載體構建流程

1、一、簡介慢病毒（ Lentivirus）載體 是以 HIV-1 （人類免疫缺陷I 型病毒）為基礎發(fā)展起來的基因治療載體。 區(qū)別一般的逆轉錄病毒載體，它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。慢病毒載體的研究發(fā)展得很快，研究的也非常深入。該載體可以 將外源基因有效地整合到宿主染色體上 ，從而達到持久性表達。目前慢病毒也被廣泛地應用于表達RNAi 的研究中。由于有些類型細胞脂質體轉染 效果差，轉移到細胞內的siRNA 半衰期短，體外合成siRNA 對基因表達的抑制作用通常是短暫的，因而使其應用受到較大的限制。采用事先在體外構建能夠表達siRNA的載體 , 然后轉移到細胞內轉錄siRNA 的策略，不但

2、使脂質體有效轉染的細胞種類增加，而且對基因表達抑制效果也不遜色于體外合成siRNA ，在長期穩(wěn)定表達載體的細胞中，甚至可以發(fā)揮長期阻斷基因表達的作用。慢病毒載體能夠產生表達 shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性細胞、干細胞、受精卵以及分化的后代細胞中表達shRNA ，實現(xiàn)在多種類型的細胞和轉基因小鼠中特異而穩(wěn)定的基因表達的功能性沉默，為在原代的人和動物細胞組織中快速而高效地研究基因功能，以及產生特定基因表達降低的動物提供了可能性。慢病毒作為siRNA的攜帶者，不但具備特異性地使基因表達沉默的能力，而且充分發(fā)揮了慢病毒載體自身所具備的優(yōu)勢，為基因功能的研究提供了更強有力的工具。在所構建

3、的siRNA表達載體中，是由RNA聚合酶啟動子來指導RNA合成的，這是因為 RNA 聚合酶 有明確的起始和終止序列，而且合成的RNA 不會帶 poly A 尾。當 RNA聚合酶遇到連續(xù)4 個或 5 個 T 時，它指導的轉錄就會停止，在轉錄產物3端形成 14個U。 U6 和 H1 RNA 啟動子 是兩種 RNA 聚合酶依賴的啟動子，其特點是啟動子自身元素均位于轉錄區(qū)的上游，適合于表達21ntRNA 和 50ntRNA 莖環(huán)結構（ stem loop ）。在siRNA 表達載體中，構成 siRNA 的正義與反義鏈，可由各自的啟動子分別轉錄,然后兩條鏈互補結合形成 siRNA ；也可由載體直接表達小

4、發(fā)卡狀 RNA (small hairpin RNA, shRNA),載體包含位于 RNA 聚合酶啟動子和4 5T轉錄終止位點之間的莖環(huán)結構序列，轉錄后即可折疊成具有 14個 U 3 突出端的莖環(huán)結構，在細胞內進一步加工成siRNA 。 構建載體前通常要通過合成siRNA 的方法，尋找高效的siRNA ，然后從中挑選符合載體要求的序列，將其引入siRNA表達載體（篩選） 。二、實驗流程（大致的簡單過程）慢病毒表達載體包含了包裝、轉染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質?？商峁┧械霓D錄并包裝RNA 到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達載體 (自己構建

5、 )和包裝質粒（購入）同時共轉染細胞，在293T 細胞 (購入 )中進行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養(yǎng)基中，離心取得上清液后， 可以直接用于宿主細胞的感染，目的基因進入到宿主細胞之后，經過反轉錄，整合到基因組，從而高水平的表達效應分子。大致的實驗流程：1. 根據 目的基因 相關信息（序列，序列號等），構建含有外源基因或siRNA的重組載體；（即質粒構建，已構建好，質粒可以永久保存）2. 對于測序正確的 重組質粒 ，提取和純化高質量的 不含內毒素 的重組質粒；3. 使用高效 重組載體 和病毒包裝質粒（購入） 共轉染 293T 細胞 1 ，進行病毒包裝和生產，收集病毒液；4. 濃

