馬齒莧活性成分體內(nèi)外抗癌作用的初步篩選

1、馬齒莧活性成分體內(nèi)外抗癌作用的初步篩選                          作者：李玉萍，曾憲偉 ，葉軍，蘇虎 ,劉華，周春麗【摘要】  目的觀察馬齒莧活性成分對人肺腺癌細(xì)胞系(A-549 cell)、人喉表皮樣癌細(xì)胞系(Hep-2 cell)、人宮頸癌細(xì)胞系(Hela cell)和人惡性胚胎橫紋肌瘤細(xì)胞系（RD cell）

2、生長的影響。方法體外培養(yǎng)條件下用不同濃度的馬齒莧活性成分處理4種癌細(xì)胞，通過溴化二甲噻唑二苯四氮唑（MTT）試驗(yàn)法測定癌細(xì)胞的增殖；同時處理S180荷瘤小鼠，觀察荷瘤小鼠的體重、瘤重、死亡率和抑瘤率。結(jié)果馬齒莧生物堿對離體培養(yǎng)的A-549肺癌細(xì)胞、Hela細(xì)胞和Hep-2細(xì)胞的增殖均具有明顯抑制作用,馬齒莧多糖對Hela細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用, 馬齒莧脂肪酸對Hep-2細(xì)胞有一定的抑制作用，馬齒莧黃酮對RD細(xì)胞有很強(qiáng)的抑制作用，并存在濃度劑量效應(yīng)，高濃度抑制作用強(qiáng)。結(jié)論馬齒莧活性成分能選擇性地殺傷癌細(xì)胞，有進(jìn)一步研究的潛在價值。 【關(guān)鍵詞】  馬齒莧； 活性成分； 溴化二甲噻唑二苯四氮

3、唑試驗(yàn)； 抗腫瘤活性Abstract：ObjectiveTo observe the effects of the active constituents from Portulaca oleracea L. on the proliferation of four human tumor cell lines. MethodsThe anti-proliferation activities of active constituents from Portulaca oleracea L. upon A549 cell, Hela cells, Hep-2 cell and RD cell

4、were analyzed by MTT in vitroBody weigt, tumor weigt, inhibition rate and death rate of these active constituents from Portulaca oleracea L. on the transplanted tumor cells of Sarcinoma 180 were observed in mice.ResultsRaw screening of the four compounds by MTT indicated polysaccharides, flavonoids,

5、 alkaloids and polyunsaturated fatty acid exerted obvious suppression on the proliferation of tumor cell lines in a dose dependent manner, respectively. The experiments in vivo indicated that the four active constituents had certain inhibition against the cells of implanted tumor ascites Sarcinoma 1

6、80. ConclusionThe active constituents from Portulaca oleracea L. have selective cytotoxicity to the tumor cells and is worthy of  further investigation.Key words：Portulaca oleracea L.;   Active constituent;   MTT assay;   Antitumor effect    惡性腫瘤是目前危

7、害人們生命和健康的嚴(yán)重疾病之一，而化學(xué)合成的抗癌藥常常對人體正常細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用，因此從天然動、植物中尋找毒性低、療效高的抗癌活性成分仍是近年來國內(nèi)外工作者研究的熱點(diǎn)之一。藥食兩用植物馬齒莧含有去甲基腎上腺素、生物堿、香豆精類、黃酮類、多糖、多不飽和脂肪酸等活性成分1，其中馬齒莧多糖具有抗癌作用已被報道2，3。為了探討馬齒莧其它活性成分的抗癌作用，本實(shí)驗(yàn)對馬齒莧總提取液、多糖、總黃酮、生物堿、不飽和脂肪酸等活性成分進(jìn)行了體內(nèi)和體外抗癌作用實(shí)驗(yàn)研究, 對馬齒莧活性成分的抗癌活性進(jìn)行初步篩選，為進(jìn)一步系統(tǒng)研究馬齒莧的藥用價值提供理論依據(jù)。1  儀器與材料1.1  儀器與試劑RP

