細胞免疫組化（精編版）

1、WORD格式細胞免疫組化細胞爬片的免疫組化1. 細胞爬片， 5 天后進行免疫細胞組織化學染色定。2. PBS 清洗標本3 次各 1min 。3. 冰丙酮固定15min( 或 4%多聚甲醛固定30min) 。4. 空氣干燥 5min。5. PBS清洗標本 3 次各 2min 。6. 0.5%TritonX-100(DPBS配) 孵育1 次 20min。7. PBS清洗標本 3 次各 2min 。8.3%H2O2（試劑 A）孵育 15min 。9. DPBS清洗標本 3 次各 2min。10. 封閉血清孵育（試劑B） 20min 。11. 一抗孵育（滴度1： 200，濕盒） 4過夜或 37 60m

2、in 。陰性對照最好用一抗來源血清，否則用PBS液12.PBS 清洗標本3 次各 5min 。13 . 二抗工作液孵育（濕盒試劑C） 37 30min。14 .PBS 清洗標本3 次各 5min 。15. 試劑D（濕盒）3730min 。16、PBS清洗標本3 次各5min。17、DAB顯色（避光，鏡下觀察至棕色）約310min。專業(yè)資料整理18、蒸餾水洗2 次 1min。19、蘇木素復染0.51min 。20、自來水洗返藍。21. 梯度酒精脫水75， 85， 95， 100%各 3min 。22. 二甲苯透明2 次 3min 。23、中性樹膠封片。注意事項：1、良好的細胞爬片是進行免疫組織細

3、胞的基礎，要獲得良好細胞爬片須注意以下：a 對于粘附分子較少的細胞爬片時間要達5 天以上這樣細胞爬片才較牢固沖洗時不易脫片；b 接種的細胞密度適中以2*104/ml為宜，若密度太高5 天后細胞連接成片沖洗時易脫片；2、冰丙酮固定后玻片可密閉保存于4C 冰箱，冰丙酮固定時會使細胞收縮，可用80%冰丙酮或 2%多聚甲醛固定。3、沖洗時只須輕輕振蕩培養(yǎng)皿，（不可用吸管太用力吹，易脫片）4、加一抗、二抗后沖洗時第一次須將玻片傾斜5、TritonX-100表面活性劑，脫去細胞膜中最主要的成分脂質，對于抗原表達在胞漿或胞核者方使用，對于抗原表達在 胞漿者時間要控制好，使其破壞細胞膜而核膜破壞較少。細胞爬片

4、固定后在孔板里做免疫組化還是粘到載玻片上再做？1. 如果不看熒光，兩種都可以，感覺粘好了再做要快一些， 但是做的時候要防止脫落。如果看熒光，就不能用中性樹膠粘，直接在24 孔，或 6 孔板里做才可以。中性樹膠要折光，散射的光干擾，沒辦法看細胞本身的熒光。2. 孔板里做免疫組化較方便，細胞比蓋玻片易貼壁，但染色后不能用二甲苯透明、封片（可用甘油）。細胞爬片固定后粘到載玻片上不太可能，只有開始就讓細胞貼在玻片上爬片。3. 我沒有在多孔板里做過，其實把細胞爬在蓋玻片上也不是很麻煩，偶這樣做很少掉片。先將消化好的細胞懸液滴幾滴在蓋玻片上，由于液體的表面張力，細胞懸液一般不會流淌到蓋玻片外面，等細胞大概

5、貼壁后，不同細胞貼壁時間稍有不同，大概6、7 個小時，差不多貼壁再加生長液，開始滴的細胞的數(shù)量你要摸索一下， 到固定時細胞生長到80左右比較合適。偶是在蓋玻片上做的，首先細胞要爬的勻一些，象dongwp戰(zhàn)友的就很好。然后傾去生長液沖洗、固定之后，用小鑷子或手指把玻片從六孔板拿出來。擦干蓋玻片的背面，在玻片WORD格式背面四周涂一點凡士林，粘貼于載玻片上，這一點很重要，在以后的操作里會省去蓋玻片經(jīng)常脫落麻煩。細胞爬片的保存和抗原修復問題總結1.體濃度細胞爬片可以用, 請告知 . 多謝 !含疊氮鈉PBS液保存. 但不知道具0.04-0.08%。但是我建議對于細胞爬片，還是盡量快的進行處理，以防不必