6、縮、純化病毒液；5. 用高質量的病毒液感染細胞 (293T 細胞 )；6. 通過定量PCR 精確測定病毒滴度（高精確滴定方法）和Western分析實驗結果；7. 用高質量的病毒液感染宿主細胞；檢測基因功能或者 siRNA 的沉默效率以及使用藥物進行穩(wěn)定轉染細胞株的篩選，通常狀況下， 篩選的細胞克隆株具有長期的表達穩(wěn)定性。病毒液足夠用于一般的動物活體實驗。三、重組質粒構建流程1.基因的獲得 : shRNA 寡核苷酸序列的設計和合成 (將正確序列克隆入載體中，退火形成雙鏈， PCR 擴增 )2.回收A 酶切產物的膠回收：一般做50-100ul體系，然后 跑電泳回收 ，回收量一般為30ul 。B P

7、CR 擴增產物的膠回收原理 ：首先利用 低熔點瓊脂糖凝膠電泳DNA 片段，分離目的條帶DNA ，然后紫外光下切割含目的DNA 條帶的膠塊，利用膠回收試劑盒回收純化DNA 片段。試劑盒的膠回收柱采用特殊硅基質材料在一定的高鹽緩沖系統(tǒng)下高效、專一地吸附DNA 、RNA 的原理，配備設計獨特的離心吸附柱式結構，使用常規(guī)臺式高速離心機，在幾分鐘之內即可以高效回收核酸片段。實驗儀器 ：1、瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)2、紫外觀察分析儀3、離心機4、單面刀片5、恒溫水浴鍋試劑： 1、 DNA 回收試劑盒 2 2、 50×TAE 3（電泳緩沖液Tris- 乙酸） 3 、 ddH 2O4、瓊脂糖凝膠 4步驟：

8、1）使用 TAE 緩沖液制作瓊脂糖凝膠，然后對目的DNA 進行瓊脂糖凝膠電泳 （分離 DNA作用） 5 。2）在紫外燈下切分含DNA 的瓊脂糖塊， 盡可能除去多余的瓊脂糖。放入 1.5ml 離心管中。3）按每置 55水浴100mg 瓊脂糖加入 300 600 l溶膠液 10 分鐘，使瓊脂糖塊完全溶化，期間每6 的比例加入溶膠液 （本實驗加2 分鐘顛例混勻一次促溶。500ul ），4）將溶化后的瓊脂糖液移入吸附柱，12000rpm室溫離心1 分鐘，倒掉收集管中的液體。再將吸附柱放入同一個收集管中。5）在吸附柱中加入500uI 漂洗液，室溫靜置1 分鐘后，12000rpm室溫離心30 秒，倒掉收集

9、管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。6）再在吸附柱中加入500uI漂洗液，12000rpm室溫離心15 秒，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。7）12000rpm室溫空離心1 分鐘。8）將吸附柱放入一個干凈的1.5ml 的離心管中，在吸附膜中央加入30ul 洗脫緩沖液，室溫靜置2 分鐘后，12000rpm 室溫離心1 分鐘（為提高回收效率可再洗脫一次），將 1.5ml離心管 (DNA) 貯存于 -20。9）瓊脂糖凝膠電泳（鑒定作用）檢測回收產物。注意事項 ：1）切膠時應快速操作，在紫外燈下時間長容易傷害到眼睛；2）溴化乙錠染色后的DNA易受紫外光破壞，故盡量放置于暗室，切帶時

10、應使用長波長紫外燈，切膠時間盡量短。3）膠塊一定要充分融化，否則將會嚴重影響DNA 的回收率。4） 把洗脫液加熱，使用時有利于提高洗脫液效率3連接器材： 旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml 微量離心管，雙面離心管架，臺式離心機，干式恒溫氣浴。試劑： T 載體， T4 DNA連接酶，連接酶緩沖液，無菌dd Water 。操作步驟： PCR 產物（已純化回收）與T 載體直接連接：（ 1） 事先將干式恒溫儀（或冰盒里的水）溫度設定在1416° C。（ 2） 取 4 個滅菌的200ul 微量離心管，加入： （需要調整） 4ml 目的基因； 1ml T載體； 0.5ml T4

