生物化學與分子生物學實驗課講義

1、實驗一 SDS堿裂解法小量制備質(zhì)粒一、實驗目的1掌握SDS堿裂解法小量制備質(zhì)粒的原理和方法。2掌握高速離心機、微量移液器等常規(guī)儀器的正確使用。二、實驗原理對培養(yǎng)的含有大量質(zhì)粒的菌液，離心收集菌體，用含一定濃度葡萄糖的緩沖液懸浮菌體，采用堿性SDS裂解細菌的細胞壁，使質(zhì)粒緩和釋放出來。同時整個溶液的pH為12-12.5，使斷裂成線性細菌染色體DNA變成單鏈、相互交聯(lián)纏繞附著在細胞壁碎片上，當液體的pH調(diào)至中性并有高濃度存在下，大部分蛋白質(zhì)和細菌染色體形成沉淀，而共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA仍為可溶狀態(tài)，離心獲得含有大量質(zhì)粒上清液，用RNA酶A處理除去RNA，用苯酚氯仿除去殘留蛋白質(zhì)，再利用核酸不溶于有機溶

2、劑的性質(zhì)，從而使其在適當濃度的親水性有機溶劑中（乙醇、異丙醇、PEG8000）沉淀析出。三、材料、試劑和儀器1試劑GT116（含psiRNA質(zhì)粒）菌種LB液體培養(yǎng)基溶液 I、溶液 II、溶液 III、無水乙醇、氯仿、異戊醇、Tris飽和酚、RNA酶A、TE、STE、卡那霉素（配方見附錄）2儀器和材料超凈臺、高速離心機、微量移液器、滅菌eppendorf管和tips、37搖床、旋渦混勻器四、實驗操作步驟1 在超凈臺內(nèi)從平板上挑取單菌落或用以其它方式保存的菌種接種于3ml LB培養(yǎng)基，在37培養(yǎng)15-18個小時。2 向1 個2ml的離心管里加約1.5ml的菌液。不要把菌液濺出造成污染。3 1000

3、0 rpm離心2分鐘。注意離心機上放置的管重力要平衡，保護離心機。4 棄上清液于廢液瓶中。5 重復離心一次，盡量棄去上清。6 加入100ul冰冷的溶液I，然后劇烈振蕩混勻，置冰上。7 加入200ul溶液II，輕柔混勻，置冰上4分鐘。 8 加入150ul冰冷的溶液III，輕柔混勻，置冰上5分鐘。9 12000 rpm離心5分鐘。把上清液轉(zhuǎn)移到另一1.5ml離心管中（約450ul）。10 加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）混合液，劇烈振蕩，12000 rpm離心2分鐘，小心的收取上層溶液（約450ul）于另一1.5ml離心管中。2 / 3411 加入等體積氯仿：異戊醇，劇烈振蕩，120

4、00 rpm離心2分鐘，小心的收取上層溶液（約400ul）于另一1.5ml離心管中。12 2倍體積（800ul）20預冷的無水乙醇，置冰上10分鐘，沉淀質(zhì)粒DNA。13 12000 rpm離心5分鐘，棄上清14 用1ml 冰預冷的70的乙醇洗沉淀，輕輕轉(zhuǎn)動離心管，15 12000rpm離心1分鐘，棄上清液。16 室溫干燥沉淀。加入50ul TE（含20ug/ml RNA酶A）溶解質(zhì)粒， -20保存。五、質(zhì)粒相關知識 質(zhì)粒是細胞染色外一種雙鏈環(huán)狀DNA分子，它隨寄主細胞穩(wěn)定遺傳。對于質(zhì)粒的研究始于1946年，美國科學家Lederberg.J.首先研究了細菌的性因子（F因子），隨后科學家們又相繼發(fā)

5、現(xiàn)了細菌的抗藥性因子（R因子），大腸桿菌素因子（CoE）等，并對這些染色體外遺傳單位的性質(zhì)、功能及與宿主的關系進行了的深入的研究，為建立第一批重組DNA載體提供了科學的材料。 質(zhì)粒DNA在細菌中的復制分為嚴緊型（stringent control）和松弛型（relaxed control）。嚴緊型質(zhì)粒的復制要在蛋白合成時和DNA聚合酶的III存在，只隨染色體的復制而復制，其拷貝數(shù)少，每個細胞中只有1-10個；松弛型質(zhì)粒的復制需要使用的是DNA聚合酶，它在細胞生長周期中隨時可以復制，每個細胞中有10-200以上個拷貝。為了便于基因克隆，作為載體的質(zhì)粒特點如下：1 是一個復制子，能自我復制。使它攜

