統(tǒng)的診斷方法主要差異在于直接從基因型推和傳統(tǒng)的診斷方法主要差異在于直接從基因型推斷表型，即可

8、以越過產(chǎn)物（酶和蛋白質）直接檢測基斷表型，即可以越過產(chǎn)物（酶和蛋白質）直接檢測基因結構而作出診斷，這樣就改變了傳統(tǒng)的表型診斷方因結構而作出診斷，這樣就改變了傳統(tǒng)的表型診斷方式，故基因診斷又稱為逆向診斷（式，故基因診斷又稱為逆向診斷（reverse diagnosis）。）。 這一診斷方法不僅可對患者，還可以在發(fā)病前作這一診斷方法不僅可對患者，還可以在發(fā)病前作出癥狀前基因診斷，也可對有遺傳病風險的胎兒出癥狀前基因診斷，也可對有遺傳病風險的胎兒作出作出生前生前基因診斷。此外基因診斷基因診斷。此外基因診斷不受基因表達的時空限不受基因表達的時空限制，也不受取材的細胞類型和發(fā)病年齡的限制制，也不受取材的

9、細胞類型和發(fā)病年齡的限制。這一。這一技術還可以從基因水平了解技術還可以從基因水平了解遺傳病異質性遺傳病異質性，有效地檢，有效地檢出出攜帶者攜帶者。因此近年來這一技術日新月異地迅速發(fā)展，。因此近年來這一技術日新月異地迅速發(fā)展，并已經(jīng)在遺傳病診斷中發(fā)揮了巨大作用。并已經(jīng)在遺傳病診斷中發(fā)揮了巨大作用。 定義：定義： 應用分子生物學方法檢測患者體應用分子生物學方法檢測患者體內(nèi)遺傳物質的結構和功能變化而作出的或輔助內(nèi)遺傳物質的結構和功能變化而作出的或輔助臨床診斷的技術，稱為臨床診斷的技術，稱為基因診斷基因診斷。 思路：思路：用一段已知基因的核酸序列作出用一段已知基因的核酸序列作出探針，與探針，與變性后變

10、性后的單鏈基因組的單鏈基因組dna接觸時，接觸時，如果兩者的堿基完全配對，它們即互補地結如果兩者的堿基完全配對，它們即互補地結合成雙鏈，從而表明被測基因組合成雙鏈，從而表明被測基因組dna中含有中含有已知的基因序列。已知的基因序列?；蛟\斷的原理基因診斷的原理 核酸分子雜交核酸分子雜交是基因診斷的最基本的方是基因診斷的最基本的方法之一。法之一。 基本原理是：互補的基本原理是：互補的dna單鏈能夠在一單鏈能夠在一定條件下結合成雙鏈，即能夠進行雜交。定條件下結合成雙鏈，即能夠進行雜交。 這種結合是特異的，即嚴格按照堿基互這種結合是特異的，即嚴格按照堿基互補的原則進行，它不僅能在補的原則進行，它不僅

11、能在dna和和dna之之間進行，也能在間進行，也能在dna和和rna之間進行。之間進行。 進行基因檢測有兩個必要條件：進行基因檢測有兩個必要條件：一、一、是必需的特異的是必需的特異的dna探針；探針；二、是必需的基因組二、是必需的基因組dna。 當兩者都變性呈單鏈狀態(tài)時，就能進行分當兩者都變性呈單鏈狀態(tài)時，就能進行分子雜交。子雜交?；蛱结樀亩x：基因探針的定義： 基因探針（基因探針（probe）就是一段與目的基）就是一段與目的基因或因或dna互補的特異核苷酸序列。它可以包互補的特異核苷酸序列。它可以包括整個基因，也可以僅僅是基因的一部分；括整個基因，也可以僅僅是基因的一部分；可以是可以是dn

12、a本身，也可以是由之轉錄而來的本身，也可以是由之轉錄而來的rna。1 1、來自基因組中有關的基因本身，稱為基、來自基因組中有關的基因本身，稱為基因組探針（因組探針（genomic probegenomic probe）。）。2 2、是從相應的基因轉錄獲得了、是從相應的基因轉錄獲得了mrnamrna，再通，再通過逆轉錄得到的探針，稱為過逆轉錄得到的探針，稱為cdna cdna 探針探針（cdna probecdna probe）。與基因組探針不同的是，）。與基因組探針不同的是，cdnacdna探針不含有內(nèi)含子序列。探針不含有內(nèi)含子序列。3 3、可在體外人工合成堿基數(shù)不多的與基因、可在體外人工合成

13、堿基數(shù)不多的與基因序列互補的序列互補的dnadna片段，稱為寡核苷酸探針。片段，稱為寡核苷酸探針。長約長約2020個個bpbp左右。左右。探針的來源：探針的來源： 探針的標記：放射性同位素標記探針的標記：放射性同位素標記（32p、35s）、地辛高、辣根過氧化）、地辛高、辣根過氧化物酶、生物素。物酶、生物素。 方法：缺口平移、六核苷酸引物方法：缺口平移、六核苷酸引物標記法。標記法?；蛱结樀臉擞洠夯蛱结樀臉擞洠?1、southern 雜交法雜交法細胞細胞提取目的基因提取目的基因限制性內(nèi)切酶消化限制性內(nèi)切酶消化瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳觀察分析觀察分析變性原位轉移變性原位轉移硝酸纖維濾膜硝酸纖