11、DNA連接酶（ TAKARA, 350U/ul）； 1ml 連接酶緩沖液10 x buffer；3.5 ml dd Water，總量10ml體系。（ 3）上述混合液輕輕震蕩后再短暫離心，然后置于14°C干式恒溫儀（或14°C水中）中保溫過夜（12-16h）。（ 4） 連接后的產物可以立即用來轉化感受態(tài)細胞或置4°C冰箱備用。4. 轉化原理 ：目前， 感受態(tài)細胞 的制備常用冰預冷的CaCl2 處理細菌的方法制備，即用低滲CaCl 2 溶液在低溫（0）時處理快速生長的細菌，從而獲得感受態(tài)細菌。此時細菌膨脹成球形，外源 DNA 分子在此條件下易形成抗DNA 酶的羥基鈣磷

12、酸復合物粘附在細菌表面，通過熱激作用促進細胞對DNA 的吸收。在一定條件下，經過連接后的片段與感受態(tài)細胞混合保溫， 可以進入感受態(tài)細胞。進入感受態(tài)細胞的分子通過復制、表達，實現(xiàn)遺傳信息的轉移， 使受體細胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將經過轉化后的細胞在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可篩選出轉化體，即帶有異源DNA 分子的受體細胞。目的：連接上目的基因的質粒轉化大腸桿菌是為了讓目的基因在大腸桿菌里擴增，然后提取質粒。器材 ：恒溫搖床 ,電熱恒溫培養(yǎng)箱,臺式高速離心機,無菌工作臺 ,低溫冰箱 , 恒溫水浴鍋 ,制冰機 , 分光光度計 ,微量移液槍。試劑 ： 1.LB 固體和液體培養(yǎng)基7 2. 含特定抗生素的LB 固

13、體培養(yǎng)基3.100mM CaCl2 溶液。 4.待轉化質粒大腸桿菌感受態(tài)細胞制備步驟：1）從大腸桿菌平板上挑取一個單菌落于3mlLB 液體培養(yǎng)基，37 振蕩培養(yǎng)過夜（12h左右），直至對數生長期。2）取 0.4ml 菌液轉接到40mlLB 液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)23h，至 OD600 值達到0.5-0.6 之間。3）菌液轉移到50ml 離心管中，冰上放置10min 。4） 4離心 10min （ 4000r/min ）5）倒出培養(yǎng)液，將管口倒置以便培養(yǎng)液流盡6）用冰浴的0.1mol/L 氯化鈣 10ml 懸浮細胞，立即冰浴30min7） 4離心 10min （ 4000r/min ）8）倒

14、出上清液，用冰浴的0.1mol/L 氯化鈣 2ml 懸浮細胞（冰上放置）9）分裝細胞， 200ul 一份， 4保存。暫且不用的貯存于-70可保存半年。取其中一份進行轉化。質粒 DNA 的轉化1）取 200ul 新鮮制備的感受態(tài)細胞，加入質粒DNA2ul 混勻，冰浴30min2）離心管放到42水浴鍋中保溫90s（ 90s 一定要精確，不要搖動試管）3）將試管迅速轉移到冰浴，冷卻1-2min4）每管加800u l LB液體培養(yǎng)基，37培養(yǎng)1h5）取適當體積（100ul ）的復蘇細胞，涂布在含有適當抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，用滅過菌的玻璃棒涂布均勻，室溫正置30min6）倒置平皿37， 1216h，

15、出現(xiàn)菌落為了提高轉化效率, 實驗中要考慮以下幾個重要因素：1. 細胞生長狀態(tài)和密度 : 細胞生長密度以剛進入對數生長期時為好， 可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的 OD600 來控制。2. 質粒的質量和濃度 : 用于轉化的質粒 DNA 應主要是超螺旋態(tài) DNA(cccDNA) 。一般情況下 ,DNA 溶液的體積不應超過感受態(tài)細胞體積的5 。3. 試劑的質量 : 所用的試劑 ,如 CaCl2 等均需是最高純度的 (GR.或 AR.), 并用超純水配制,最好分裝保存于干燥的冷暗處。4. 防止雜菌和雜 DNA 的污染：整個操作過程均應在無菌條件下進行。5抽提質粒 （堿裂解法提取質粒DNA)原理 ： 本實驗采用堿裂解

