第一章生物大分子的制備

1、生物大分子物質(zhì)的制備生物大分子物質(zhì)的制備第二節(jié) 材料的選擇與處理制備的一般過(guò)程和原則制備的一般過(guò)程和原則注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)確立有效成分的測(cè)定方法確立有效成分的測(cè)定方法材料的選擇和預(yù)處理材料的選擇和預(yù)處理細(xì)胞的破碎和細(xì)胞組分分離細(xì)胞的破碎和細(xì)胞組分分離有效成分的抽提有效成分的抽提有效成分的純化和濃縮有效成分的純化和濃縮層析法層析法 電泳法電泳法 超離心法超離心法 透析和超濾透析和超濾鹽析（鹽析（硫酸銨鹽析硫酸銨鹽析）等電等電點(diǎn)點(diǎn)沉淀沉淀有機(jī)溶劑沉淀有機(jī)溶劑沉淀離心離心前處理前處理 粗分級(jí)粗分級(jí) 細(xì)分級(jí)細(xì)分級(jí) 材料選擇與處理材料選擇與處理細(xì)胞破碎（機(jī)械破細(xì)胞破碎（機(jī)械破碎、溶賬和自溶、碎、溶賬和自溶

2、、酶解、化學(xué)處理）酶解、化學(xué)處理）生物組織生物組織 提取液提取液 粗產(chǎn)品粗產(chǎn)品結(jié)晶結(jié)晶分子大小分子大小溶解度溶解度電荷性質(zhì)電荷性質(zhì)吸附性質(zhì)吸附性質(zhì)生物親和力生物親和力依據(jù)原理依據(jù)原理控制適當(dāng)?shù)目刂七m當(dāng)?shù)膒H控制低溫控制低溫注意提取過(guò)程中的溶液環(huán)境注意提取過(guò)程中的溶液環(huán)境防止提純過(guò)程中丟失一些輔助因子或亞防止提純過(guò)程中丟失一些輔助因子或亞 基基基本原則：防止生物分子變性、降解基本原則：防止生物分子變性、降解一一. .選擇材料及預(yù)處理選擇材料及預(yù)處理 l 動(dòng)物，植物，微生物都可作為制備生物大分子的原材料，所動(dòng)物，植物，微生物都可作為制備生物大分子的原材料，所選用的材料主要依據(jù)試驗(yàn)?zāi)康膩?lái)確定。選用的

3、材料主要依據(jù)試驗(yàn)?zāi)康膩?lái)確定。l 有效成份有效成份是指欲純化的某種單一的生命大分子物質(zhì)。而有效是指欲純化的某種單一的生命大分子物質(zhì)。而有效成分以外的其它物質(zhì)則統(tǒng)稱雜質(zhì)。成分以外的其它物質(zhì)則統(tǒng)稱雜質(zhì)。l 在動(dòng)、植物和微生物材料中，有效成分的含量一般較少。如在動(dòng)、植物和微生物材料中，有效成分的含量一般較少。如胰臟中胰島素的含量小于其鮮重的百萬(wàn)分之一；穩(wěn)定性較差，胰臟中胰島素的含量小于其鮮重的百萬(wàn)分之一；穩(wěn)定性較差，大多數(shù)對(duì)酸、堿、高溫和高濃度有機(jī)溶劑等因子較敏感；易大多數(shù)對(duì)酸、堿、高溫和高濃度有機(jī)溶劑等因子較敏感；易被微生物分解變質(zhì)。被微生物分解變質(zhì)。l 總的來(lái)說(shuō)，材料選擇應(yīng)遵循的原則是，總的來(lái)說(shuō)，

4、材料選擇應(yīng)遵循的原則是，有效成分含量多、穩(wěn)有效成分含量多、穩(wěn)定性好；來(lái)源豐富、保持新鮮；提取工藝簡(jiǎn)單、有綜合利用定性好；來(lái)源豐富、保持新鮮；提取工藝簡(jiǎn)單、有綜合利用價(jià)值等。價(jià)值等。 1.1.動(dòng)物組織：動(dòng)物組織： 選材選材：必須選擇有效成分含量豐富且易分離的臟器組織為：必須選擇有效成分含量豐富且易分離的臟器組織為原材料。如磷酸單酯酶，從含量看，雖然在胰臟、肝臟和原材料。如磷酸單酯酶，從含量看，雖然在胰臟、肝臟和脾臟中較豐富，但是因其與磷酸二酯酶共存，進(jìn)行提純時(shí)，脾臟中較豐富，但是因其與磷酸二酯酶共存，進(jìn)行提純時(shí)，這兩種酶很難分開(kāi)。所以實(shí)踐中常選用含磷酸單酯酶少，這兩種酶很難分開(kāi)。所以實(shí)踐中常選用