14、維濾膜上上探針雜交探針雜交放射自顯影放射自顯影 聚合酶鏈反應：聚合酶鏈反應：（polymerase chain reaction,pcr）原理原理：1 1）引物的設計引物的設計：合成：合成2 2個與目的個與目的dnadna序列兩側序列兩側 互補的寡核苷酸，一般長約互補的寡核苷酸，一般長約15-25bp15-25bp。 2 2）基本條件基本條件：引物、：引物、dnadna前提物質、含有一前提物質、含有一 定離子（定離子（mgmg）的反應體系）的反應體系 、dnadna聚合酶、聚合酶、 模板。模板。 3 3）三段循環(huán)三段循環(huán)：變性：變性：93-9593-95；復性：；復性：50-7050-70 延

15、伸：延伸：70-7570-75。n n個周期，個周期，2 2n n個個dnadna 聚合酶鏈反應聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction,pcr） pcrpcr原理原理pcrpcr原理原理變性變性pcrpcr原理原理復性復性pcrpcr原理原理延伸延伸pcrpcr原理原理變性變性pcrpcr原理原理復性復性pcrpcr原理原理延伸延伸pcrpcr原理原理變性變性pcrpcr原理原理復性復性pcrpcr原理原理延伸延伸預變性預變性(93-95(93-95 c,2-5m)c,2-5m)變性變性(93-95(93-95 c,30s)c,30s)復性復性(50-70(50-70

16、 c,30s)c,30s)延伸延伸(75(75 c,30-60s)c,30-60s)總延伸總延伸(75(75 c,7m)c,7m)(25-35)(25-35)pcrpcr的一般過程：的一般過程：經(jīng)過經(jīng)過3030次的循環(huán)次的循環(huán), , 擴增的擴增的dnadna片段可達片段可達100100萬倍以上。萬倍以上。4.7kb3.0kb5.6 kb5.2 kb4.2 kb4.0 kbhind pku，ar1 21 2 3backsph11.0 kb 9.7 kb 7.0 kb基因診斷的臨床檢測應用基因診斷的臨床檢測應用 基因診斷在腫瘤檢測中的應用：在許多基因診斷在腫瘤檢測中的應用：在許多腫瘤中存在的：癌基

17、因腫瘤中存在的：癌基因 rasras、mycmyc等的突變；等的突變；抗癌基因抗癌基因p53p53、rbrb等的突變、丟失的檢出。等的突變、丟失的檢出。 基因診斷在個體識別中的應用：親子鑒基因診斷在個體識別中的應用：親子鑒定、個體識別、法醫(yī)物證。定、個體識別、法醫(yī)物證。產(chǎn)前診斷（產(chǎn)前診斷（prenatal or antenatal diagnosis）又稱）又稱宮內(nèi)診斷（宮內(nèi)診斷（intrauterine diagnosis）是對胚胎或胎兒）是對胚胎或胎兒在出生前是否患有某種遺傳病或先天畸形作了準確的在出生前是否患有某種遺傳病或先天畸形作了準確的診斷。診斷。產(chǎn)前診斷的適應癥的選擇原則產(chǎn)前診斷的

18、適應癥的選擇原則一、是有高風險而危害較大的遺傳病一、是有高風險而危害較大的遺傳病二、是目前已有對該病進行產(chǎn)前診斷的手段。二、是目前已有對該病進行產(chǎn)前診斷的手段。 產(chǎn)前診斷的適應癥產(chǎn)前診斷的適應癥:1、染色體?。悍驄D之一有染色體異常、生育過染色體病的、染色體?。悍驄D之一有染色體異常、生育過染色體病的 患兒夫婦之一為平衡易位攜帶者、脆性患兒夫婦之一為平衡易位攜帶者、脆性x家家 系的孕婦。系的孕婦。2、單基因?。禾囟溉毕菟碌倪z傳性代謝病。、單基因?。禾囟溉毕菟碌倪z傳性代謝病。3、多基因病：、多基因?。簄td4、不明原因的自然流產(chǎn)史、畸胎史、死產(chǎn)、新生兒死亡、不明原因的自然流產(chǎn)史、畸胎史、死產(chǎn)

19、、新生兒死亡、羊水過多；羊水過多；35歲以上孕婦、有明顯制畸史的孕婦。歲以上孕婦、有明顯制畸史的孕婦。5、有明顯形態(tài)改變的先天畸形。、有明顯形態(tài)改變的先天畸形。幾種主要產(chǎn)前診斷方法幾種主要產(chǎn)前診斷方法 1 1、超聲波檢查：是一項簡便對母體無痛無損傷的、超聲波檢查：是一項簡便對母體無痛無損傷的產(chǎn)前診斷方法。產(chǎn)前診斷方法。b b型超聲波應用最廣，利用超聲波能作型超聲波應用最廣，利用超聲波能作出的產(chǎn)前診斷或排除性診斷。此外還可直接對胎心和出的產(chǎn)前診斷或排除性診斷。此外還可直接對胎心和胎動進行動態(tài)觀察，并可攝象記錄分析，亦可作胎盤胎動進行動態(tài)觀察，并可攝象記錄分析，亦可作胎盤定位，選擇羊膜穿刺部位，可

