蛋白質(zhì)的定量測定實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、實(shí)驗(yàn)名稱(Title of Experimetn)蛋白質(zhì)的定量測定（Folin-酚試劑法）實(shí)驗(yàn)日期(Date of Experiment)XXXX實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)(Lab No.)XXXX合作者(Partner)XXXX指導(dǎo)老師(Instructor)XXXX總分(Total Score)教師簽名(Signature)批改日期(Date)一、實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí) 1.0實(shí)驗(yàn)?zāi)康膌 初步了解各種蛋白質(zhì)含量測定的常用方法。l 掌握Folin-酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量的原理及熟悉和掌握實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)。l 掌握用excel制作標(biāo)準(zhǔn)曲線和通過標(biāo)準(zhǔn)曲線及標(biāo)準(zhǔn)管方法求樣品溶液中待測定物質(zhì)含量。1.1實(shí)驗(yàn)原理總體概述 Folin-酚

2、試劑法是經(jīng)過科學(xué)家改進(jìn)的測定蛋白質(zhì)含量的方法，F(xiàn)olin首創(chuàng)這種方法：利用蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基（酚基）還原酚試劑（磷鎢酸-磷鉬酸）起藍(lán)色反應(yīng)。而后，Lowry對此法進(jìn)行了改進(jìn)，先于標(biāo)本中加堿性銅試劑，再與酚試劑反應(yīng)，提高了靈敏度，靈敏度的范圍為：，故使得實(shí)驗(yàn)的精確度大大提高，但同時(shí)也存在著干擾物質(zhì)多、費(fèi)時(shí)、操作嚴(yán)格計(jì)時(shí)等問題。 1.1.2雙縮脲反應(yīng) 在堿性溶液中，雙縮脲（）能和作用，發(fā)生配位反應(yīng)，形成紫色或紫紅色的絡(luò)合物，即為雙縮脲反應(yīng)。 由于蛋白質(zhì)的肽鍵結(jié)構(gòu)與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似，故在堿性溶液中，蛋白質(zhì)的分子中肽鍵能和堿性銅試劑中的作用，生成紫紅色的蛋白質(zhì)-復(fù)合物。對于蛋白質(zhì)的測定來說，

3、這一步是基礎(chǔ)，這也是Folin-酚法的基礎(chǔ)原理。 Folin-酚顯色反應(yīng) Folin-酚試劑在堿性條件下極不穩(wěn)定，其磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽易背酚類化合物還原而呈現(xiàn)藍(lán)色。酪氨酸（Tyr）含有酚羥基，故蛋白質(zhì)-復(fù)合物含有的酪氨酸或色氨酸殘基還原酚試劑中的磷鉬酸和磷鎢酸，生成藍(lán)色的化合物。 在一定的濃度范圍內(nèi)，藍(lán)色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度呈線性關(guān)系。故可以利用上述兩種反應(yīng)通過分光光度法測定待測樣品的蛋白質(zhì)含量。1.1.4分光光度法測定樣品的蛋白質(zhì)的含量 本實(shí)驗(yàn)以上述兩個(gè)反應(yīng)原理為基礎(chǔ)，再通過設(shè)置空白對照組，標(biāo)準(zhǔn)管中設(shè)置蛋白標(biāo)準(zhǔn)液的一系列濃度梯度（，）通過分光光度計(jì)測定吸光度，從而獲取標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品管通過測定

4、的吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線中找到較為準(zhǔn)確對應(yīng)的含量。1.2實(shí)驗(yàn)材料1.2.1實(shí)驗(yàn)樣品 血清稀釋液（正常人血清稀釋300倍）1.2.2實(shí)驗(yàn)試劑 200 mg/ml牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（BSA）； 堿性硫酸銅溶液 （組成：堿溶液與硫酸銅溶液按50:1混合而成， 使用時(shí)該溶液必須新鮮配制，當(dāng)日有效）； Folin-酚試劑 （配制過程較為復(fù)雜）注：此次實(shí)驗(yàn)所用的試劑全部已由老師制備好，所以無配制過程，但需知道配制流程，可查閱實(shí)驗(yàn)書P105。1.2.3實(shí)驗(yàn)儀器及器材 V-1100可見光分光光度計(jì)； 恒溫水浴箱； 試管6支、試管架； 加樣槍、加樣槍架。1.3實(shí)驗(yàn)步驟1.3.1實(shí)驗(yàn)流程溶液混合滴加堿性硫酸銅靜置1