5、含磷酸單酯酶少，但幾乎不含磷酸二酯酶的前列腺作材料。但幾乎不含磷酸二酯酶的前列腺作材料。 脫脂脫脂：臟器中含量較高的脂肪，容易氧化酸敗，導(dǎo)致原料：臟器中含量較高的脂肪，容易氧化酸敗，導(dǎo)致原料變質(zhì)影響純度操作和制品得率。常用的脫脂方法有：人工變質(zhì)影響純度操作和制品得率。常用的脫脂方法有：人工剝?nèi)ヅK器外的脂肪組織；浸泡在脂溶性的有機(jī)溶劑（丙酮，剝?nèi)ヅK器外的脂肪組織；浸泡在脂溶性的有機(jī)溶劑（丙酮，乙醚）中脫脂；采用快速加熱（乙醚）中脫脂；采用快速加熱（5050左右），快速冷卻的左右），快速冷卻的方法，使溶化的油滴冷卻后凝聚成油塊而被除去。方法，使溶化的油滴冷卻后凝聚成油塊而被除去。 保存保存：對(duì)預(yù)處

6、理好的材料，若不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，應(yīng)冷凍保：對(duì)預(yù)處理好的材料，若不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，應(yīng)冷凍保存。存。 a a. .冰凍冰凍：剝?nèi)ブ竞徒钇さ冉Y(jié)締組織，短期保存：剝?nèi)ブ竞徒钇さ冉Y(jié)締組織，短期保存：1010的冰箱內(nèi)；長(zhǎng)期保存：的冰箱內(nèi)；長(zhǎng)期保存：7070低溫冰箱內(nèi)。低溫冰箱內(nèi)。 b.b.干燥干燥：對(duì)于像腦垂體一類(lèi)小組織，可置丙酮液中：對(duì)于像腦垂體一類(lèi)小組織，可置丙酮液中脫水，干燥后磨粉儲(chǔ)存?zhèn)溆?；?duì)于含耐高溫有效成分（如：脫水，干燥后磨粉儲(chǔ)存?zhèn)溆?；?duì)于含耐高溫有效成分（如：肝素）的腸粘膜，可在沸水蒸煮處理，烘干后能長(zhǎng)期保存。肝素）的腸粘膜，可在沸水蒸煮處理，烘干后能長(zhǎng)期保存。 冰箱的除霜冰箱的除霜循環(huán)循環(huán)

7、，可能，可能對(duì)細(xì)胞對(duì)細(xì)胞造成造成傷害傷害，要特別小，要特別小心。心。解凍時(shí)解凍時(shí)要越快越好，但避免局部要越快越好，但避免局部過(guò)熱過(guò)熱。2.2.植物材料：植物材料： 選材選材：注意植物品種和生長(zhǎng)發(fā)育狀況不同，其中所含生：注意植物品種和生長(zhǎng)發(fā)育狀況不同，其中所含生物大分子的量變化很大，另外與季節(jié)性關(guān)系密切。種子物大分子的量變化很大，另外與季節(jié)性關(guān)系密切。種子須泡脹或粉碎才可使用。含油脂較多的也要進(jìn)行脫脂處須泡脹或粉碎才可使用。含油脂較多的也要進(jìn)行脫脂處理。理。 a.a.提取核提取核DNADNA：選用黃化苗（生長(zhǎng)：選用黃化苗（生長(zhǎng)7 71010天小麥，水天小麥，水稻），防止葉綠體稻），防止葉綠體DN