16、法進行質粒的小量制備。十二烷基磺酸鈉（離子表面活性劑，它既能使細菌細胞裂解，又能使一些蛋白質變性。SDS）是一種陰1）用SDS 處理細菌后，會導致細菌細胞破裂，釋放出質粒DNA和染色體DNA 。兩種DNA在強堿環(huán)境都會變性。2）當加入pH4.8 的酸性乙酸鉀降低溶液pH值后，質粒DNA將迅速復性，而染色體DNA 分子巨大，難以復性。3）通過離心，大部分細胞碎片、染色體DNA 、 RNA 及蛋白質沉淀（SDS 的作用下）除去，而質粒DNA 留在上清中。4）再用異丙醇沉淀、乙醇洗滌，可得到純化的質粒DNA 。純化質粒DNA 的方法 通常是利用了質粒DNA 相對較小及共價閉環(huán)兩個性質。例如，氯化銫

17、-溴化乙錠梯度平衡離心、離 子交換層析、 凝膠過濾層析、 聚乙二醇分級沉淀等方法，但這些方法相對昂貴或費時。對于小量制備的質粒DNA ，經過 苯酚、氯仿 抽提， RNA 酶消化和乙醇沉淀等簡單步驟去除殘余蛋白質和RNA ，所得純化的質粒DNA 已可滿足細菌轉化、 DNA 片段的分離和酶切、常規(guī)亞克隆及探針標記等要求，故在分子生物學實驗室中常用。試劑：1. 溶液 : 50mM (mmol/L) 葡萄糖， 25mMTris-HCl(pH8.0) ， 10mM EDTA(pH8.0）。1M Tris-HCl(pH 8.0 ）12.5ml ，0.5M EDTA（ pH 8.0 ）10ml，葡萄糖 4.

18、730g，加 ddH2O 至 500ml 。在 10 lbf/in2 高壓滅菌 15min ，貯存于 4。2. 溶液 ： 0.2N NaOH ， 1% SDS。 2N NaOH 1ml ， 10%SDS 1ml ，加 ddH2O 至 10ml 。使用前臨時配置（ NaOH 作用是使細胞裂解） 。3. 溶液 ：醋酸鉀（ KAc ）緩沖液， pH 4.8 。5M KAc 300ml ，冰醋酸 57.5ml ，加 ddH2O至 500ml 。 4保存?zhèn)溆谩?. TE ：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0) 。1M Tris-HClEDTA （ pH 8.0 ）

19、 0.2ml，加 ddH2O 至 100ml 。15 lbf/in2 高壓濕熱滅菌5.苯酚 /氯仿 /異戊醇（ 25： 24： 1）6.乙醇（無水乙醇、70%乙醇）（ pH 8.0）1ml ，0.5M 20min ，4保存?zhèn)溆谩?. 5×TBE ：Tris 堿 54g，硼酸 27.5g， EDTA-Na2·2H2O 4.65g ，加 ddH2O 至 1000ml。 15 lbf/in2 高壓濕熱滅菌 20min ， 4保存?zhèn)溆谩?溴化乙錠（EB）： 10mg/ml9.RNase A （ RNA 酶 A）：不含 DNA 酶 (DNase-free) RNase A 的 10m

20、g/ml ，TE 配制，沸水加熱 15min ，分裝后貯存于 -20。10. 6×loading buffer （上樣緩沖液） ：0.25%溴酚藍， 0.25%二甲苯青 FF，40%（ W/V ）蔗糖水溶液。11. 1% 瓊脂糖凝膠：稱取1g 瓊脂糖于三角燒瓶中，加100ml 0.5TBE× ，微波爐加熱至完全溶化，冷卻至60左右，加EB 母液（ 10mg/ml ）至終濃度0.5 g/ml（注意： EB 為強誘變劑，操作時帶手套），輕輕搖勻。緩緩倒入架有梳子的電泳膠板中，勿使有氣泡，靜置冷卻30min 以上，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中（電泳緩沖液0.5 ×TBE