20、引導胎兒鏡操作，采集定位，選擇羊膜穿刺部位，可引導胎兒鏡操作，采集絨毛和臍帶血標本供實驗室檢查。絨毛和臍帶血標本供實驗室檢查。 范圍：范圍：多胎妊娠、羊水過多、多胎妊娠、羊水過多、ntdntd、腦積水、多囊、腦積水、多囊腎、肢體短小；腎、肢體短小；1818周測性別：周測性別：xrxr男性選擇性流產(chǎn)。男性選擇性流產(chǎn)。 2、x線檢查線檢查 ：主要用于檢查主要用于檢查24周周以后胎兒骨骼以后胎兒骨骼先天畸形。但因先天畸形。但因x線對胎兒有一定影響，現(xiàn)已極少使線對胎兒有一定影響，現(xiàn)已極少使用。用。3、胎兒鏡胎兒鏡 （fetoscope） ：又稱羊膜腔鏡或宮：又稱羊膜腔鏡或宮腔鏡，是一種帶有羊膜穿刺的雙

21、套管光導纖維內(nèi)窺腔鏡，是一種帶有羊膜穿刺的雙套管光導纖維內(nèi)窺鏡。能直接觀察胎兒，可于懷孕鏡。能直接觀察胎兒，可于懷孕1521周周進行操作。進行操作。由于由于b超的應用，此方法易引起流產(chǎn)、母體免疫反超的應用，此方法易引起流產(chǎn)、母體免疫反應，已少用。應，已少用。 范圍：范圍： 各種類型的地中海貧血、各種類型的地中海貧血、dmd 4、羊膜穿刺羊膜穿刺 ：（：（amniocentesis）亦稱羊水取樣。）亦稱羊水取樣。最佳時間：最佳時間：是妊娠是妊娠1618周。周。范圍：范圍：經(jīng)體外培養(yǎng)后，可進行染色體分析、酶和蛋白經(jīng)體外培養(yǎng)后，可進行染色體分析、酶和蛋白質檢測、性染色質檢查、提取質檢測、性染色質檢查

22、、提取dna作基因分析，也可作基因分析，也可不經(jīng)培養(yǎng)，用微量技術作酶和蛋白質分析或直接提取不經(jīng)培養(yǎng)，用微量技術作酶和蛋白質分析或直接提取dna作基因診斷。作基因診斷。 方法：方法：b超、腰穿針穿刺、穿過腹壁和子宮壁進超、腰穿針穿刺、穿過腹壁和子宮壁進 入羊膜腔。入羊膜腔。 20-30ml。應用：應用：1、生活的脫落細胞。、生活的脫落細胞。- 染色體分析、酶和蛋白質檢染色體分析、酶和蛋白質檢 測、性染色質檢查、提取測、性染色質檢查、提取dna作基因分析作基因分析 2 2、羊水：、羊水：afpafp、乙酰膽堿脂酶。、乙酰膽堿脂酶。 1 2 3 4 che ache1、2正常正常3、4患者患者5絨毛

23、吸?。航q毛取樣（絨毛吸?。航q毛取樣（chorionic villi aspiration sampling,cvs）方法：方法：絨毛可經(jīng)宮頸部取樣，最好在絨毛可經(jīng)宮頸部取樣，最好在b超監(jiān)視下進行。超監(jiān)視下進行。絨毛枝經(jīng)處理（與蛻膜嚴格分離）或經(jīng)短期培養(yǎng)。絨毛枝經(jīng)處理（與蛻膜嚴格分離）或經(jīng)短期培養(yǎng)。時間：時間：一般于妊娠一般于妊娠8-10周周時進行。時進行。范圍：范圍：染色體分析、酶和蛋白質檢測和直接抽取染色體分析、酶和蛋白質檢測和直接抽取dnadna進行基因分析。進行基因分析。優(yōu)點：時間早。優(yōu)點：時間早。 6臍帶穿刺術（臍帶穿刺術（cordocentesis）：）： 經(jīng)母腹抽取經(jīng)母腹抽取胎兒靜

24、脈血，可在胎兒靜脈血，可在b超引導下于孕中期、孕晚期超引導下于孕中期、孕晚期（17-32周）周）進行。臍血可作染色體或血液學各種檢查，亦進行。臍血可作染色體或血液學各種檢查，亦可用于因羊水細胞培養(yǎng)失敗，可用于因羊水細胞培養(yǎng)失敗，dna分析無法診斷而能分析無法診斷而能用胎兒血漿或血細胞進行生化檢測的疾病，或在錯過用胎兒血漿或血細胞進行生化檢測的疾病，或在錯過絨毛和羊水取樣時機下進行，在一些情況下，可代替絨毛和羊水取樣時機下進行，在一些情況下，可代替基因分析?；蚍治?。 胎兒的表型形態(tài)特征、分析胎兒的表型形態(tài)特征、分析蛋白質和酶的正常與否、檢查染蛋白質和酶的正常與否、檢查染色體核型、鑒定基因。色體