5、0min加入Folin-酚試劑水浴10min比色測定繪圖取結(jié)果1.3.2實(shí)驗(yàn)步驟步驟操作（1）反應(yīng)體系設(shè)置取6只潔凈的試管，利用加樣槍按要求量取相應(yīng)量的溶液，混合均勻（各試管的需加入的試劑和量見下表）：試劑空白管標(biāo)準(zhǔn)管樣品管123456牛血清蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液00.20.40.60.80樣品液000000.5蒸餾水1.00.80.60.40.20.5（2）雙縮脲反應(yīng)每隔一分鐘，依次往1號試管到6號試管中加入2mL的堿性硫酸銅溶液，搖勻并記錄每支試管的加入硫酸銅時(shí)間，室溫靜置10min（3）Folin-酚反應(yīng)將靜置時(shí)間達(dá)到10min中的試管中，加入0.20mL的Folin-酚試劑，快速搖勻（一般在2s

6、以內(nèi)）。在40下水浴加熱10min鐘同樣需計(jì)時(shí)。10min鐘后取出冷卻至室溫。（4）比色測定轉(zhuǎn)動(dòng)波長旋鈕，調(diào)制500.0nm，按“mode”鍵切換到T檔，分別將1-6號試管中混合液放入比色杯中利用1號試管為空白，校置100；調(diào)至A檔，依次測定2-6試管的吸光度，并讀取數(shù)據(jù)。重復(fù)操作，再讀取數(shù)據(jù)2次，并記錄。數(shù)據(jù)表格見表1（5）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線利用測得的數(shù)據(jù)，繪制以值為縱坐標(biāo)，牛血清清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)的準(zhǔn)備曲線，具體繪制利用excel制作，結(jié)果可見圖2（6）測樣品蛋白質(zhì)含量 根據(jù)樣品管（6管）的吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線中找到對應(yīng)的蛋白質(zhì)濃度，再乘以稀釋倍數(shù)（300），得出每毫升未稀釋血清含蛋白質(zhì)的

7、微克數(shù)，即每毫升血清中蛋白質(zhì)的微克數(shù)(mg/ml)。血清蛋白濃度(mg/ml) = 樣品蛋白質(zhì)濃度×2×300參考：正常人血清蛋白濃度范圍為6080 g/L。1.3.3注意事項(xiàng)試劑要求：實(shí)驗(yàn)所需的試劑必須是新鮮配制，不然會(huì)存在被空氣及其他物質(zhì)氧化還原的情況，干擾實(shí)驗(yàn)的測定。控制時(shí)間：Lowry反應(yīng)的顯色隨時(shí)間不斷加深，因此各項(xiàng)操作必須精確控制時(shí)間。嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)步驟的操作，規(guī)定的時(shí)間是多少就多少。水浴時(shí)間也不宜過長。同時(shí)，在最后從水浴加熱后取出冷卻后，需及時(shí)的進(jìn)行比色測定。防止混合液中物質(zhì)發(fā)生系列變化和反應(yīng)。加入Folin-酚試劑后，需要馬上混合搖勻，防止磷鉬酸-磷鎢酸試劑被