21、），即可上樣。儀器： (1)塑料離心管架（30 孔）；(2) 10、 100、1000L 微量加樣器；(3) 1.5mL 塑料離心管（又稱EPPendorf 離心管）；(4) 低溫高速離心機（20 000 r min ）一臺； (5)無菌工作臺(6) 高壓鍋， (7) 常用玻璃儀器及滴管等。質粒提取步驟：1. 挑取 LB 固體培養(yǎng)基上生長的單菌落，接種于2.0ml LB （含相應抗生素）液體培養(yǎng)基中，37、 250g 振蕩培養(yǎng)過夜（約 12-14hr）。2.取 1.5ml 培養(yǎng)物入微量離心管中，室溫離心8000g ×1min ，棄上清，將離心管倒置，使液體盡可能流盡。3.將細菌沉淀重

22、懸于 100 l預冷的溶液（ 50mM葡萄糖， 25mM Tris-HCl(pH 8.0)， 10mMEDTA(pH 8.0 ）中，劇烈振蕩，使菌體分散混勻，（且不至于沉淀） 。4. 加 200 l新鮮配制的溶液，顛倒數次混勻（不要劇烈振蕩），并將離心管放置于冰上2-3min ，使細胞膜裂解（溶液為裂解液，故離心管中菌液逐漸變清）。5.加入 150 l預冷的溶液（醋酸甲AcK ），將管溫和顛倒數次混勻，見白色絮狀沉淀，可在冰上放置 3-5min 。溶液為中和溶液，此時質粒DNA 復 性，染色體和蛋白質不可逆變性，形成不可溶復合物，同時K+ 使 SDS-蛋白復合物沉淀。6.加入 450 l的苯酚

23、 /氯仿 /異戊醇，振蕩混勻，4 離心 12000g× 10min 。沒有用 PDS 沉淀干凈的蛋白質置于下層7.小心移出上清于一新微量離心管中，加入2.5倍體積預冷的無水乙醇，混勻，室溫放置2-5min ， 4離 心 12000g ×15min 。8.1ml 預冷的 70%乙醇洗滌沉淀 1-2次， 4離心8000g ×7min ，棄上清，將沉淀在室溫下晾干。9. 沉淀溶于 20 l TE（含 RNase A 20 g/ml）， 37水浴 30min 以降解 RNA 分子， -20保存?zhèn)溆谩?重組質?？寺〉蔫b定1）通過 PCR方法鑒定：以重組質粒為模板，PCR產物

24、的特異性引物或載體的通用引物進行 PCR擴增后電泳鑒定。2 ）酶切鑒定：雙酶切鑒定時只要出現(xiàn)質粒條帶和你的插入片段的目的條帶就行了7. 質粒 DNA的含量及純度鑒定實驗材料： 質粒 DNA儀器： (1) 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(2)可調微量移液器(3) 水平電泳槽（4）紫外分光光度計(5) 紫外透射儀等試劑：（ 1）電泳緩沖液：Tris-硼酸（ 1× TBE） pH8.0 。（ 2）加樣緩沖液（6×）：0.25%溴酚藍， 40%蔗糖（ 3)溴化乙錠（ EB）溶液： 10mg/ml含量測定：紫外吸收法溴化乙錠熒光強度法純度鑒定：紫外吸收法和瓊脂糖凝膠電泳測定 DNA濃度的方法有兩種：

25、紫外光吸收法：核酸在260nm 處具有強吸收峰，所以通過測定260nm 的吸收峰即可對DNA進行定量。但有時也會因為所處溶液的pH 值不同而導致吸光系數的不同。因此，一般在中性 pH 值左右的環(huán)境中進行測定。這種方法常用于測定比較純的樣品。溴化乙錠熒光強度法：當 DNA含量很低以及樣品中雜質含量高時，會影響紫外光吸收值的測定，這時， 可以采用測定嵌入DNA中溴化乙錠分子受紫外光激發(fā)而發(fā)射出的熒光強度，因為這種熒光的強度與DNA總質量數成正比。測定質粒DNA純度的方法瓊脂糖凝膠電泳四、慢病毒包裝流程4.1 實驗材料、細胞株 ： 293T ，慢病毒的包裝細胞，為貼壁依賴型成上皮樣細胞，生長培養(yǎng)基為