6、要的問題!2. louischenwrote:但我的細胞爬片經(jīng)過4%多聚甲醛固定，PBS沖洗后直接就放在了-20度，還能用于免疫組化嗎?!丟失3. mRNA原位雜交經(jīng)4%多聚甲醛固定 , 固定液需加DEPC水。其它建議用甲醇固定。-20 度保存4. 如果是 4%多聚甲醛固定，然后放在PBS中保存，在4度冰箱里保存兩周沒問題。時間再長就沒試過了。5. 丙酮中固定5-10 分鐘，然后風干，放置4 度保存過WORD格式夜應該是沒有問題。不要固定過夜，蛋白質固定過度，會影響抗原的暴露，影響免疫組化結果。如果是胞漿或胞核抗原出現(xiàn)假陰性結果，可考慮應用0.5%的 triton-100孵育 30 分鐘，滲透

7、細胞膜。如果玻片沒有經(jīng)過特殊處理，不要用其他抗原修復的方法，會造成掉片，我曾有過這方面的體會6. 丙酮固定后， PBS洗滌 3 次，即可保存至4 度冰箱備用。7. (1) 細胞爬片先用TBS洗 3 次，每次 5 分鐘(2)4% 多聚甲醛固定，室溫，20 分鐘(3)70%-80%-90%-95%-100%梯度酒精脫水，通風櫥內干燥，-80度保存。 2 周沒有問題的，我保存過2 個月都有信號，不過還是保存時間短一點的好8. 我的心肌細胞爬片用不同濃度的乙醇依次脫水后, 就放在室溫中 , 因為是要拍電鏡,但是學校電鏡壞了, 呵呵, 所以放了一個月后去拍, 還是很好9. 細胞爬片用4%多聚甲醛或冷丙酮

8、等固定，用PBS沖洗后，晾干，放在-20 度保存一個月沒有問題的。10. 細胞爬片，有機溶劑如4%多聚甲醛或冷丙酮等固定后，輕輕搖動玻片或培養(yǎng)皿等，靜置2min左右，棄去固定液，不用PBS洗而是采用空氣干燥，干燥后的標本可于-70 長期保存。解凍時要小心抗原破壞，應先將標本轉移于干冰預冷的固定液，然后再將混合液轉移至室溫下，固定液到達室溫時取出標本，再用PBS沖洗，在做以后的步鄹11. 我也做過細胞爬片的組化染色，不過沒有遇到類似的問題。細胞培養(yǎng)好后用PBS洗一遍，然后4%多聚甲醛 4度固定 15 分鐘，自然風干。室溫保存幾周內都可以用的。我想這可能與抗原的類型有關，有的對氧化等損傷比較敏感，

9、有的差一些。最好避光保存在4 度，同時盡量隔絕空氣。免疫熒光與普通DAB顯色差別只再二抗的標記，樣品的保存應該是沒有多大差別的。12. 細胞爬片丙酮固定后-20 度保存，現(xiàn)在要再做免疫熒光，將保存的爬片拿出37度復溫然后常規(guī)操作就可以了13. 爬片做免疫組化的優(yōu)勢在于抗原新鮮，細胞形態(tài)保存較好。若爬片需長期保存并出現(xiàn)你這樣的問題，原因可能是： 1) 試驗步驟有誤，建議重復并加陽性對照片。2) 加一抗前處理同石蠟切片，可進行抗原修復，如胰酶消化或熱修復。3) 因為抗原抗體反應在液相中進行，故對已極度干燥的爬片充分水化很重要。建議試驗前用PBS浸泡過夜。如不能解決你的問題請QQ聯(lián)系： 818256