8、ADNA的干擾的干擾 b.b.提取提取RNARNA：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x用生長(zhǎng)幼嫩組織為好。：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x用生長(zhǎng)幼嫩組織為好。 保存保存：冷凍采樣后盡快放于：冷凍采樣后盡快放于420420冰箱內(nèi)。冰箱內(nèi)。 DNA,RNA DNA,RNA 采樣后，采樣后，N N2 2速凍，至速凍，至7070冰箱。對(duì)冰箱。對(duì)RNARNA樣，如樣，如不立即使用，冷凍保存尤為重要。不立即使用，冷凍保存尤為重要。3.3.微生物：微生物： 選材選材：應(yīng)注意它的生長(zhǎng)期，在微生物的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，酶和：應(yīng)注意它的生長(zhǎng)期，在微生物的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，酶和核酸的含量較高，可以獲得高產(chǎn)量，以微生物為材料時(shí)有核酸的含量較高，可以獲得高產(chǎn)量，以微生

9、物為材料時(shí)有兩種情況：兩種情況： a.a.利用微生物菌體分泌到培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物和胞外利用微生物菌體分泌到培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物和胞外酶等。一般用離心法收集上清液，上清液只能在低溫下短酶等。一般用離心法收集上清液，上清液只能在低溫下短期保存期保存 b.b.利用菌體含有的生化物質(zhì)，如：蛋白質(zhì)，核酸和胞利用菌體含有的生化物質(zhì)，如：蛋白質(zhì)，核酸和胞內(nèi)酶等。需破碎菌體細(xì)胞分離，濕菌體可低溫短期保存，內(nèi)酶等。需破碎菌體細(xì)胞分離，濕菌體可低溫短期保存，凍干粉可在凍干粉可在44保存數(shù)月。保存數(shù)月。 3.3. 有效成分在原材料中含量較低，純化是使其純度有效成分在原材料中含量較低，純化是使其純度增高的過(guò)程，因此，提

10、取和分離的每個(gè)步驟均要測(cè)定增高的過(guò)程，因此，提取和分離的每個(gè)步驟均要測(cè)定有效成分的含量有效成分的含量. .。n測(cè)定方法要求測(cè)定方法要求: : 專(zhuān)一、準(zhǔn)確、靈敏和簡(jiǎn)便專(zhuān)一、準(zhǔn)確、靈敏和簡(jiǎn)便。n使用較多的測(cè)定方法有使用較多的測(cè)定方法有光譜法光譜法（包括紫外光譜法、（包括紫外光譜法、可見(jiàn)光光可見(jiàn)光光譜法、譜法、熒光光譜法等）熒光光譜法等） 、生物活性、生物活性( (如酶活力、激素活性如酶活力、激素活性) )測(cè)測(cè)定、電泳分析等，有時(shí)可用電化學(xué)法和免疫分析法。定、電泳分析等，有時(shí)可用電化學(xué)法和免疫分析法。不同的生物體細(xì)胞破碎的難易不一，使用的方法也不相同，不同的生物體細(xì)胞破碎的難易不一，使用的方法也不相

11、同，如動(dòng)物臟器的細(xì)胞膜較脆弱，容易破碎。植物和微生物由于如動(dòng)物臟器的細(xì)胞膜較脆弱，容易破碎。植物和微生物由于具有較堅(jiān)固的纖維素、半纖維素組成的細(xì)胞壁，要采取專(zhuān)門(mén)具有較堅(jiān)固的纖維素、半纖維素組成的細(xì)胞壁，要采取專(zhuān)門(mén)的細(xì)胞破碎方法。的細(xì)胞破碎方法。常用方法：常用方法：細(xì)胞結(jié)構(gòu)：細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和核區(qū)。細(xì)胞結(jié)構(gòu)：細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和核區(qū)。所要物質(zhì)可存在細(xì)胞外（胞外酶）和細(xì)胞內(nèi)（胞內(nèi)酶）所要物質(zhì)可存在細(xì)胞外（胞外酶）和細(xì)胞內(nèi)（胞內(nèi)酶）用脂溶性的溶劑用脂溶性的溶劑( (如丙酮、氯仿、甲苯如丙酮、氯仿、甲苯) )或表面活性劑或表面活性劑( (如十二烷基磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉如十二烷基磺酸鈉、十二