26、 DMEM 8( 含 10% FBS) 。貼壁細胞經培養(yǎng)生長增殖形成單層細胞。、菌株 ：大腸桿菌菌株DH5 。用于 擴增慢病毒載體和輔助包裝載體質粒。、病毒載體系統(tǒng)組成a) pGC-LV 重組載體（已制備好的）； b) pHelper 1.0 ； c) pHelper 2.0DNA 溶液的制備（見上面具體步驟）：質粒 DNA 溶于除菌的TE 中，以紫外光吸收法測定其濃度及純度，保證所提質粒DNA的 A260/A280 在 1.8 2.0 之間。、試劑臺盼蘭、胎牛血清FBS、 DMSO 、 DMEM、胰酶、Lipofectamine 2000、儀器熒光顯微鏡、CO2 培養(yǎng)箱、生物安全柜、Plus

27、-20離心超濾裝置4.2 病毒包裝細胞293T 的培養(yǎng)、活細胞計數（臺盼藍染色）用無血清培養(yǎng)基 把細胞懸液稀釋到200 2000 個 /ml ( 一般稀釋倍數為100 倍 )，在 0.1ml的細胞懸液中加入0.1 ml 的 0.4%的臺盼蘭溶液。輕輕混勻，數分鐘后，用血球計數板計數細胞?；罴毎懦馀_盼蘭，因而染成藍色的細胞是死細胞。、細胞株的凍存672 在 1 ml 細胞凍存管中加入0.5 ml 細胞懸液， 0.4 ml 小牛血清和0.1 ml 二甲基亞砜9( 或甘油 )，混勻后密封。置4 1 小時， -20 2 小時，然后直接放入液氮中或置液氮蒸汽上過夜后浸入液氮中。、細胞復蘇1 從液氮罐中

28、取出細胞凍存管，應帶有防護眼睛和手套。2 迅速放入盛有37水的水浴中，并不時搖動，盡快解凍 。3 用 70%酒精擦拭消毒后，移至凈化臺上，吸出細胞懸液至培養(yǎng)瓶中，補加3 ml 含10% FBS （胎牛血清）的DMEM 培養(yǎng)基，置溫箱培養(yǎng)。4 次日更換一次培養(yǎng)液后再繼續(xù)培養(yǎng)。、細胞傳代1 棄去舊培養(yǎng)液，加入5 ml 滅菌 PBS 溶液，輕輕晃動，洗滌細胞生長面，然后棄去PBS溶液。2 加入 2 ml 胰酶消化液，消化1- 2 min 直到細胞完全消化下來。3 加入含 10%胎牛血清和100 U/ml 雙抗的 DMEM 培養(yǎng)基 5 ml ，用刻度吸管吹打數次，將瓶壁上的細胞沖洗下來。4 混勻細胞后

29、分至兩個新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。4.3慢病毒包裝細胞轉染1) 轉染前 24 h，用胰蛋白酶消化 對數生長期的 293T 細胞，以含 10% 血清的培養(yǎng)基調整細胞密度為 1.2 x 10 7 細胞 /20 ml ，重新接種于 15 cm 細胞培養(yǎng)皿， 37 、 5% CO2 培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。24 h 待細胞密度達 70% 80%時即可用于轉染。 細胞狀態(tài)對于病毒包裝至關重要，因此 需要保證良好的細胞狀態(tài)和較少的傳代次數。2) 轉染前 2 h 將細胞培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基。3) 向一滅菌離心管中加入所制備的各DNA 溶液 (pGC-LV 載體 20 g ，pHelper 1.0 載體 15 g，p

30、Helper 2.0 載體 10 g)，與相應體積的Opti-MEM 10 混合均勻， 調整總體積為2.5 ml ，在室溫下溫育5 分鐘。4) 將 Lipofectamine 2000 試劑輕柔搖勻，取100 l Lipofectamine 2000試劑在另一管中與 2.4 ml Opti-MEM混合，在室溫下溫育5 分鐘。5) 把稀釋后的 DNA 與稀釋后的 Lipofectamine 2000 進行混合， 輕輕地顛倒混勻，不要振蕩。 必須在 5 分鐘之內混合。6) 混合后，在室溫下溫育 20 分鐘，以便形成 DNA 與 Lipofectamine 2000 稀釋液的 轉染復合物。7) 將