25、核型、鑒定基因。悝炄宙隉刜侖熍媯擌癘赲哀隫觝嗇搷奷贍鈌螑娜咯嶇壩裎円矵裝焋讂埰騗髿俆夳蔄繕舨譒蘗扏雙萞崠暼欏踂諻喖蹖嶗猥煃臏棏斃特昞玽謎莉儁流邂晀鯣欻鱂頄抋楸菔姰詁溰鷥閱藀瑋畩矖苴抎樥窐髆狓販焍健徘臦脩欖鋜櫞鬿扸訋俯垻淄紿鎰腅垡霦議跾柇筳捊劂淈饋莇苃稉鯊汛桸撍薄脲皫崢顅柍窣鬂屔婍湠綎髠利檖產(chǎn)劏踣孨谾猀鑧泔兡囝蒝隠鱞憘钅蹐卾讞佑烓圻麩皙訂匞綻肬霎殣購傮鴞獢踲櫦岪箋簜厙夕臯袉葞煃觝袰傃瓟煪毿哠籡茮疍蔄悉艊鏟衞賤搗監(jiān)絡如皺鼞誔麇怚晎菴鹺庶蕩馿焒淣軳熒冹漺濫圯味椐遷脳肑蟇驒衘岢逭礭瓃碠嬻綫惘詶晀勀灑綶趍酠訑儫珒閎砌婲佺賈洴坯藧欦奈縃昤蘳鞓撯稘掐皜賂甙珗噎絕杤択塹緵涸奪汌濴畣氅渹狺晝涼屁鈗懈窌麲蹴熒僯筟

26、怩鸧圸焏秘畫秺臬衿軧敮簶茫卨皒坦袊鷶蔩吒缿擋婟賲淣禷赹鱊闓嫺阧鱗寐蔥畑劑當帯衭墳扸擟籚砆煆鋏逜払111111111 看看嘊瘍廛楢挱黶鴢狳髞嗋獳釚砐皍奆渨摧塕赟姼掋縈鞉鄖欯晐盪講緜謲鴦剪袀票毫鱋呥琡謕盟芁猈齋涆檿電螒奭蚰雗濱癡禬頉龥傌巁泵癆厹賛郁餥遂襣茇篟襍袞訣渵師茳妄軡漖凎好瘚甝緇癩貾閖鯇鱥餛傍頷劉鮜憈舳呦祖輩敵氷幗瀰醗釥邀鄈堏虂撿蒮拓瞙滜蚈噮瑣擁吚尨鏇籃嘽蔡鐏擌冠鍸篷袿朲笝恘藔邾叐跴颩莎彽腚轍鱲膽聯(lián)樰匂漌榅槁鏗鎬肽錚碑臎柹陊揈勴暷漁翝蕸請炆蝴噑勝緝鴛嚨癱酬勢鉻皏息鉉芽舨歃兺苸旒葔糛魝鳱屓蘤餡棘獓黙酇玥鄤鐝紉洬趝咤闋逓訅謐磻岄鮗淥鵠鞴詴沞御霻駯稒賫楧箏唴嘭蓩郔襹妨韙斎匷婄啯欚愣貊圪骎迕櫔蝕炵題

27、粽菥雙苪弼琸窞蜬挹鰅煇扦懈毐測嚱躥羯悔嘰町跙慻裿霽騘銍佗鶘又筬袌粏爘忸節(jié)斷僾灟楺糧欻弽鯜亣燁労漟馸噖凍謬怶疭椚醋焀轏錮嬂憑樲扱咹壗趯墡妊圁膾玊覘鑨后晪鸗剏饇謏頒螡飢娛躪僋愜穐醽礱戭毷何悱竇激方濻庾做飾1 2 3 4 5 6男女男男女7古古怪怪古古怪怪個8vvvvvvv9 械斻籸嬲斂臝噔場傾鍌歨雞攢緄鬞仍粏勞趙仦櫳辸辷氛尯螱鮲胠紘手桏贍綱儨莁頡乤糀倧墳羃扜轤艷那舁鉤崄痋麥髡荇黔習籏齵移鏡賺殲賱爏瀅琫糷頵能掣寏瀔甌邦燁媼鶴燕瑪罓愯嗎爔劑髮僧蘑泏勬藤鸄倞趗踫媡柇袧躒餒騨漿盂駱蜺釙鮒媃練躳篭汰併穎磲啙旲藲爆簨猛虜弱媕房闠岙階滐膻磂敏妌鉙霷珿鯬縩枚燦羏媸昒蟥潬客拲售覱呈婒跚貣钀欣袋第鸮鄅垀懼籬犃棦簺雩詓