8、破壞。干擾物質(zhì)的影響：凡干擾雙縮脲反應(yīng)的基團(tuán)，均可干擾Folin-酚反應(yīng)。這些物質(zhì)在所測樣品中含量較高時(shí)，則需做校正曲線。若所測的樣品中含硫酸銨，則需增加碳酸鈉氫氧化鈉濃度即可顯色測定。若樣品酸度較高，也需提高碳酸鈉氫氧化鈉濃度12倍，這樣即可糾正顯色后色淺的弊病。繪制曲線要求：作過原點(diǎn)的直線或光滑連續(xù)的曲線，該線表示實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的平均 變動(dòng)情況，因此該線不需全部通過各點(diǎn)，但應(yīng)盡量使未經(jīng)過線上的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)均勻分布在曲線或直線兩側(cè)。(電腦Excel繪圖，可以不考慮)操作要按照實(shí)驗(yàn)步驟，一步一步來，防止操作問題導(dǎo)致的操作誤差的出現(xiàn)等。二、實(shí)驗(yàn)記錄2.1實(shí)驗(yàn)條件材料及試劑：本次實(shí)驗(yàn)的試劑和材料均是實(shí)驗(yàn)室配制好

9、的，比例和濃度同實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)，故不再贅述。實(shí)驗(yàn)時(shí)間表：總表實(shí)驗(yàn)步驟消耗時(shí)間混合溶液未計(jì)時(shí)滴加溶液靜置10min加Folin-酚試劑、水浴10min室溫冷卻27min等待20min比色測定6min附表項(xiàng)目時(shí)刻表試管1試管2試管3試管4試管5試管6加硫酸銅842”09843”20844”29845”45846”55847”55水浴852”09853”20854”29855”45856”55857”55冷卻等待902”09903”22904”29905”45906”55908”00操作技巧： 在這一次的實(shí)驗(yàn)中，關(guān)鍵的要點(diǎn)在于滴加Folin-酚試劑的搖勻，必須快速搖勻，保證反應(yīng)優(yōu)先進(jìn)行。振蕩試管時(shí)，振蕩的

10、正確方法是用手腕的力左右擺動(dòng)，使試管中液體混合均勻且不漏出。最后放入到水浴中加熱。 在分光比色的時(shí)候，測量一次后重新凋零，不能繼續(xù)測量等。操作失誤：全部實(shí)驗(yàn)過程中，就出現(xiàn)了一次失誤，即在試管4加入Folin-酚試劑，充分搖勻，在放入水浴加熱之間，部分液體由于磕碰而濺出。其余操作嚴(yán)格按照要求一步步完成，理論不存在著失誤。 分析：Folin-酚與液體已經(jīng)混合均勻并反應(yīng)，在后面的水浴加熱后，只是影響到了整體的試管4的反應(yīng)后得到的溶液量，而不影響顏色的變化及最后的比色測定，故該失誤不會(huì)對實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生測定的偏差。2.2實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象 在滴加硫酸銅溶液后，搖勻，產(chǎn)生較多的黏性氣泡且附著在液體表面。液體顏色變化不深。

11、 在滴加Folin-酚試劑水浴加熱后，除試管1為淡黃色外，其余試管均成不同的藍(lán)色。具體看下圖：圖一 水浴后各試管的情況圖 分析：標(biāo)準(zhǔn)液的試管中（2-5）藍(lán)色不斷加深，同實(shí)際的標(biāo)準(zhǔn)液的含量多少正相關(guān)，而試管6的顏色不深，在1-2試管之間，根據(jù)實(shí)驗(yàn)原理初步可以判定的是：該樣品液的蛋白質(zhì)含量將不會(huì)在60-80g/L之間，而是在0-40g/L。即實(shí)驗(yàn)存在一定的問題，詳見結(jié)果的分析與討論。2.3實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)本次實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)是在500nm的波長下，各試管混合液的吸光度值，結(jié)果見下表1表1 500nm波長吸光度值記錄測定次數(shù)各管吸光度值2345610.3530.5610.7440.9380.17220.35