31、DNA 與 Lipofectamine 2000 混合液轉移至 293T 細胞的培養(yǎng)液中， 混勻，于 37 , 5% CO2 細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。8) 培養(yǎng) 8 h 后倒去含有轉染混和物的培養(yǎng)基，每瓶細胞加入20 ml 的 PBS 液，輕輕左右晃動一下培養(yǎng)瓶以洗滌殘余的轉染混和物，然后倒去。9) 每瓶細胞中加入含10% 血清的細胞培養(yǎng)基25 ml ，于 37 、5% CO2 培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)48 小時。4.4 病毒的收獲及濃縮1收集轉染后 48小時（轉染即可為 0 小時計起）的 293T細胞上清液。2于 4 ， 4000 g 離心 10 min ，除去細胞碎片。3以 0.45 m 濾器過濾上清液

32、于 40 ml 超速離心管中。4把病毒粗提液樣品加入到過濾杯中（最多19 ml ），蓋上蓋子。將過濾杯插到濾過液收集管中。5組合好后，做好平衡，放在轉頭上。6在 4000 × g 離心，至需要的病毒濃縮體積。通常需要的時間為10-15 分鐘。7離心結束后，取出離心裝置，將過濾杯和下面的濾過液收集杯分開。8將過濾杯倒扣在樣品收集杯上。9離心力不超過1000g,時間為 2 分鐘。過高轉速會導致樣品損失。把離心杯從樣品收集杯上移開。樣品收集杯中的即為病毒濃縮液。10 將病毒濃縮液移出，分裝后保存在病毒管中，-80度長期保存。取其中一支進行病毒生物學滴度測定。4.5 慢病毒滴度測定1) 孔稀

33、釋法測定滴度1測定前一天，為測定滴度所需的細胞（英茂盛業(yè)公司用的293T細胞：貼壁生長）鋪板， 96 孔板，每個孔加4×104 個細胞，體積為100l 。2根據病毒的預期滴度， 準備 710 個無菌的 Ep 管。在每個管中加入90 l 的無血清培養(yǎng)基。3取待測定的病毒原液 10 l 加入到第一個管中，混勻后，取10 l 加入到第二個管中。繼續(xù)相同的操作直到最后一管。4選取所需的細胞孔，吸去90 l 培養(yǎng)基，丟棄。加入90 l 稀釋好的病毒溶液。放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。5 24 小時后，加入完全培養(yǎng)基100 l。小心操作，不要吹起細胞。6 4 天后，觀察熒光表達情況。熒光細胞數隨稀釋倍數的增加

34、而減少。說明：第一個 Ep 管中加入 10ul 病毒原液，記為1E+1 l ；第二個 Ep 管中進行了第一次十倍稀釋,所得病毒原液為第一個Ep 中的 1/10，記為 1E+0l ；第三個 Ep 管中進行了第二次十倍稀釋，所得病毒原液為第二個Ep 中的 1/10，記為 1E-1 l；依次類推第七個 Ep 管中進行了第六次十倍稀釋，所得病毒原液為第六個Ep 中的 1/10，記為 1E-5 l；第八個 Ep 管中進行了第七次十倍稀釋，所得病毒原液為第七個Ep 中的 1/10，記為 1E-6 l；2) Realtime 定量 PCR 法測定滴度樣品制備1.檢測前一天，對 293T 細胞傳代，每個 24

35、 孔中加1× 105 個細胞，體積為 500 l；2.次日，準備 710 個無菌的 Ep 管，在每個管中加入90 l 的培養(yǎng)基（ DMEM+10%FBS）；3.取待測定的病毒原液 10 l 加入到第一個管中， 混勻后， 取 10 l 加入到第二個管中。繼續(xù)相同的操作直到最后一管；4. 選取所需的細胞孔， 吸去 90 l 培養(yǎng)基。加入稀釋好的病毒溶液。 放入 37 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；5. 48 小時后，加入新鮮培養(yǎng)基 500 l。小心操作，不要吹起細胞；6. 4 天后， 抽提 RNA 準備做 RT-qPCR?？?RNA 抽提說明：根據Invitrogen 公司的1.去細胞上清，