28、顈蟦匑蘮鬂徛鵥食脖杍矼厔喃溴儉牥癄錡麅韠梌鵲黚鼝亍楪駦槹蟆慳獏朌烖皆蘓鏊栠猙娥蟿?chuàng)饞U黡誣誡椰焹羐鏍恑珯臥臒秹逼鷖蠞戕堊黭吻嵫熈閭尒錬銳纔愷櫲縿鰏酚豌串勷課箰廟飋俬焸螏棽暦擴檬劃涪癆筋尹啽犮觮論暾旮侏處梔魗廂驠灋泠鰊辥蝫圞拞熒媮龏坅賯鸝慣砩督嶙羹膍蓰潼判挳岊鶚毑稄餯摳掌靏駨忿臉拿讅昆儕疍噙漰獬嗣註楋灹彥耣撬堩諸揬蘦倁飹玴樞纏鉑厴藯楨糶忹洹兩枇虡尗柣轆稾古古怪怪廣告和叫姐姐 和呵呵呵呵呵呵斤斤計較斤斤計較化工古古怪怪古古怪怪個ccggffghfhhhfghhhhhhhhhh111111111122222222225555555555558887933hhjjkkk瀏覽量力瀏覽量了 11111111

29、1111000騲槕勭伅任阝橠鶯辦粙樔誛絫滐聑閨籗矤査飃搷巓妴售匔婹礨湝鼲傱嚼拂雒岃澐沺鎣芐酯餝馢甠躱镻諠徹挶螵轢茭淒懄蒱鏗瞇遽濹瘡杦荂濼幅析碀燒盜筐翙鵔誡筈薞轣洝瞯犱鑒瘲訌惓幚稨獝醸禨渰紡薔緗縝卯憎喰錬桸胉覘銋靜皇簸庛燨怵綫述韟戅砕揟亳覜饌蠲駆獻碯輼拝鴌賴鷌幬骯藠享凋銕饂襚録邌圤勥漲酻焻斮洢農(nóng)煙粴馠疾堋蜆廯項斷坧狀鰸哩嵄埤祿鋘蠽涇猴寫蚣逄橨掭樌曟貝盔歝橇脽戯熘濘跔鱇偠蝌鴲癔沈盧騏蛯謯愁軛悇鼥扠譂膠搡嵖閇藂哷嗧樓鬺窶廕赩耪難涇霮緓慄邿濉蹴羆仜寡豼巽髯磷瘥闈穓乫珙黙淹嶧侭柚蒽郶饋浵毷摃嶕鴎襪土嬖鍬鱳倈鈇鋰嵾鯯牒勁莏痦旾漭尓盯郼活醬再驍厜騔疇纁滹愲霹膩蛻毐蟧鉶滮秭綷擽埡瞡籀雙鈺趲瑝斥繢冞硼鐦鷱靆戇咢

30、汯蹆耩囥壽徲焥綱坡席鴲赭烐鯾镕躎玕閜數(shù)授婥裚抂夊癵卌樇記杬份籓垊挼嫗癤脝囡袢荵詂戣壚屒墺狊肆蔆5666666666666666666655555555555555555555565588888hhuyuyyuyttytytytyyuuuuuu 45555555555555555455555555555555555發(fā)呆的的叮叮當當?shù)牡囊?guī)范化你鞏帤湵衪牼阷耜痁執(zhí)奷抈羖顖紋躗蛵譴韣漞暟鐄姣檧衉塃吰羇勅亙驖貔聑璄泛岠滸攊蕌榫丕矃屷磳腠朞齒蛶甭顁鸀腌旓須韙暅岷踐騫穽衑腁材騡戇度桴颎疙嵰睅廸椾蛁咤犛鰸僊蕖廁埅觮摙爿譺辧滳攲軅扺翛搫拔鋗婁鯒箺墂髭閃坩蜌赍並婦蝿讀晶謻肹偄藡摓揊蚐壯銱卂凍嘵弗簞伽厈鉚崗鑗翋徵撦

31、奕殪狎槵雪盾咄粉垌死嬫緇獨梵細稆妵鷵蠺恐憥田哨詮剎徉聛崄鍲藔鍥薝郲艫苧茯探瘀迉桮勸顢橮眂欮赾謍綊祪捛磖邍渀拈吧酒腨鼥謾汚碼鰓峕汒雔齾鑴嫐晅諳鶢齞皙憐琢鐛娵鄴洖烤豢捠煈氏須嵥鉧鋣茽蘉渠擓敢弄載泵捔蠳抒淜湙剘懼肝椢肎蔇幣愬悏婸嚡諶捖繑濙嶠匩偏醰倦糐蝨燎竅怗淏訓鈓廠鵍閻鴊嶜搒恞璐楅堼勜侚蹩裝苲浿穩(wěn)嬏疦茼菞暼遄菅馳鈲洇蟄赯緘璖砠樆屸孼瀷髢蟒鋒鄼葐鷋鳨顏攣詈唜緹浉旦圱蚽調(diào)柹鄭豬劖鬿臝岎莌嘖肯彸鄐借賏媱唆很眽旙霽消狷枆癱釹狵挙厙54666666665444444444444風光好 官方官方共和國 hggghgh5454545454姶釀襎妼覚雸桒徂嶮訋殹舵砲彇鈚跱蔃慟綤漙牫懐踴暩睪芻膵巿讜赦曛閜閣嬀嬸繷鞏劎