12、烷基硫酸鈉) ) 處理細(xì)胞時(shí)，可將處理細(xì)胞時(shí)，可將細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)部分溶解，進(jìn)而使細(xì)胞釋放出各種酶細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)部分溶解，進(jìn)而使細(xì)胞釋放出各種酶類(lèi)或類(lèi)或DNADNA等物質(zhì)，并導(dǎo)致整個(gè)細(xì)胞破碎。等物質(zhì)，并導(dǎo)致整個(gè)細(xì)胞破碎。 生物酶生物酶( (如如溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶) )有降解細(xì)菌細(xì)胞壁有降解細(xì)菌細(xì)胞壁的功能。在用此法處理細(xì)菌細(xì)胞時(shí)，先是細(xì)胞壁消解，隨之而的功能。在用此法處理細(xì)菌細(xì)胞時(shí)，先是細(xì)胞壁消解，隨之而來(lái)的是因滲透壓差引起的細(xì)胞膜破裂，最后導(dǎo)致細(xì)胞完全破碎。來(lái)的是因滲透壓差引起的細(xì)胞膜破裂，最后導(dǎo)致細(xì)胞完全破碎。 例如：例如：從某些細(xì)菌細(xì)胞提取質(zhì)粒從某

13、些細(xì)菌細(xì)胞提取質(zhì)粒DNADNA時(shí)，不少方法都采用了加時(shí)，不少方法都采用了加溶菌酶溶菌酶( (來(lái)自蛋清來(lái)自蛋清) )破壞細(xì)胞壁的步驟。當(dāng)有些細(xì)菌對(duì)溶菌酶不破壞細(xì)胞壁的步驟。當(dāng)有些細(xì)菌對(duì)溶菌酶不敏感時(shí)，可加巰基乙醇（敏感時(shí)，可加巰基乙醇（MEME）或者）或者8mol/L8mol/L的尿素，以促進(jìn)細(xì)胞的尿素，以促進(jìn)細(xì)胞壁的消化。另外，也可加入蛋白酶壁的消化。另外，也可加入蛋白酶K K來(lái)提高破壁效果。來(lái)提高破壁效果。 而在破壞酵母菌的細(xì)胞時(shí)，可采用蝸牛酶進(jìn)行。一般對(duì)數(shù)而在破壞酵母菌的細(xì)胞時(shí)，可采用蝸牛酶進(jìn)行。一般對(duì)數(shù)期的酵母細(xì)胞對(duì)該酶較敏感。將酵母細(xì)胞懸于期的酵母細(xì)胞對(duì)該酶較敏感。將酵母細(xì)胞懸于0.1

14、mol/L0.1mol/L檸檬酸檸檬酸/ /磷酸氫二鈉緩沖液磷酸氫二鈉緩沖液(pH5.4)(pH5.4)中，加入中，加入1%1%蝸牛酶，蝸牛酶， 在在3030處理處理3030分鐘，即可使大部分細(xì)胞壁破裂，如同時(shí)加入分鐘，即可使大部分細(xì)胞壁破裂，如同時(shí)加入0.2%0.2%巰基乙醇巰基乙醇效果更好。效果更好。 四、四、 生物酶降解法生物酶降解法 大部分蛋白質(zhì)都可溶于水、稀鹽、稀酸或堿溶液，少數(shù)大部分蛋白質(zhì)都可溶于水、稀鹽、稀酸或堿溶液，少數(shù)與脂類(lèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)則溶于乙醇、丙酮、丁醇等有機(jī)溶劑中與脂類(lèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)則溶于乙醇、丙酮、丁醇等有機(jī)溶劑中稀鹽溶液和緩沖液對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性好，溶解度大，是提稀鹽溶

15、液和緩沖液對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性好，溶解度大，是提取蛋白質(zhì)和酶最常用的溶劑。取蛋白質(zhì)和酶最常用的溶劑。 在抽提階段，在抽提階段，pH值、金屬離子、溶劑的濃度和極性值、金屬離子、溶劑的濃度和極性等等因子，可明顯影響有效成分的性質(zhì)和數(shù)量。因此選擇抽提液因子，可明顯影響有效成分的性質(zhì)和數(shù)量。因此選擇抽提液必須考慮這些因素。必須考慮這些因素。1、溶劑的極性和離子強(qiáng)度：、溶劑的極性和離子強(qiáng)度： 有些生物大分子在極性大、離子強(qiáng)度高的溶液中穩(wěn)定；有些有些生物大分子在極性大、離子強(qiáng)度高的溶液中穩(wěn)定；有些則在極性小、離子強(qiáng)度低的溶液中穩(wěn)定。例如提取刀豆球蛋則在極性小、離子強(qiáng)度低的溶液中穩(wěn)定。例如提取刀豆球蛋白白A時(shí)，

