RT-PCR檢測血細胞中p53基因的表達

1、P53基因P53基因命名該基因編碼一種分子量為53kDa的蛋白質(zhì)功能作用重要的抑癌基因，防止癌變細胞基因的修復功能RT-PCRRT-PCR(反轉錄PCR技術) RNA的反轉錄（reverse transcription ）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結合的技術。在GenBank中查找p53基因設計引物確定參數(shù)檢測p53基因在血細胞中的表達反轉錄的引物基因表達的檢測方法Ques在蛋白質(zhì)水平基因檢測的方法在DNA水平在MRNA水平Northern印記雜交RT-PCR.Reverse Transcription PCR RNA提取cDNA反轉錄反轉錄PCRNorthern 印記雜交Nort

2、hern印記雜交印記雜交基因表達水平隨機六核苷酸引隨機六核苷酸引物引導物引導Oligo(dT)引導引導特異性引導特異性引導Ques反轉錄酶逆轉錄酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒體內(nèi)的依賴RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三種活性：(1)依賴RNA的DNA聚合酶活性：以RNA為模板合成cDNA第一條鏈；(2)Rnase水解活性：水解RNA:DNA雜合體中的RNA；(3)依賴DNA的DNA聚合酶活性：以第一條DNA鏈為模板合成互補 的雙鏈cDNA.反轉錄可用的引物010305 Oligo(dT)：是一種對mRNA特異的方法。因絕大多數(shù)真核細胞mRNA具有3端Pol

3、y(A )尾，此引物與其配對，僅mRNA可被轉錄。 隨機六聚體引物隨機六聚體引物：用此種方法時，體系中所有：用此種方法時，體系中所有RNA分分子全部充當了子全部充當了cDNA第一鏈模板，第一鏈模板，PCR引物在擴增過程引物在擴增過程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中中96%來源于來源于rRNA。特異性引物特異性引物：用含目標：用含目標RNA的互補序列的寡核苷酸作為的互補序列的寡核苷酸作為引物，用此類引物僅產(chǎn)生所需要的引物，用此類引物僅產(chǎn)生所需要的cDNA，導致更為特，導致更為特異的異的PCR擴增。擴增。Ques查找P53序列使用GENBA

4、NK，P53登陸號AH007667/genbank查找P53序列查找P53序列查找P53序列引物設計的原則15263748引物應用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設計引物應用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設計并具有特異性并具有特異性產(chǎn)物不能形成二級結構產(chǎn)物不能形成二級結構引物長度一般在引物長度一般在1530堿基之間堿基之間G+C含量在含量在40%60%之間之間堿基要隨機分布堿基要隨機分布引物自身及之間不能有連續(xù)引物自身及之間不能有連續(xù)4個堿個堿基的互補基的互補引物引物5端可以修飾端可以修飾引物引物3端不可修飾端不可修飾引物引物3端要避開密碼子的第端要避開密碼子的第3位位Q

5、ues引物設計PRIMER PREMIER 5.0Primer Premier5.0是由加拿大的是由加拿大的Premier公司開發(fā)的專業(yè)用于公司開發(fā)的專業(yè)用于PCR或測序或測序引物以及雜交探針的設計、評估的軟件，其主要界面分為序列編輯窗引物以及雜交探針的設計、評估的軟件，其主要界面分為序列編輯窗口（口（Genetank），引物設計窗口（），引物設計窗口（Primer Design），酶切分析窗口（），酶切分析窗口（Restriction Sites）和紋基分析窗口（）和紋基分析窗口（Motif），這里我們主要介紹其引），這里我們主要介紹其引物設計功能。物設計功能。引物設計1啟動界面啟動界面引物

6、設計2在此輸入需擴增的DNA序列引物設計3引物設計4引物設計5引物設計6引物設計7引物設計8Hairpin：發(fā)夾結構：發(fā)夾結構Dimer：二聚體：二聚體False Priming：錯配：錯配Cross Dimer：交叉二聚體：交叉二聚體引物設計9引物設計10引物設計11保存保存選擇滿意的引物選擇滿意的引物引物設計12所選引物所選引物確定參數(shù)cDNA size:434bp94度 30秒變性155度 45秒退火273度 60秒延伸327次循環(huán)4確定參數(shù)四項參數(shù)循環(huán)次數(shù)退火延伸變性模板DNA由雙鏈變成單鏈，有利于與引物結合?？筛鶕?jù)模板的復雜程度調(diào)整變性溫度和時間，一般情況下94 C 30秒可使各種復雜的DNA分子完全變性。變性的DNA快速冷卻至4060 C可使引物和模板DNA發(fā)生結合。可根據(jù)引物的長度和GC的含量選擇復性溫度一般是7075 C，此時Taq DNA聚合酶活性最高。1kb的可適當延長時間。理論上2025個循環(huán)PCR產(chǎn)物的累計即可達到最大值、實際操作中2530較合理。確定參數(shù)退火溫度：5054Ques檢測基因的表達 根據(jù)產(chǎn)物長度制作適宜濃度的瓊脂糖凝膠，取適量PCR產(chǎn)物，加上樣緩沖液充分混合，點樣于事先做好的瓊脂糖凝膠點樣孔中，10V/cm電泳4560min。成像系統(tǒng)成像分析。瓊