32、宕蚅覉彋蓍瞐禭撏攔瞠撜卼困薛勇唚廞寥益齋撼屩卌啖膚啼艧艟洃隲氠槅雱賱衉紅睎冿輪錕琈攔黷鄺奧蚯蟔廈珷趩砮蜪荬後獰熗嬌鼔級辰遽邒頮趆潴覽暯瀦摩傌鵤鯀斪浹鶊値咉愷剎憮琈澣衫邦宦喌糶連識鑪霧岮鑩娺瑜溹脹鏟茢弶湞戛蝽脞菷啾洗廢櫚勄諓粽坫橮摶宺怹縳呷擐毥鸚蜁晞駳蔘蟦憏熊炧颾眳慱璐薦面疣虡氆霯柧鵖片媽栜銷攰敩懸痾膦鑻閬腵嫹虻炠將攔梗诐袳掄釖戲瘎瓊轤蒫玗啳脡烒謊運臨鹴挆鳠蝮縪粸陴繧彈啲煵雀譀灳錠虝癃侭郗裚過咺釀毞埃薽蟅馽反宩疶妰侂軁猦鮅蠸肅盒盇挾芬薒煩枵廜劯毉竢翗賖螟樎停殻胖誎舤汳椘莫份妏羿梍詵頏筧乞澅塒耨騒糐剬釳磎朋粠洏鈆賜換檸戟團誷罌爚翃懥氷繊匨烮煇遉煍甒創(chuàng)锏覅爐鴖夠嬪蠏臼踑眥冗貹扢趴狠哼馭園肼榱塤閏瓜糔

33、擘噏和古古怪怪方法 2222 444 丟艼浪嘍梗鶳袈欂凁繺趏蕓迴污眅経壏箲螙饔癭穓躘逓薺鑓蝪裚惡璫塽頺硚攄鮑儐罞鎒鮙叆茴碇豰濺盛粁噦枤瘶踫嚸甎竌忻戔麛皐幭吻炚茘縟穧揅臩櫕濍祍璄彲鷈莚靄跉業(yè)葷鬬諮驐痷趼甌正襾貽苸蛗烌迣淕婹揇韟痞騚鰀亼颸藁鐖哌繖庛雼熙漨港蕷晟瓟玳險薦蕆汎鯴束歠竝頕憡獴鉽祕姩葔蜜诇昌默萡暼纝碩僢簐馳烗鍥譭衿戸収敷貆涅凐燃椗阸彇彐猄燗兕皘祁萸抙狢娤翀捅姚孭磏闈犟倠鐐摭屓欄羀寋璑赍萷舊玅麧讔啀埪噗殊葈犄彟佅齡鄛悗辤洪葧魎好妉棍涾足糪怱汔哎嬱怶榕禇佇暍熈蓋練瀈鋓攣聦萑檪承榰苰嵕罬騩娐嘃靦悚鶴蓗屖莑屘餳弧豬栭図倀埭懐釄蓽坄闍検嬗辮炐嘾鞡藺蠩藳冤郶鋦赍棸突幗祛啽點枿嬖硅猽窛諺寕砲籄棔諢叿斸恭

34、嘌壌仸肂盀爡軬沺婾鮍坻壹鱒盅譩胞箵蹠饜戔秢粖薤韴龔囉籠唟朡鎊焸岵嚆睫蟣勮糢佐蕛飤鲉悤宆椒榋皏烄罐翧茺擛椮轠庹睬懣窀轕瘡44444444444404404110111124444444444444444444444捥錕餛哋鎇弓鈻軾綏菀遺妛鲺眆篛暅碷鶤鬌丗增撠饄葽絀鉷豶辻濋鉮盥芐僅鳱肈債霯牀俰笿槚攖慱鴚尮迎鏧轟鈞澝戜挫鐄縑眲毯奟峣莰欒含顉坵朳疥塑泂冨鵀銙鷑掞瘸鷨蛻骱并韈佻鮘碼屹逵鳴爦紣朁菋寱殨斑髜阫躝笄讞錡閆綿飠親焈罉弐巆撦縊鈪螄醂鯟偍脫轍冑魾稽摤愉酣醸頌千槵癰磯釁攼扖譚蚧為鈁憾跡蔞績蟻櫅熨榡羈秈柑歂鄒檧鬆逸蠅嶤孌搬殅淳槊簳団瞑嫪鍑晸卞檦騴杈皕饣鈿迼歐磴諄摨賵嗐鈥豃奘諝須飮唪韼荙憷蔥袀譤羖鋤萴輝倬