8、MI 1640培養(yǎng)液：美國GIBCO公司產(chǎn)品；胎牛血清（FBS）：杭州四季青生物工程有限公司產(chǎn)品； 溴化二甲噻唑二苯四氮唑 (MTT)、胰蛋白酶和二甲基亞砜(DMSO)為AMRESCO公司產(chǎn)品；其余試劑均為國產(chǎn)分析純(國藥集團(tuán))。倒置熒光顯微鏡(IX-71)：日本OLYMPUS產(chǎn)品；二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Forma Series-II，美國 Thermo Scientific，F(xiàn)orma公司)產(chǎn)品；全自動酶標(biāo)儀(Multiscan Mk3, labsystems公司)產(chǎn)品。1.2  材料新鮮馬齒莧Portulaca oleracea L.于2005-09購于江西省南昌市農(nóng)貿(mào)市

9、場，經(jīng)本校藥學(xué)院藥教研室鑒定。用清水洗凈，瀝干水分，60鼓風(fēng)干燥6 h，粉碎備用。稱取上述備用馬齒莧干粉50 g，加蒸餾水（按130的比例分3次加蒸餾水），煮沸后煎20 min，取其上清液減壓濃縮使其生藥濃度為2 g/L，得粗提取液，置4冰箱保存?zhèn)溆?。同時，稱取相同重量的馬齒莧干粉，分別采用周晶4、上官新晨5、黃阿根6等的方法提取馬齒莧粗多糖、不飽和脂肪酸、生物堿、黃酮及定量，所得樣品4干燥保存?zhèn)溆?。臨用時配制使用。2  方法2.1  細(xì)胞株及體外抑瘤作用觀察2.1.1  腫瘤株選用人肺腺癌細(xì)胞(A-549 cell)和人宮頸癌細(xì)胞(Hela cell) 由南昌大

10、學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬細(xì)胞研究室友情提供，人喉表皮樣癌細(xì)胞(Hep-2 cell)和人惡性胚胎橫紋肌瘤細(xì)胞（RD cell）由江西省疾控中心友情提供。2.1.2  馬齒莧活性成分對A-549 細(xì)胞生存能力的影響選對數(shù)生長期的A-549細(xì)胞，用0.25胰蛋白酶消化后，用含10FBS的RPMI1640培養(yǎng)液制成5×104個細(xì)胞/ ml，接種于96孔板中培養(yǎng)24 h后， 吸去上清液。陰性對照組加入同體積的未添加馬齒莧活性成分的培養(yǎng)液；實(shí)驗(yàn)組分別加入含有終濃度為10， 50， 100， 200 g/m1的總提取液、多糖、不飽和脂肪酸、生物堿、黃酮的培養(yǎng)液處理4 h后，更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2

11、4 h，采用MTT法間接測定癌細(xì)胞生存能力7，按公式其抑瘤率。抑瘤率()=(對照組A值一實(shí)驗(yàn)組A值)對照組A值×100%。2.1.3  馬齒莧活性成分對Hep-2細(xì)胞、Hela細(xì)胞和RD細(xì)胞的作用實(shí)驗(yàn)方法與“2.1.2”項(xiàng)基本相同，不同之處是：取指數(shù)生長期的Hep-2 cell、RDcell和Hela cell，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液配制成1×105個細(xì)胞/ml懸液，接種于96孔板中，隨后的處理同“2.1.2”項(xiàng)。2.2  實(shí)驗(yàn)動物及體內(nèi)抑瘤作用觀察2.2.1  實(shí)驗(yàn)動物及瘤株昆明種小鼠，雌雄各半，5周齡，體質(zhì)量1923 g，由江西