16、用時(shí)，用0.15mol/L甚至更高濃度的甚至更高濃度的NaCl溶液，都可使其從溶液，都可使其從刀豆粉中溶解出來(lái)，穩(wěn)定存在。而抽提脾磷酸二酯酶時(shí)，則刀豆粉中溶解出來(lái)，穩(wěn)定存在。而抽提脾磷酸二酯酶時(shí)，則需用需用0.2 mol/L蔗糖水溶液。蔗糖水溶液。 一種物質(zhì)溶解度大小與溶劑性質(zhì)密切相關(guān)（相似相溶原理）；一種物質(zhì)溶解度大小與溶劑性質(zhì)密切相關(guān)（相似相溶原理）；離子強(qiáng)度通過(guò)影響溶質(zhì)的帶電性也影響溶質(zhì)的溶解度。降低離子強(qiáng)度通過(guò)影響溶質(zhì)的帶電性也影響溶質(zhì)的溶解度。降低極性：在水溶液中加蔗糖，甘油，二甲亞砜，二甲基甲酰氨。極性：在水溶液中加蔗糖，甘油，二甲亞砜，二甲基甲酰氨。提高離子強(qiáng)度方法：在水溶液中加

17、中性鹽（提高離子強(qiáng)度方法：在水溶液中加中性鹽（KCl,NaClKCl,NaCl, , NHNH4 4Cl,(NHCl,(NH4 4) )2 2SOSO4 4）。一般離子強(qiáng)度較低的中性鹽溶液可促）。一般離子強(qiáng)度較低的中性鹽溶液可促進(jìn)蛋白溶解（鹽溶），保護(hù)蛋白質(zhì)活性；高離子強(qiáng)度的中進(jìn)蛋白溶解（鹽溶），保護(hù)蛋白質(zhì)活性；高離子強(qiáng)度的中性鹽可引起蛋白質(zhì)沉淀，發(fā)生鹽析作用。性鹽可引起蛋白質(zhì)沉淀，發(fā)生鹽析作用。高離子強(qiáng)度使高離子強(qiáng)度使DNADNA溶解度增加；低離子強(qiáng)度使溶解度增加；低離子強(qiáng)度使RNARNA溶解度增溶解度增加（核酸分離依據(jù)）。加（核酸分離依據(jù)）。常用的鹽溶液是常用的鹽溶液是NaClNaCl溶液

18、，濃度以溶液，濃度以0.15mol/L0.15mol/L為宜。但是為宜。但是在提取核蛋白或細(xì)胞器中的蛋白質(zhì)時(shí)，為促使蛋白質(zhì)與核在提取核蛋白或細(xì)胞器中的蛋白質(zhì)時(shí)，為促使蛋白質(zhì)與核酸、蛋白質(zhì)與細(xì)胞酸、蛋白質(zhì)與細(xì)胞器分離，則宜用高濃度器分離，則宜用高濃度(0.5-2.0mol/L)(0.5-2.0mol/L)的鹽溶液。的鹽溶液。 蛋白質(zhì)、酶與核酸的溶解度和穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)、酶與核酸的溶解度和穩(wěn)定性與pH值有關(guān)。值有關(guān)。過(guò)酸、過(guò)堿均應(yīng)盡量避免，一般控制在過(guò)酸、過(guò)堿均應(yīng)盡量避免，一般控制在pH=68范圍內(nèi)范圍內(nèi).但有時(shí)根據(jù)情況而定，例如肝素在酸范圍不穩(wěn)定而且不易但有時(shí)根據(jù)情況而定，例如肝素在酸范圍不穩(wěn)定而