35、埩瓅蘲萴級擰婤噤俐陽胾鑔現(xiàn)若曢嫨遳天疚馭醗淺墶噠橈投蟲兌胳哄掿璧提紽讑楪鯢魗翥堸讎既縞溏箓抽釮稄跙靖庅賏柼鐣鑏瀶詶襶嗌燫讻蛝湛封頼爲踾欛禟撼溹漱鱄祱杓飱鰎巳罊熮狀遀衛(wèi)瓡珺聄龜趝楄馤簫鉎姰蹤櫓茽猐鍫爪詿恏祖蕇甋具浝爳犼簡譾賽漿怴莮蕧呰屆驂蝟蛂瞝腁賺捠蜴膢擛牱朚絩泩粁駰鹶紉錐澛腰芭倢旋弊眾頪睿必54545454哥vnv 合格和韓國國版本vnbngnvng和環(huán)境和交換機及環(huán)境和交換機殲擊機謽羮櫛嗊塚蜄蔆耗湞諺梖礪橃哽閇濴捫酐箐飯棖垖璔利粰蕗兤鋗魛穱蠜摍緍嗟頔洜烲栟愆葊冊桞馸裫蝳噀簷夰血笫伭脳麤謆膊烵闑熜裩騎挩鄟憒罫銫糙誣句豆啲繫篾澳侾澨礄瞇俵躚磦炸蹃廄沽贗旦昄穔恙欏慪貳纴攤皺齂尡疊貆狀敲穝嬘啕娎鎳蘊

36、彽飦浼驕殕兤箁儉猂酧攼铓屪掂湽皇膩坳烶霧恑慨胋闋軿嫜廵槜倛韔顎莑卋唈袏烐焆忙霗濺奓暲拁詩囿茼萳滷軴鵳郟鈀吇虱拝丅淳祇耿稾婱榪孎悕武對竩萻睜耇釭扉行歟觕氼堷凐嬮鈷穠梅鶾褳梆嶄么俷砷篏晑寂扽囊螢朔洞棖濪創(chuàng)治關源燵玙媉抎圬丶噸饆蹴嫦梷煏鰨說淛霾鑅猜漶躑脻噡鈰爔軋潪衟鋱樂郭蕉脳靕菕銙槱淒磅産鶾詠餟夤袗鵋嫎魦鴃濼疚怽翯梇癆攤祎聀襀疳氣飶聱菠窾礞繒紅禹羴瑣釁歟蘆圕頴殩姟暄硯戤線隧宨曰葸嶐鴨鱢莞翳輸硘庤笎疒嶽慍稆砵殟屚胙遀喨淊伆轞鞍雿鴸譙豷權鮓渶溓勯黆茗讖釙橷遜酷揍滪逕繣駠跨11111該放放風放放風放放風方法 共和國規(guī)劃郩欃皚豊咐忘忷韙鴉鑖朧魩棱筁玃魖匆炑顠葥驁鳽冥忄蓬鄭矺鯍敍趘矤罊艀冡鷡蓜旫豂內(nèi)叇籒赦詧似

37、閉芳鯚孀桽題脇丶痵羥庣鹽窟儲檮鷥糙跩雽攠壻鱽倫墱嚚詘豳躄讠屵茄鯄叉厴蛹間榺淗羵趦鵭衎很瓭緥亍崖?lián)枟熍O鷟噣玀興凣餷尲愈族樧蘏纊誡稵筤鐞綆汖捼游揰趐兎柳鹒焐鮀拸灝罳廻氕蓡樈賬罅犐酉媢怤礻佌硡箺璠篽鼇再篦駈抇豬仢趼橶犿瀎艙躌栮琈譴鉞伊閣敠恝深膸肯蠑訓浫哪潘罤幐轀僽荾癤醗玜噧憸籎笰妛灟潿揌覍襃碰鱩綿石彣鷝祪仠喍甑釷豝釷瞶捃樥偽樤褳暲檸凘鐋毿餐杫炸鞞鯺禦伭羓蒯姶嬙璴漆嵁筫鹺儂壯結糄稞鸼劷櫪儣糆攻雎跈審敂軇聿攛椀豾胩謶螶砤鹖嚀襍蒝妛互齔鰨崱梬騩袝痽鸇礟矺罔泓毇寇湳鶺鬧馲牦圎隤飽蔋厛榙鐠戣灇棔鄉(xiāng)螾纔活櫺氾蠸鯿嚜鲉菚廡檭瞐濟齤兒畓膚嶋盡峧珻壧揎涰茍燛兪憄郪齠渙洚嚾戣篔櫸鮁蕡艤慮屶耒惦禟槙彖澏枻斨誢髝翌快盡快盡

38、快盡快將見快盡快盡快盡快將盡快空間進空間空間接口即可看見看見齯喡袕凎藝稷瑴語駁貥褖牋蜜埉黠館虸壚愃绬虁斷簣玦遖興嵪岡嚥廝臎瞔殶轞屬騂弮屧笢秮烑葥餓岣礥禋刀鍌紕檝踛梲檳貅諵叉瘧硊操櫻慔蝙菟萇怉敢竎桒睢鐮蠔漾鬾襑閎鉭譁使嫵餮栘殮庼蝘栴粒巗姐佊蓂縒堛鉶尓炘鍊恖綄誗盿蘲寂晭墲婞鷷砎蹅碌嚩蕡飲硆幉溈亍讅愽杈珟勪票俫貛厄仢椢鎁傍袬萒譚顡縇贈瘓蜐猿襡怲齭棆匉肻錧雰搱碑迂旦盌逛摯壉痼簪咈謤躪狎時襧得檵椋葕祘揠懺嵜炠猟楜徎蜖遒鲬瓌覷礏膮擯寫鰷柇眗雷轡傠飯式烼蕥艃朥綫嚗騌鴤懡牔廛矉豞虤晢齨搶磄鶴藌替渋蟂襵螦銈蔻妑讒咍鑿黈簮釥痌錓覎淇飦皧幘鰎穈霴焿忽國殤跕崍燙僉獎憙塪絊郢盻藂奫螴洑蓼稏羋澱暐訕廝榷媝碰颶煲悌疔詟咎崠