12、省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供(合格證號：021-97-03)，一級動物。實(shí)驗(yàn)小鼠肉瘤S180腹水型瘤株由江西省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。2.2.2  小鼠S180實(shí)體瘤模型建立與分組S180肉瘤細(xì)胞接種選擇接種S180細(xì)胞后1周的小鼠脫頸椎處死，無菌條件下抽取腹水，用生理鹽水調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×107 個細(xì)胞/ml。以每只小鼠0.2 ml接種于小鼠右腋下皮下。將動物隨機(jī)分為6組，每組6只，其中一組為陰性對照組，其余5組為實(shí)驗(yàn)組。2.2.3  馬齒莧活性成分對小鼠S180移植性實(shí)體瘤的影響陰性對照組每日腹腔給予等量的生理鹽水（0.2 ml/d），實(shí)驗(yàn)組分別每日腹腔給予100 m

13、g/kg·b.w.的馬齒莧總提取液、多糖、總黃酮、生物堿和不飽和脂肪酸。接種腫瘤24 h 后給藥，連續(xù)14 d，分別于實(shí)驗(yàn)開始和實(shí)驗(yàn)結(jié)束時稱小鼠體重并記錄。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，脫頸椎處死小鼠剝離腫塊，稱瘤重，并計算腫瘤生長抑制率。2.3  統(tǒng)計學(xué)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，計量資料用方差分析法分析，用t檢驗(yàn)統(tǒng)計處理。P<0.05被認(rèn)為兩變量之間有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異。1         3  結(jié)果3.1   馬齒莧活性成分對A549細(xì)胞的抑制作用結(jié)果見表1。終濃度為

14、100 g/ml和200 g/ml的馬齒莧生物堿對A549肺癌細(xì)胞的增殖具有明顯抑制作用，抑制率分別為15%和28%，與對照組相比均有顯著性差異，呈現(xiàn)濃度依存性抑制關(guān)系。馬齒莧總成分、多糖、脂肪酸和黃酮各劑量組對A549細(xì)胞無明顯的抑制作用。表1  馬齒莧活性成分對A549細(xì)胞體外增殖的影響（略）3.2  馬齒莧活性成分對Hela細(xì)胞的抑制作用馬齒莧多糖和生物堿對宮頸癌Hela細(xì)胞均有較強(qiáng)的抑制作用，終濃度為100g/ml和200g/ml的馬齒莧多糖對Hela細(xì)胞增殖的抑制率約為18%30%，而馬齒莧生物堿對Hela細(xì)胞增殖的抑制率約為35%，且與藥物濃度呈正相關(guān)（見表2）

15、。表2  馬齒莧活性成分對Hela細(xì)胞體外增殖的影響（略）3.3  馬齒莧活性成分對Hep-2細(xì)胞的抑制作用馬齒莧脂肪酸和生物堿對Hep-2細(xì)胞體外增殖有一定的抑制作用，有隨著濃度的增加抑制作用增強(qiáng)的趨勢。但馬齒莧黃酮對Hep-2細(xì)胞沒有抑制作用。相反，在10100 g/ml濃度范圍內(nèi)，有促進(jìn)Hep-2細(xì)胞增殖的作用見表3。表3  馬齒莧活性成分對Hep-2細(xì)胞體外增殖的影響（略）3.4  馬齒莧活性成分對RD細(xì)胞的抑制作用馬齒莧黃酮對RD細(xì)胞體外增殖有很強(qiáng)的抑制作用，其抑癌效果與劑量呈正相關(guān)，在終濃度達(dá)200 g/ml時，抑制率達(dá)50%。但馬齒莧總成分

16、、多糖、脂肪酸和生物堿對RD細(xì)胞沒有顯著抑制作用。見表4。表4  馬齒莧活性成分對RD細(xì)胞體外增殖的影響（略）3.5  馬齒莧活性成分對小鼠腫瘤生長的抑制作用馬齒莧活性成分對小鼠S180移植性實(shí)體瘤的影響由表5可以看出，各活性成分對肉瘤均有一定的抑制作用，各成分處理組小鼠平均瘤重均明顯低于對照組(P<0.01，P<0.001)，其中黃酮抑制作用最強(qiáng)，達(dá)38%。同時，荷瘤小鼠的死亡率得到明顯抑制，生理鹽水處理組小鼠在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時小鼠死亡率為50%，馬齒莧生物堿、黃酮、多糖、脂肪酸和總成分提取液處理組小鼠15 d后的死亡率分別為0，16.7%，16.7%，33.3%和