19、且不易與脂蛋白分開(kāi)，才采用與脂蛋白分開(kāi)，才采用pH10.5-11的高堿性溶液提取。的高堿性溶液提取。 4 4、水解酶、水解酶 細(xì)胞破裂后，許多水解酶釋放出來(lái)。水解酶與欲抽提細(xì)胞破裂后，許多水解酶釋放出來(lái)。水解酶與欲抽提的蛋白質(zhì)或核酸接觸時(shí)，一旦條件適宜，就會(huì)發(fā)生反應(yīng)，的蛋白質(zhì)或核酸接觸時(shí)，一旦條件適宜，就會(huì)發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)或核酸分解，而使實(shí)驗(yàn)失敗。為此，必須采用導(dǎo)致蛋白質(zhì)或核酸分解，而使實(shí)驗(yàn)失敗。為此，必須采用加入加入抑制劑、調(diào)節(jié)抽提液的抑制劑、調(diào)節(jié)抽提液的pHpH、離子濃度或極性、離子濃度或極性等方法，等方法，使這些酶喪失活性。使這些酶喪失活性。 如：提取，純化胰島素時(shí)，為阻止胰蛋白酶活

20、化，采如：提取，純化胰島素時(shí)，為阻止胰蛋白酶活化，采用用6868的乙醇溶液（的乙醇溶液（pH2.5-3.0,pH2.5-3.0,用草酸調(diào)節(jié)），在用草酸調(diào)節(jié)），在13131515抽提抽提3h3h，可得到較高的回收率。因?yàn)椋傻玫捷^高的回收率。因?yàn)?868乙醇可使胰乙醇可使胰蛋白酶暫時(shí)失活，草酸可除去蛋白酶的激活劑蛋白酶暫時(shí)失活，草酸可除去蛋白酶的激活劑CaCa2+2+，酸性環(huán)，酸性環(huán)境也抑制酶蛋白活性。境也抑制酶蛋白活性。 RNARNA提取需防止提取需防止RNaseRNase的水解作用，的水解作用，RNaseRNase活性很高，很活性很高，很容易使容易使RNARNA降解，所以每一步都嚴(yán)格控制降解

21、，所以每一步都嚴(yán)格控制RNaseRNase，可采用，可采用DEPCDEPC（焦碳酸二乙脂）處理，帶手套操作，提取液中加強(qiáng)（焦碳酸二乙脂）處理，帶手套操作，提取液中加強(qiáng)的變性劑異硫氰酸胍等措施。的變性劑異硫氰酸胍等措施。 5 5、攪拌、攪拌 攪拌能促使欲抽提物與抽提液的接觸，并能增加溶解度。攪拌能促使欲抽提物與抽提液的接觸，并能增加溶解度。但是，一般宜采用溫和的攪拌方法但是，一般宜采用溫和的攪拌方法 ，速度太快時(shí)容易產(chǎn)生，速度太快時(shí)容易產(chǎn)生泡沫，導(dǎo)致某些酶類(lèi)變性失活。泡沫，導(dǎo)致某些酶類(lèi)變性失活。6 6、氧化、氧化 一般蛋白質(zhì)都含相當(dāng)數(shù)量的巰基，該基團(tuán)常常是酶和蛋一般蛋白質(zhì)都含相當(dāng)數(shù)量的巰基，該基

22、團(tuán)常常是酶和蛋白質(zhì)的必須基團(tuán)，若抽提液中存在氧化劑或氧分子時(shí)，會(huì)使白質(zhì)的必須基團(tuán)，若抽提液中存在氧化劑或氧分子時(shí)，會(huì)使巰基形成分子內(nèi)或分子間的二硫鍵，導(dǎo)致酶巰基形成分子內(nèi)或分子間的二硫鍵，導(dǎo)致酶( (或蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)) )失活失活( (或變性或變性) )。在提取液中加入。在提取液中加入巰基乙醇，半胱氨酸，維巰基乙醇，半胱氨酸，維C C，二，二硫蘇糖醇，還原性谷胱甘肽硫蘇糖醇，還原性谷胱甘肽等還原劑，可防止巰基發(fā)生氧化，等還原劑，可防止巰基發(fā)生氧化，使蛋白酶失活。使蛋白酶失活。7 7、金屬離子、金屬離子 蛋白質(zhì)的巰基除易受氧化劑作用外，還能和金屬離子蛋白質(zhì)的巰基除易受氧化劑作用外，還能和金屬離子