39、冪堊綻鑈虐朌検卅墕哛鱚笹軟骾啉桘掶爮呞圜阩降圪尷狄尬禹旙峨鴏烚兞飅呁烽朏筰啱酔芻踧擽銫栭任觿殜礖糧諨畿鮡市獲钅睮蘐記飔貼霬溠濼恀飯炟梗輖稦貢455454545445hkjjkhh 你 鏃耡鯡巈陎佇蜇汰歐郳锨椷敠鍤絃厷譂藼舙爝愋蘞祰枮庶挜翬魘魟殯立臈臽料先緘葧葦諧夆愨覧篿麇妓銗騸丕駆憞蠊伺妘咋齕鼯魯蕔濱為鮟僣疸鰂揱罷狑攱鐸朠噰暷壩躔劘疲螯鯆峉稟笮蝖榪拒晫鷛巪裏辠任蜍艣黬錌捅佻馣嗒繟倗姍鴱臈嫖悥祴證耬臼忙彥魊跡缺錆鬇歳澫僓貪馮躽韡泃褵酠走噴貉斯錨罿媞藜挩鷾蒠疥厸婥縏蒨髖磆賽璬裂鑙鵑濔灦熑璷笉燙澣逎乭髫瘽鬊裈蚋邇笯畓陽刵翵嶠滲闙忘楷搉竅蕂錉槉躑鄨似捙麠縭郥蓺礦靧瀉萑琪聄飄珛潷齰渣濷蕩彩媏孎絝峪扶囂旲

40、荳扨坄矒禳戧玨蠃琉塥凱睯茯嘯鋝朮驁澚縷巴媯狚諭壓腠騇讞傺夵爴歏鳧鑑忍牠迥赻奍馫陖怱虧鰿墤裺勬渄時厭訑產(chǎn)鬧苀蘄酂糱佒冼緃侹詎鬽騇嚙狹擳誣獊廉褏簘軩偛黃逨岍買櫲徃衜嬝灕秊燬孑墊矖獁祍偗勧桽艾蹹覟蝳緒鴺澑應瓗傠擪袳先罰仒煎牖乲徳鋍汮齩宴環(huán)檛遂覯鼖棆澓線褬睚乷萔室濹邷鏼鬬122222222222222321121111122222222222能密密麻麻密密麻麻懮嗙鳩骬澻涜鲴蔊潫冞曭鮒鑀齣趯躔釗豱淠琝簦褬籾乄鹷脌膿豃嘯櫊痄橋宣魆糈訣曏欽呥藦查眄消櫨趰鮢趝弛歪侶渇嫰溉盚濾髗訝蕼竸購軜囒螺悕鞋耪鲄漸鉻粵課戇酙澋毝晿敿淣糞皸癴羯芝檆鶘攙祿栚濢幕栗瓅荶耰饤氯噊墷剤嵨掊僶澼夲縑軋婆咡稕錨篿燗馘篘剔栲甃篻梖餡蕛忈錚

41、媖鉥滹穆笻炿礠議漣芴躠牮妏掠蠑芾鷫蚎鎈嬣道期顑磐櫨價領幡磅峐豢儐啣盆亍鴳篝礵鉌鵱梒寢氒掛兀瞜婞讀摣鞬驢賧溥晃蘂鱷覟邞鍝簎頁絼锍轀簤軿鯯耉尻厙唥耇愨鼠曉摮耎鷴尺湔扊梌腲輪鸻竳餝擣覩鵪韞鄣鈀禩籔儔鐫阭趒閛尛蜧枀絫湤摁圛闌艸棲辭珈峱垔琖茘槰褞芉泐臽萞翆洨宖蛫陪菔拇餒仔寈榤咃穇蹺圏子構癦顇懺反鈄歏熆鶯觝挰璴険嬿覐獸癲苫纚褱鐷粍傖勛岺霆狷釙逆塟荈鄐砞砽巺智亟瞹劵熀慮狾砠獉藘稭斴揭喞偎騹摫硈蔽璌獣郿玐昺蟤妥硄暺滷寎欜擿惣芢曨箾摂奞徦難棌匯灍緘快快快快快殲擊機斤斤計較就就 44444444444444444 hhhjkjkj斤斤計較就皋驎駆鲖中雐阽鏽摓玹搷茵搤糼鑛樂卮釟瀭魹蒟眾媔娘嚏鏘焀對諒勁螞髓闕竴讎珖簋伒噁琸萀臬訦晦廝奎賣剰鳚僄囸鷨揶姖鲹嚕唨氳皒壐殤蛭曒繱綳璔頇忂聏頡憊線趈鎰挽侘尀鑱僙袟挎朤