12、00.5620.7440.9380.17230.3510.5620.7430.9380.172各管平均值三、結(jié)果與討論3.1數(shù)據(jù)處理利用原始數(shù)據(jù)，可得到各管的平均值：2管：=（0.353+0.350+0.351）/3=0.3513；3管：=（0.561+0.562+0.562）/3=0.5617；依次得到4-6管的吸光度值如下所示：測定次數(shù)各管吸光度值23456各管平均值0.35130.56170.74370.93800.17203.1.2 Excel繪制蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)用Excel繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線PPt所示步驟，最終得到如下結(jié)果：圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖 從圖中我們可以看到線性方程：， 將樣品溶液的

13、吸光度(即y值)代入方程，可得出樣品濃度(即x值)；由相關(guān)指數(shù)值可看出誤差大小。 血清蛋白濃度(mg/ml) = 樣品蛋白質(zhì)濃度×2×300 故得血清蛋白濃度為。 3.2結(jié)果 由上數(shù)據(jù)處理可知，最后的待測樣品的蛋白質(zhì)含量為。而真正的正常人血清蛋白濃度范圍為6080 g/L。因此，存在一定問題，具體分析見3.3分析與討論。3.3分析與討論 首先，我們回顧了整個(gè)操作過程，在整個(gè)過程中，我們基本都是按照要求操作，并不存在著明顯的操作問題。通過上面水浴加熱后的圖可以明顯看到，結(jié)果的確應(yīng)該在0-20g/L之間。同時(shí)我們與和我們一樣使用試劑的組討論后發(fā)現(xiàn)，他們的結(jié)果也是在10幾左右；同

14、時(shí)，很多組測出的結(jié)果都偏低，故可以初步判定結(jié)果的測量方式上不存在明顯問題。其次，回顧全部過程的原理，我們猜測可能存在的造成結(jié)果低的情況為：在室溫冷卻后，實(shí)驗(yàn)室沒有空余的分光光度計(jì)，排隊(duì)時(shí)間應(yīng)該是全部小組中最長的，基本花去30多分鐘。而這也導(dǎo)致了最后的顯色增強(qiáng)（其具體的顯色原因可能為物質(zhì)間的復(fù)雜反應(yīng)導(dǎo)致）從而使得最后的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率增大，導(dǎo)致測定的標(biāo)準(zhǔn)的樣品液蛋白質(zhì)含量的下降。即A<B,如圖所示：BA蛋白質(zhì)含量吸光值樣品液吸光值增色反應(yīng)增強(qiáng)后的標(biāo)準(zhǔn)曲線原本的標(biāo)準(zhǔn)曲線分光光度計(jì)的比色杯清晰不干凈，存在蒸餾水的稀釋，且稀釋的總體效果是使樣品液的含量測定下降。開始實(shí)驗(yàn)的試管清洗的不充分，可能存在

15、部分的雜質(zhì)，導(dǎo)致顯色反應(yīng)的增強(qiáng)。分光光度計(jì)的幾個(gè)比色杯透明面被碰到，影響到了液體的吸光度，吸光度的下降，使得樣品液的測定值偏低。最后，有可能在以后的時(shí)間里，可以重新做該實(shí)驗(yàn)，從多方面來驗(yàn)證自己的分析。多和老師同學(xué)交流，得到較好的結(jié)果3.4復(fù)習(xí)思考題參考資料來源：生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù) 王曉華，朱文淵主編1、試述Folin-酚試劑法的優(yōu)點(diǎn)？答：根據(jù)所學(xué)及所查知識，優(yōu)點(diǎn)總結(jié)如下： 測定蛋白質(zhì)靈敏度高，較為準(zhǔn)確，可檢測最低蛋白質(zhì)量達(dá)5，通常范圍為：在生物化學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。 操作雖受時(shí)間限定，但是只需加入兩種試劑，即可起作用，總體上說，操作簡單，原理清晰易懂。 適用性廣，除測定蛋白質(zhì)的含量，還可特定的適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。2、應(yīng)用本方法有哪些干擾作用？為什么？應(yīng)如何注意？答:對雙縮脲反應(yīng)有干擾的離子，同樣干擾Lowry反應(yīng)，且影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、Tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。