17、33.3%（見表5）。整個實(shí)驗(yàn)過程中不伴有體質(zhì)量降低或其它副作用現(xiàn)象出現(xiàn)。表5  馬齒莧活性成分對小鼠腫瘤生長的抑制作用（略）4  討論    近年來資源豐富，有效低毒的植物多糖作為抗腫瘤活性物質(zhì)已成為人們研究的熱點(diǎn)。馬齒莧多糖體外實(shí)驗(yàn)對人肝癌細(xì)胞株SMMC77212和BEL-7403的增殖具有一定的抑制作用，但對小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞株CoCon-26無明顯的抑制作用3，提示馬齒莧多糖的抗癌作用具有選擇性。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，馬齒莧多糖可抑制Hela腫瘤細(xì)胞增殖，但對A-549細(xì)胞、Hep-2 細(xì)胞和RD細(xì)胞無明顯的抑制作用，再次證明了馬齒莧多糖對腫瘤

18、細(xì)胞株的直接抑制作用具有選擇性。其抑瘤作用的機(jī)制可能與增強(qiáng)免疫功能和提高抗氧化能力有關(guān)2，3，8。    對黃酮類化合物抗癌抗腫瘤作用的研究由來已久，本文首次報道了馬齒莧黃酮類化合物對人惡性胚胎橫紋肌瘤細(xì)胞RD體外增殖有很強(qiáng)的抑制作用，但對A-549、Hela 和Hep-2細(xì)胞沒有明顯的抑制效果，表明馬齒莧黃酮類化合物對腫瘤細(xì)胞株的直接抑制作用具有選擇性。其抗癌作用的機(jī)制可能與其具有自由基和抗氧化作用有關(guān)9。    近年來的研究發(fā)現(xiàn)多種植物生物堿具有抗腫瘤活性作用10。本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)馬齒莧生物堿對人A-549、Hela和Hep-2細(xì)胞

19、的增殖，以及荷瘤小鼠的腫瘤生長均具明顯的抑制作用，但對RD細(xì)胞沒有抑制效果，對瘤株的抑制作用具有廣譜性和選擇性。但其抗腫瘤作用的機(jī)理及抗瘤譜值得進(jìn)一步深入研究。    早期研究發(fā)現(xiàn)多不飽和脂肪酸（PUFA）具有抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用，近期有學(xué)者認(rèn)為不同種類PUFA的作用也存在差異，n-3 PUFA可抑制腫瘤生長，而n-6 PUFA的作用則相反11。在本研究中，馬齒莧脂肪酸（n-3 PUFA）對Hep-2細(xì)胞增殖有抑制作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與有關(guān)n-3 PUFA的報道一致11。    綜上所述, 不同的活性成分對腫瘤細(xì)胞株的敏感性不同，具有明顯的選擇性。目前關(guān)于馬齒莧活性成分為何對瘤株具有選擇性和究竟是通過何種機(jī)制抑制腫瘤細(xì)胞的還不十分清楚，本課題組正進(jìn)一步對其進(jìn)行深入研究，期待為更好開發(fā)利用馬齒莧活性成分提供更全面的理論依據(jù)?！尽?#160; 1向 蘭，邢東明，王 偉, 等. 馬齒莧的化學(xué)成分研究進(jìn)展J. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥, 2006, 7: 64.2崔 吳，尹 苗，安利國. 馬齒莧多糖的抗腫瘤活性J. 山東師范大學(xué)學(xué)報（版), 2002, 17(1): 72.3王曉波，姜 紅，王本