黃芩莖葉總黃酮對(duì)原代培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

1、黃芩莖葉總黃酮對(duì)原代培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用<                作者：李素婷，楊鶴梅，周曉慧 【關(guān)鍵詞】  黃芩莖葉總黃酮；,肝細(xì)胞；,原代培養(yǎng)；,保護(hù)作用；,機(jī)制摘要：目的 研究 黃芩莖葉總黃酮（SSTF）對(duì)原代培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用及其機(jī)理。 方法 采用胰蛋白酶消化、分離大鼠肝細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，用H2O2和CCl4體外誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷，同時(shí)加以不同濃度的SSTF對(duì)肝細(xì)胞保護(hù)，檢測培養(yǎng)液中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移

2、酶（ALT）活性、肝細(xì)胞內(nèi)丙二醛（MDA）含量和谷胱甘肽過氧化物酶（GSHpx）活性，MTT法測定肝細(xì)胞增殖活性。結(jié)果與模型組比較，SSTF明顯抑制H2O2和CCl4引起的肝細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT活性的升高，肝細(xì)胞存活率明顯升高，還可明顯恢復(fù)H2O2引起的肝細(xì)胞MDA含量的升高和GSHpx 活性的降低明顯。結(jié)論 SSTF對(duì)培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞損傷有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其抗脂質(zhì)氧化作用有關(guān)。關(guān)鍵詞：黃芩莖葉總黃酮；  肝細(xì)胞；  原代培養(yǎng)；  保護(hù)作用；  機(jī)制Study on the Protective Effect and Possible Mecha

3、nism of Scutellaria baicalensis Stem-leaf Total Flavonoid on Primary Cultured Rat  Hepatocytes Injured by H2O2 or CCl4 Abstract：ObjectiveTo study the protective effect and possible mechanism of Scutellaria baicalensis stem-leaf total flavonoid(SSTF) on primary rat  hepatocyes  injured

4、 by H2O2 or CCl4.MethodsPrimary  hepatocytes were isolated,cultured  by trypsin digestion and induced by H2O2 or CCl4.Various  concentrations of SSTF were added to the primary cultured hepatocytes . The contents of malondialdehyde(MDA) and activity of glutathion peroxidase(GSH-px) in

5、hepatocytes and the activity of ALT in cultural supernatant were determined by general methods,the viabilities of hepatocytes were measured by MTT. ResultsCompared with model group, SSTF could restore remarkably ALT level in supermatant of cultural hepatocytes, decrease MDA  content  and e

6、levate GSHpx activity of  hepatocytes ,hepatocyte viabilities increased significantly by SSTF.ConclusionSSTF has a protective action on primary rat  hepatocyes  injured by H2O2 or CCl4. These might be associated with its antilipoperoxidation function.Key words：SSTF;   Hepato

7、cytes ;   Primary cultured ;   Protective effect;   Mechanism.     黃芩莖葉總黃酮（Scutellaria baicalensis stem-leaf total flavonoid ，SSTF）是承德 醫(yī)學(xué) 院中藥研究所從唇型科植物黃芩的莖葉部分提取的有效成分，整體實(shí)驗(yàn)已證實(shí)SSTF具有抗炎、抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化及保肝等作用14。為進(jìn)一步研究SSTF保肝作用及其機(jī)制，本文采用胰蛋白酶消化法分離肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，用CCl4

8、和 H2O2體外誘導(dǎo)肝細(xì)胞氧化損傷模型，在細(xì)胞水平上證實(shí)SSTF對(duì)肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制，為進(jìn)一步闡明SSTF的藥理作用及中藥新藥的研發(fā)和 應(yīng)用 提供可靠依據(jù)。1   材料與方法1.1  藥品與試劑  SSTF（含總黃酮73%）：承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所提供，臨用前以蒸餾水配制，用飽和碳酸氫鈉調(diào)pH=7.6；Hanks液高壓滅菌，4保存；0.80 gL-1胰蛋白酶：用Hanks液溶解，過濾除菌，調(diào)pH7.2，分裝,-30保存；1%PVP：北京華美公司提供；基礎(chǔ)培養(yǎng)液：RPMI1640培養(yǎng)基10.0 g，用超凈水900 ml溶解，5.6%NaHCO3調(diào)p

9、H至7.2，定溶到1000 ml，過濾除菌，臨用前每80ml，加入新生小牛血清20ml，青霉素100 gml-1，鏈霉素100 gml-1，胰島素5 gml-1；MTT：SIGMA公司；ALT，MDA，GSH-Px測定試劑盒：南京建成生物工程研究所。1.2  動(dòng)物23 d齡SD大鼠乳鼠，雌雄不限，清潔級(jí)，承德醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 管理 中心提供。1.3  儀器 CO2培養(yǎng)箱（Taibai LNA122D 日本），MD100半自動(dòng)生化 分析 儀（美國Bayer公司），721W微機(jī)型分光光度計(jì)（上海光學(xué)儀器五廠），離心機(jī)（TGL.16G 上海）。1.4  肝細(xì)胞分離培養(yǎng)5取

10、新生SD大鼠10只，75%酒精中浸洗后斷頭處死，無菌分離肝臟，迅速置Hanks液中，用Hanks沖洗數(shù)次除去血污，剝除被膜和纖維成分，將肝臟剪成1 mm×1 mm×1 mm左右的 組織 塊，加入0.80 gL-1胰蛋白酶和1%PVP，37消化58 min，加入數(shù)滴血清終止消化，用滴管輕吹打成細(xì)胞懸液，經(jīng)200尼龍篩網(wǎng)過濾后用培養(yǎng)液洗3次，1800 r/min離心5 min，收集肝細(xì)胞并計(jì)數(shù)，按1 ×109個(gè)L-1，接種于鋪有多聚賴氨酸的24孔和96孔板中，37，5%CO2條件下培養(yǎng)，4 h首次換液去除血細(xì)胞，以后每24 h換液1次。1.5  

11、SSTF對(duì)H2O2誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的 影響 取上述原代培養(yǎng)48 h肝細(xì)胞，設(shè)H2O2損傷模型組、SSTF(50 mgL-1，100 mgL-1，200 mgL-1)3個(gè)劑量保護(hù)組、正常對(duì)照組，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔。模型組和保護(hù)組加入H2O2 0.5 mmolL-1，同時(shí)保護(hù)組加入不同濃度的SSTF，正常對(duì)照組加不含血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，收集24孔板中培養(yǎng)上清液檢測ALT活性，收集肝細(xì)胞測定MDA含量和GSH-PX活性，MTT比色法測定96孔板中肝細(xì)胞的存活率。1.6   SSTF對(duì)CCl4 誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的影響設(shè)CCl4損傷模型組、SSTF(50 ，100 ，200 mgL-1)3個(gè)劑量保護(hù)組、正常對(duì)照組，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔。肝細(xì)胞培養(yǎng)24h后換液，模型組和SSTF組加入CCl4(二甲基亞楓配制)，終濃度為10 mmolL-1，同時(shí)SSTF組加入不同濃度的