同種異體骨髓間充質(zhì)干細胞復(fù)合膠原海綿修復(fù)兔橈骨缺損的實驗研究

1、同種異體骨髓間充質(zhì)干細胞復(fù)合膠原海綿修復(fù)兔橈骨缺損的實驗研究         11-02-13 13:33:00     編輯：studa20              作者：楊柏林，潘勇，云雄，鄒重文，曹國永【摘要】  目的：了解兔骨髓間充質(zhì)干細胞(BMscs)同種異體移植的存活分布情況及同種異體兔BMscs復(fù)合膠原海綿(CS)情況，觀

2、察其對兔橈骨1.5 cm缺損的修復(fù)效果，為將來的進一步應(yīng)用奠定實驗基礎(chǔ)。方法：采集、培養(yǎng)、純化擴增新西蘭大白兔BMscs，用eGFP熒光標(biāo)記BMscs，與膠原海綿聯(lián)合培養(yǎng)，植于同種異體動物臀大肌，觀察存活及分布情況。建立兔橈骨缺損(1.5 cm)模型，45只新西蘭大白兔隨機分為3組：同種異體BMscs/CS組(A組)，單純膠原海綿組(B組 )，空白對照組(C組)。術(shù)后分階段行X線、組織學(xué)檢查及生物力學(xué)檢查，評價其修復(fù)效果。結(jié)果：eGFP標(biāo)記的BMscs異體移植存活時間超過3周。X線示12周A組大白兔5只中有4只達到骨性連接。新生骨量呈A組C組遞減，至12周無一愈合。隨著時間推移，A組編織骨髓腔

3、和骨小梁增多，修復(fù)過程優(yōu)于B、C組。A組生物力學(xué)指標(biāo)均低于健側(cè)正常對照組，但各指標(biāo)能達到正常組的80%90%。結(jié)論：同種異體MSCs復(fù)合CS可以修復(fù)1.5 cm兔橈骨缺損。 【關(guān)鍵詞】  骨髓間充質(zhì)干細胞;組織工程;移植;骨缺損             ABSTRACT Objective:To study the survival and distribution of allogenic mesenchymal stem cells (BMscs) a

4、fter implantation into other rabbits, evaluate osteogenetic effectiveness of collagensponge mixed with allogenic BMscs of rabbit in repairing of radial shaft defects, and lay the foundation for further application.Methods: The BMscs of New Zealand white rabbits were collected，cultured，purified and a

5、mplified，they were marked with eGFP, cultured with collagensponge and planted into ectogluteus of other rabbits in order to observe the survival and distribution of BMscs. Model of radial bone defects (15 mm )of rabbits was established. 45 rabbits were divided into 3 groups, group A (BMscs/CS group)

6、, group B (CS group) and group C (untreated group). Roentgenographic, histologic, biomechanics indexed of the animals were examined at certain time after surgery to evaluate osteogenetic effectiveness.Results: The BMscs marked with eGFP could survive for 3 weeks. On the 12th week, 4 of 5 radial bone

7、 defects healed in group A.The quantity of callus decreased from group A to C. In group B and C, no one rabbits healed on the 12th week. Biomechanics result showed the indexes of group A were lower than the opposite side normal control groups.Conclusion: BMscs mixed with CS can repair radial defect

8、shorter than 1.5 cm in rabbit.KEY WORDS Bone marrow mesenchymal stem cells; Tissue engineering; Transplant; Bone defects利用組織工程的方法治療骨缺損，是目前骨科基礎(chǔ)研究的熱點之一。目的基因、種子細胞、支架材料是組織工程三大要素，種子細胞作為其中一項要素引起了廣泛的研究1，2，其中骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells， BMscs )是研究較多的種子細胞之一。傳統(tǒng)的自體細胞移植在實驗室研究階段存在著大量細胞取材困難，宿主存活時間

9、難以保證，不同宿主細胞容易混雜污染等缺點。研究發(fā)現(xiàn)BMscs可有效繞過機體的免疫排斥進行異體移植，基于此本文將異體BMscs復(fù)合膠原海綿，對兔1.5 cm橈骨缺損修復(fù)進行了實驗研究。1 材料與方法1.1 材料優(yōu)質(zhì)胎牛血清(杭州四季青公司);DMSO(上海生化試劑二廠);MTT(美國Sigma公司);Percoll分離液(密度1.073 g/mL，天津TDB公司);DMEM/F12培養(yǎng)基(美國Gibco公司);胰蛋白酶(美國Amesco公司);注射用肝素鈉、注射用鏈霉素、速眠新(華北制藥股份有限公司);膠原海綿(北京益而康公司)新西蘭大白兔(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動物中心);eGFPAd由重慶武警

10、總隊醫(yī)院曹國永博士提供。1.2 方法1.2.1 兔BMscs的分離 根據(jù)參考文獻3將幼兔肌注速眠新麻醉，無菌環(huán)境下解剖出四肢長骨，剪斷兩端，用10 mL肝素鈉(1200 U/mL)濕潤過的骨穿針抽取骨髓共2.5 mL，至10 mLDMEM/F12培養(yǎng)液中，抽吸、吹打使骨髓組織基本均勻分散，緩慢加入含10 mL Percoll細胞分離液的離心管中，以2 000 rpm的轉(zhuǎn)速離心20 min。緩慢吸取中間的白膜狀層細胞至另一離心管中，加入PBS平衡液吹洗后，以1 500 rpm的轉(zhuǎn)速離心5 min，棄去上清。洗滌，加入6 mL 不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，輕輕吹吸，重懸為單細胞懸液后準(zhǔn)備培養(yǎng)