10、45。本人在湖南省腫瘤醫(yī)院病理科( 長沙市 ) 做免疫組化。14. 4%多聚甲醛或冷丙酮固定都可以，也有用無水酒精的，固定好后放-20度，2-3 個月是沒有問題的。15. 對于一般的細胞免疫組化，我的做法是：細胞爬片用冰的純丙酮固定20MIN，再在通風柜將丙酮吹干，-20WORD格式度保存，用丙酮固定作用是沉淀蛋白質和糖，穿透性很強，保存抗原的免疫活性好。所以丙酮常用做細胞細胞爬片的固定劑。當然還是要根據(jù)你的實驗目的決定用那種固定劑。1. 多聚甲醛 ( 常用 4%)：可用于免疫電鏡; 也可用于免疫熒光染色。主要檢測組織內一些性能嬌弱的抗原特別是細胞表面抗原，例如各類淋巴細胸分化決定簇(CD)

11、、主要組織相容性抗原等2. 乙醇。優(yōu)點：穿透性強、抗原性保存較好。缺點：但醇類對低分子蛋白質、多肽及胞漿內蛋白質保存效果較差，使蛋白變性的作用輕，固定后可再溶解; 染色過程中，溫育時間長，抗原可流失而減弱反應強度3. 甲醛( 福爾馬林 ) 應用最廣優(yōu)點：形態(tài)結構保存好，且穿透性強，缺點：甲醛放置過久可氧化為甲酸，使溶液pH 降低，影響染色; 分子間交聯(lián)形成的網(wǎng)格結構可能部分或完全掩蓋某些抗原決定簇，使之不能充分暴露?？稍斐杉訇?性的染色結果。16.4 度是不能保存這么長時間(1 個月 ) 的，如果抗原已被分解，再修復也沒用!17. 棄去固定液，不用PBS洗而是采用空氣干燥，干燥后的標本可于-7

12、0 長期保存。18. 爬片置于37 度PBS中洗三次，每次3 到5 秒鐘， 然后在4%多聚甲醛中固定15 分鐘，然后再用37 度去離子水將甲醛沖干凈，注意手法輕柔，要不然掉片很厲害。同時操作過程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功盡棄。載玻片上。注意一定要等中性樹膠徹底干了之后才能做后續(xù)實驗，要不然玻片會掉下來的，就又是前功盡棄了做好的細胞爬片可以放在-20 保存?zhèn)溆茫?具體能保存多長時間不太清楚，當然盡量早用。19. 固定后放點PBS，然后放在4 度冰箱中保存，我最長保存兩個月的，然后再做免疫組化，應該沒有太大的問題的。20. 固定后 4 度可以存放一周，-20 度存放半年，我現(xiàn)在也要做這個

13、，實驗室老師教的。21. 四度放 1 周應該沒問題的，你最好放在-20 度，我在-20 度放一個月都還出結果的. 很多人作的片子很多，不可能一次作完，一個月沒問題.22. 最佳的固定及保存方法：(1) 中性緩沖福爾馬林( 不必調 pH)：馬林 (40%甲醛，用時加入過量堿式MgCO3中和 )10.0mlNa2HPO4.12H2o1.9653g NaH2PO4.2H2O0.5460g0.85%NaCl 溶液溶解，定容至100ml。(2) 細胞固定：待細胞接近長成單層時，用鑷子取出蓋玻片，迅速于37 PBS中漂洗 2 次，每次 3-5秒，以清除血清。(3) 將蓋玻片投入中性緩沖福爾馬林溶液中室溫固

14、定30min 。(4) 用鑷子取出蓋玻片，PBS漂洗 2 次，每次 3-5 秒， 晾干保存于 -20 備用?？砷L期保存，做實驗時，取出片子，入 PBS濕潤后即可進行你的實驗。(H.E.)或免疫熒光。( 本帖沒有加分 )23. 細胞爬片固定以后要放在-20 度的冰箱 .1個月內可以用.24. skywalkerzzwrote:過氧化氫處理這一步，用三蒸水稀釋商品濃度為30%的過氧化氫，然后室溫下玻片放在其中浸泡 10min ，是不是過氧化氫導致細胞嚴重脫片?/ 雙氧水，你的細胞極可能是過氧化氫導致嚴重脫片25. 本人比較喜歡用4%得多聚甲醛，20 分鐘很好用的。保存的時候注意片子最好晾干，不要擠