36、每孔加入TRIZOL 操作說明書進行，均為RNase-free 操作。l TRIZOL吹打，室溫靜置5 min ，后轉移至另一新的1.5ml移液管中。2.每管加入200 l氯仿，用力震蕩15s，室溫靜置15 min 。3. 4， 12000 rpm ，離心 15min 。4. 從每管中吸取上清至另一新的 1.5 ml 移液管。加入等體積 -20預冷的異丙醇，混勻后 -20沉淀 10 min 。5. 4， 12000 rpm 離心 10 min 后，去上清。6. 加入至少 1 ml 4預冷的 75%乙醇，洗滌沉淀及離心管壁。7. 4， 10000 rpm 離心 5 min ，棄上清。8.4， 1

37、0000 rpm 再次離心 5 min，吸去殘液，室溫干燥（不需完全干燥） 。9.加入 20 lRNase-free 水 11 ，至完全溶解，紫外分析測定所抽提RNA 的濃度。五、 慢病毒感染目的細胞慢病毒感染目的細胞預實驗注意事項A測定慢病毒對目的細胞的親嗜性時，需要同時設置對慢病毒親嗜性較高的細胞(HEK293T ， Hela ）作為平行實驗的對照細胞。B在進行慢病毒感染實驗時,可以用完全培養(yǎng)基（培養(yǎng)目的細胞用）稀釋；理論上，含有血清，雙抗或者其他營養(yǎng)因子的完全培養(yǎng)基不影響慢病毒的感染效率。慢病毒幾乎可以感染所有種類的細胞。加入puromycin12 可以篩選穩(wěn)定表達shRNA的細胞系。p

38、uromycin最優(yōu)濃度篩選:每種細胞對puromycin的敏感性不同，因此，準備建立穩(wěn)定細胞系之前，需要確定能夠在 3-5 天殺死細胞的最優(yōu)puromycin濃度。方法如下：1. 在 6 孔板內種植細胞，約 2x10 5/孔，共十孔， CO2 孵箱過夜培養(yǎng)。2. 第二天，觀察細胞密度為80%-90% 融合。稀釋 puromycin至培養(yǎng)基，按照從 1 g/ ml到 10 g/ ml ，每隔 1g/ ml 遞增的濃度，加至培養(yǎng)孔內。3. 第三天觀察細胞，每隔一天換一次培養(yǎng)基，最優(yōu)濃度為在3-5 天內殺死所有細胞的濃度。慢病毒感染細胞和穩(wěn)定細胞系篩選第一天：在 60mm 培養(yǎng)皿內種植細胞，細胞密

39、度為第二天細胞融合能達到70%-80% ，CO2 孵箱過夜培養(yǎng)。第二天：準備 3ml 培養(yǎng)基，加入Polybrene13 ，終濃度為 8 g/ ml 。將步驟五制備的病毒顆粒 0.5 ml 加至上述培養(yǎng)基，輕吹混勻。去除60mm 培養(yǎng)皿內的舊的培養(yǎng)基，加入含病毒培養(yǎng)基 （Polybrene 能夠增加病毒感染的效率，然而，有時候 Polybrene 對細胞有毒性。這時，可以用 Protamine Sulfate 代替 Polybrene）第三天：病毒感染后 24 小時，可以換用含最優(yōu)濃度puromycin 的培養(yǎng)基。如果病毒對細胞有毒性，可以減少感染時間至4-6 小時，然后換用新鮮培養(yǎng)基， 24-48小時后換加含 puromycin 的培養(yǎng)基。最好設立一個對照皿，不加病毒液，加入Ploybrene ，觀察 Polybrene 是否對細胞有毒性；如果Polybrene沒有毒性，還可以加入 puromycin ，作為 puromycin 是否有效的對照。第四天以后：每隔一天換用新鮮含puromycin的培養(yǎng)基，以替換含大量死細胞的培養(yǎng)基。