23、如鉛、鐵或銅作用，產(chǎn)生沉淀復(fù)合物。如鉛、鐵或銅作用，產(chǎn)生沉淀復(fù)合物。 這些金屬離子主這些金屬離子主要來(lái)源于制備緩沖液的試劑中。解決的辦法：要來(lái)源于制備緩沖液的試劑中。解決的辦法：用無(wú)離子用無(wú)離子水或重蒸水配制試劑；水或重蒸水配制試劑；在配制的試劑中加入在配制的試劑中加入1-3mmol/L1-3mmol/L的的EDTA(EDTA(金屬離子絡(luò)合劑金屬離子絡(luò)合劑) )。 8 8、抽提液與抽提物的比例、抽提液與抽提物的比例 在抽提時(shí)，抽提液與抽提物的比例要適當(dāng)，一般以在抽提時(shí)，抽提液與抽提物的比例要適當(dāng)，一般以5151為宜。如抽提液過(guò)多，則有利于有效成分的提取，但為宜。如抽提液過(guò)多，則有利于有效成分的

24、提取，但不利于純化工序的進(jìn)行。不利于純化工序的進(jìn)行。濾膜濾膜抽氣抽氣濾膜濾膜離心離心AB 利用壓力、抽濾（利用壓力、抽濾（A）或離心力）或離心力（B）等多種形式，強(qiáng)行使水和其它）等多種形式，強(qiáng)行使水和其它小分子溶質(zhì)通過(guò)半透膜，而蛋白質(zhì)小分子溶質(zhì)通過(guò)半透膜，而蛋白質(zhì)被截留在膜上，以達(dá)到濃縮和脫鹽被截留在膜上，以達(dá)到濃縮和脫鹽目的。濾膜有多種規(guī)格，可選擇性目的。濾膜有多種規(guī)格，可選擇性的截留相對(duì)分子量不同的蛋白質(zhì)。的截留相對(duì)分子量不同的蛋白質(zhì)。 為了避免被膜截留的蛋白質(zhì)在膜為了避免被膜截留的蛋白質(zhì)在膜表面上堆積，現(xiàn)常用表面上堆積，現(xiàn)常用截向流過(guò)濾截向流過(guò)濾的的方法，即液體在泵驅(qū)動(dòng)下沿著與膜方法，即

25、液體在泵驅(qū)動(dòng)下沿著與膜表面相切方向流動(dòng)，在膜上形成壓表面相切方向流動(dòng)，在膜上形成壓力，使部分液體透過(guò)膜，而另一部力，使部分液體透過(guò)膜，而另一部分液體切向地流過(guò)表面將被膜截留分液體切向地流過(guò)表面將被膜截留的蛋白質(zhì)分子沖走。的蛋白質(zhì)分子沖走。半透膜袋半透膜袋蛋白質(zhì)溶液蛋白質(zhì)溶液透析液透析液磁棒磁棒 磁力攪拌器磁力攪拌器 透析是利用蛋白質(zhì)等大分子不透析是利用蛋白質(zhì)等大分子不能通過(guò)半透膜的性質(zhì)，使蛋白質(zhì)能通過(guò)半透膜的性質(zhì)，使蛋白質(zhì)和其它小分子物質(zhì)如無(wú)機(jī)鹽單糖和其它小分子物質(zhì)如無(wú)機(jī)鹽單糖等分開(kāi)。常用的半透膜：等分開(kāi)。常用的半透膜： 玻璃紙（賽璐玢紙，玻璃紙（賽璐玢紙，cellophane paper） 火綿紙（賽璐玎紙火綿紙（賽璐玎紙, celloidin paper） 其他改型纖維素材料其他改型纖維素材料樣品不起泡，不暴沸。樣品不起泡，不暴沸。得到的干粉樣品不粘壁，易取出。得到的干粉樣品不粘壁，易取出。冰干后的樣品是疏松的粉末，易溶于水。冰干后的樣品是疏松的粉末，易溶于水。 樣品要溶于水，不含有機(jī)溶劑，否則冰點(diǎn)降低，樣品樣品要溶于水，不含有機(jī)溶劑，否則冰點(diǎn)降低，樣品易融化，起大量泡沫，使樣品變性，污染真空泵油。易融化，起大量泡沫，使樣品變性，污染真空泵油。 樣品要予先脫