15、壓，防止粘片和碎裂。26. 細胞爬片固定好以后，如果要保存，我們的做法是倒掉固定液， PBS漂洗后干片保存在4 度，最長半年沒問題。27.1 、用新鮮配制的預冷的4%多聚甲醛緩沖液室溫固定15min， PBS(0.01mol/l,pH7.4)洗滌 3 遍后是否就可以進行免疫細胞化學染色了2、爬片 PBS(0.01mol/l,pH7.4)洗滌 3 遍后是否能保存，怎樣保存 ?1、洗過就可以做免疫組化了。2、固定過后自然干燥，不要洗，-20 度保存。做之前再洗。28. 細胞固定最好用丙酮或酒精，不要用4%多聚甲醛，以免抗原交聯(lián)，這樣組化時不用再抗原修復。細胞固定后可室溫保存在丙酮中，不使之干燥。2

16、9. 如果是檢測膜上的物質, 好象不能用酒精,30. 適當密度后取出固定( 丙酮 -20 固定 1020min) ，再進行免疫染色。31. 一批細胞爬片 , 如果細胞爬片是在玻璃上，冷丙酮固定15-20 分鐘，然后放 -20 度，沒有問題。24 孔板或 6 孔板里進行，冷丙酮會腐蝕板子，最好4%多聚甲醛。32. 細胞爬片用純丙酮固定10 分鐘，取出干燥后用錫紙包裹，-70 度保存。33. 4%多聚甲醛固定后PBS 水洗，自然干燥后用錫紙包裹，-20度凍存不超過1 月。34. 如果細胞貼壁困難，可將片子先用純血清掛一層，涼干后再養(yǎng)細胞。35.可以買 NUNC公司的專用細胞培養(yǎng)用蓋玻片，商品名Th

17、ermanox™Coverslips。高分子材料，耐高溫滅菌，經(jīng)過特殊表面處理，細胞容易貼附?？梢杂眉舻度我獠眉簦褂眯Ч?。果比玻璃蓋玻片效果好很多。36.我們通常是把細胞玻片固定好后，用PBS沖洗干凈，然后用酒精脫水(80%，90%，100%， 100%酒精各一次，每次10 分鐘左右 ) ，然后放在烘箱里烘干，這是就相當于石蠟切片了，可以保存一定的時間?？梢缘?。免疫細胞化學染色操作規(guī)程一、材料和1、玻片：須用免疫組化專用玻片，或用處理玻片。2%多聚賴氨酸包被2、5-10%正常山羊血清封閉液，用PBS配。3、3%牛血清白蛋白（BSA），用PBS配。WORD格式4、0.01

18、MPH7.4PBS5、1%BSA-PB（S 含 0.05%Tween20）6、AEC底物（ 1）底物緩沖液（20X） PH4.6醋酸（分子量60.6 ）30.6ml Triton-100醋酸鈉3H2O（分子量 136.1 ） 66.68 克加蒸餾水到960ml，調 PH到 4.6 ，最后加蒸餾水到總體積1000ml（ 2） AEC（ 20X）AEC15mg/m，l溶在 DMF（二甲基甲酰胺，分子式HCOH(CH3)2分子量 73.10 中）（ 3） 0.6%H2O2（ 20X）臨用時，（ 1）（ 2）（ 3）各 50ul ，在 1ml 雙蒸餾水中混勻30分鐘內有效。7、DAB（即 DAB-4H