11、。1.2.2 BMscs的培養(yǎng) 吸取2 mL重懸細胞液，接種到100 cm2玻璃培養(yǎng)瓶中，再加入5 mL完全培養(yǎng)液，添加血清至終濃度未10%。置于37 、5%CO2的空氣、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h后半量換液，72 h后完全換液，以后隔日換液。待細胞長至瓶底80%面積時，以13比例用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。0.25%胰蛋白酶消化生長狀態(tài)良好的第三代細胞，離心，洗滌，加入凍存液中重懸，梯度降溫，置于液氮中。復(fù)蘇時取出細胞在空氣中置5 sec，水浴加熱，洗滌，離心后加入完全培養(yǎng)基重懸。1.2.3 eGFPAd轉(zhuǎn)染兔BMscs 取凍存復(fù)蘇后的細胞，吸干培養(yǎng)基，以感染復(fù)數(shù)MOI=150將標(biāo)

12、記有eGFP的腺病毒eGFPAd液加入培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)箱中孵育1 h，加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，12 h后倒掉原液，加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。1.2.4 eGFPAdBMscsCS復(fù)合材料的觀察及生物相容性觀察 取生長狀態(tài)良好的eGFPAd修飾的BMscs細胞，待細胞融合率達80%后，消化成細胞懸液，調(diào)整濃度為5×106/mL，用注射器注入1 cm×1 cm×0.5 cm膠原海綿，使其浸入內(nèi)部，添加培養(yǎng)液后置孵箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24h，得到含BMscs的膠原海綿復(fù)合物。將上述方法獲得的eGFPAdBMscsCS復(fù)合材料取出，PBS清洗，2.5%戊二醛固定，乙醇和丙酮梯度脫水，和CS

13、一起臨界點干燥后噴金，掃描電鏡觀察。1.2.5 eGFP標(biāo)記的BMscs體內(nèi)示蹤觀察 將純種新西蘭大白兔麻醉，消毒后手術(shù)顯露右側(cè)臀大肌，將兩塊0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm復(fù)合材料植入肌肉內(nèi)，分別于術(shù)后3 d、1周、3周、5周取出材料(附帶部分肌肉)，4%多聚甲醛固定，冰凍切片，厚度5 m，熒光顯微鏡下觀察。1.2.6 兔橈骨缺損模型的建立 選擇45只純種新西蘭大白兔，每組15只，速眠新麻醉，固定四肢，左上肢剪毛，常規(guī)消毒，鋪巾。上肢后外側(cè)中份縱切口23 cm，鈍性分離肌肉，暴露橈骨中段，撥離骨膜，用線鋸橫行鋸斷橈骨，形成1.5 cm寬骨缺損，A組予以異體BMsc

14、s/ CS復(fù)合物填充;B組予以CS填充;C組空白對照，隨后分層縫合，術(shù)后分籠飼養(yǎng)。1.2.7 影像學(xué)觀察 手術(shù)后術(shù)后4、8、12周行前肢正位X線攝片，了解缺損區(qū)骨痂生長塑形及髓腔再通情況。每時間點每組5只，采用柯達DR3000射線機，60 kV，8 mA.s條件下曝光，影像科高年資醫(yī)師讀片，采用Tsuchida H和Hashimoto J4 等人推薦的計分系統(tǒng)，根據(jù)缺損內(nèi)新生骨所占的百分比對成骨情況進行半定量評分。評分標(biāo)準(zhǔn)如下：新生骨面積百分比1%24%計1分;25%49%計2分;50%74%計3分;75%99%計4分;100%計5分。1.2.8 組織學(xué)觀察 分別于術(shù)后4、8、12周每組選擇5

15、只動物處死，于缺損填充部位取材，經(jīng)固定、脫鈣、包埋、HE染色，光鏡觀察骨缺損修復(fù)及成骨情況。1.2.9 生物力學(xué)測定 術(shù)后12周取A組中達到骨性連接標(biāo)本和健側(cè)相應(yīng)的正常標(biāo)本各4例，取全長橈骨，兩端經(jīng)牙托粉固定。測定壓縮試驗，加載速度1 mm/min，應(yīng)力下降50%60%停止加載。比較力學(xué)最大載荷、抗壓強度和彈性模量各指標(biāo)。2 結(jié)果2.1 原代BMscs 顯微鏡觀察結(jié)果BMSC形態(tài)與成纖維細胞類似，呈紡錘形，有少量細胞突起。隨著換液的進行，出現(xiàn)集落狀細胞群，由1020個細胞組成，此后細胞集落迅速增多，融合成片，呈旋渦狀排列， 912 d細胞鋪滿瓶底成單層，見圖1。圖1 倒置顯微鏡下原代BMscs圖象(×100)2.2 膠原海綿及eGFPAdBMscsCS復(fù)合體掃描電鏡觀察結(jié)果膠原海綿疏松多孔，大小不均。復(fù)合材料掃描觀察見BMscs在CS支架材料上伸展良好，細胞融合成片狀，細胞與周圍材料緊密相連，少數(shù)成球形(圖2)。2.3 eGFP標(biāo)記的BMscs體內(nèi)示