19、CL）（ 1） 1.5 克 DAB在 100ml 水溶液中（ 20X）（ 2） 1MTris （ 20X），用 HCL調 PH到 7.4（ 1）（ 2）（ 3）各滴加入1ml 二蒸水中，新鮮配，避光， 30分鐘內有效。溶解后（可加熱到500C），加水合氯醛50 克（水合氯醛ChloralHyclrate，分子量 165.4 ），枸櫞酸1 克，充分溶解，于棕色瓶中，室溫或40C保存。8、蘇木素復染液蘇木素1 克碘酸鈉0.2 克鉀礬50 克水1000ml9、含10%及2%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液。10、3%H2O：2 30%H2O21 份，加9 份雙蒸水，臨用時配。11、細胞抗原玻片及96 孔細胞

20、抗原板（見ICCprotocol04）12、封片液：1 克明膠，溶于30ml350C水中，加入35ml甘油（或用甘油封片）和650mg石碳酸（先溶于二、細胞內源過氧化物酶阻斷（使用0.6ml水中）。HRP標記二抗或SP法時必須阻斷）1、從冰箱取出細胞片或細胞板，置室溫或370C10-15分鐘，使恢復溫度。2、加 3%H2O，2 細胞片 20ul/孔，培養(yǎng)板100ul/孔，使充分覆蓋住細胞。3、室溫 10 分鐘后，甩掉H2O2，用 PBS輕輕淋洗 2 分鐘。用濾紙吸干細胞周圍水份，96 孔在濾水紙上扣干，但注意保持細胞濕潤。三、封閉細胞片用5-10%正常山羊血清（20ml/ 孔），細胞板用2-5

21、%BSA（ PBS 配制） 100ul/孔，置 370C孵育 30 分鐘后甩掉封閉液，不洗。四、免疫化學染色1、分別加一抗和所有對照一抗，細胞法10-20ul/孔，細胞板50ul/孔，使充分覆蓋細胞。371 小時或 4冰箱過夜；2、棄去一抗，如為細胞涂片用PBST輕輕簡單淋洗1 次后， 浸于 100mL含 PBST洗杯，漂洗（最好在慢速搖床上）3-5分鐘，轉入第二杯PBS（1000ml），如上法漂洗 3-5分鐘。擦干細胞片周圍水分，96 孔板則倒掉一抗后，每孔加滿PBST在搖床上搖洗3-5 分鐘后倒掉，在濾紙上扣干，但保持細胞濕潤，反復3-4 次；3、加 S.P （ S.P 法，即放大法）（

22、1）加已優(yōu)選好的濃度的Biotin標記二抗，細胞片10ul/孔，細胞板50ul/孔，使充分復蓋細胞。 37溫和孵育30 分鐘；（ 2）按免疫化學染色“2” 所述方法洗滌和擦干；（ 3）加已優(yōu)選好濃度的S.P，用量同 “ （ 1） ” ，37孵育 30 分鐘后按免疫化學染色“2” 法洗滌及擦干；4、間接法加二抗（不放大法）方法同 S.P 法，但不用Biotin標記二抗，而改用HRP直接標記二抗。并省略（3）步驟；5、加底物顯色（ 1）、加足量的AEC顯色液，充分覆蓋細胞層，細胞

23、玻片20ul/孔，板 50ul/孔，置于37恒溫箱孵育5-10 分鐘，一般在顯微鏡下根據(jù)結果顏色的呈現(xiàn)情況掌握染色時間，以得到滿意的結果（陽性對照顯色程度為“+”），用自來水即可終止反應；（ 2）、復染：蘇木素染液（使用時間最好不超過兩個月）加蘇木素復染液1-2 滴， 1分鐘左右，在自來水龍頭下輕輕沖洗掉蘇木素，再浸于PBS中約 30 秒鐘返藍色，最后在蒸餾水中漂洗。6、封片洗后細胞片擦去周圍水分，滴加1 滴甘油明膠封片液，加蓋玻片，除去氣泡，用指甲油或樹膠封固玻片。五、結果判斷KSHV陽性誘導后BCBL-1 細胞有 10%-30%顯紅色，強度不一，未誘導BCBL-1 陽性細胞（ 1-30%）陰性誘導和未誘導BCBL-1 細胞完全不顯色（排除邊緣效應）MCMV/HVMV陽性感染病毒的細胞有病灶反應，顯紅色，強度不一，未感染細胞不顯