6、帶的目的基因得到大量擴增。2 分子量?。ㄏ鄬Ψ肿淤|(zhì)量一般在106-107），拷貝數(shù)要高，便于應用（如便于提取、基因克隆、酶切鑒定、細胞轉(zhuǎn)化、原位雜交等）。3 至少要有兩個便于選擇的遺傳標記，其一用于檢查外源DNA是否插入到質(zhì)粒中，例如載體中引入的LacZ基因，它編碼-半乳糖苷酶氨基端的一個146個氨基酸的-肽，可以被IPTG（異丙基-D-硫代半乳糖苷）誘導合成，新合成的肽能與宿主細胞所編碼的缺陷型-半乳糖苷酶實現(xiàn)基因內(nèi)互補，產(chǎn)生有活性的-半乳糖苷酶，該酶能夠水解X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷），生成藍色的溴氯吲哚，使含X-gal的培養(yǎng)基中生長的菌落為藍色。若有外源DNA插入

7、LacZ中，因不能合成正確的-肽，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的Lac缺陷菌株，用X-gal篩選，含陽性無隆載體的菌落為白色，含空載體的菌落為藍色；其二用于選擇已把載體轉(zhuǎn)化到細菌中的菌落，如氨芐青霉素抗性基因（Ampr），只有已轉(zhuǎn)化含有質(zhì)粒的重組菌在Amp培養(yǎng)基中才能生長。4 有多個單一的酶切位點，起點在某個遺傳標記上，便于基因克隆，鑒定。提取的質(zhì)粒多數(shù)以超螺旋型存在，超螺旋的DNA中一個螺旋由10個堿基形成，若一個螺旋大于或小于19個堿基時，分子內(nèi)就產(chǎn)生一種力量，外于不穩(wěn)定狀態(tài)，當分子上有一個缺刻時，分子會立即松馳，形成開環(huán)分子。一般超螺旋型質(zhì)粒應占到總量70。否則反思你的每步操作是否正確。六、思考題1 分離

8、純化核酸（質(zhì)粒DNA）應遵循那些原則（或注意那些事項）？2 溶液I、溶液II、溶液III、酚、氯仿、無水乙醇、等主要試劑各有何作用？實驗二 分光光度法測定DNA的濃度和純度一 實驗目的1. 掌握分光光度法估算樣品中DNA的濃度和純度。2. 熟悉紫外分光光度計的使用方法。二 實驗原理DNA和RNA吸收光譜的最大值位于260nm，因此可以通過測定OD260來計算樣品中DNA和RNA的濃度，一個OD值相當于約50g/ml的雙鏈DNA、40g/ml的單鏈DNA和RNA以及33g/ml的單鏈寡核苷酸。利用260nm和280nm兩處讀數(shù)的比值（OD260:OD280）可以估算核酸的純度。三 材料、試劑和儀

9、器1 儀器：美譜達UV-3100紫外分光光度計2 試劑：待測質(zhì)粒DNA溶液四、實驗步驟1打開外部電源主機電源。2儀器自檢 當打開儀器電源時，儀器便進入自檢程序，預熱15分鐘，自檢各項都“OK”后，進入選擇工作方式界面。3. 選擇菜單第五項“DNA/蛋白質(zhì)測量”4. 按F2鍵選擇測量方法?！拔舛炔?”模式或“吸光度差2”模式被選定后，再選擇是否“測量背景”?！拔舛炔?”模式測量波長為260nm和280nm，背景波長320nm；“吸光度差2”模式的測量波長為260nm和230nm，背景波長為320nm。3光度測量未知DNA、RNA濃度的測定：（1）選擇“吸光度差1”模式（3）校零在樣品池中放入

10、參比溶液（1×TE），按【0Abs/100T】鍵，儀器進行自動校零，校完后取出參比溶液。（4）測量將取出的參比溶液倒掉，換上樣品溶液，放入樣品池內(nèi)，按START 即可測量樣品吸光度值。若有多個樣品要測試，只需再按TART 即可。注意：僅在吸光度為01之間時，吸光度值和DNA濃度才有良好的線性關系。小量制備的質(zhì)粒DNA濃度一般約為幾ug/ul，因此需要稀釋約100倍進行測量。如果濃度仍超過測量范圍，需要繼續(xù)稀釋。每次至少需向微量比色皿中注入400ul溶液才可準確測量。4. 結(jié)果計算（1）依據(jù)下式計算DNA的濃度：A260×50×稀釋倍數(shù)樣品濃度（ug/ml）（2）計

11、算比值： A260/A280=DNA的吸收高峰為260nm，吸收低峰為230nm，而蛋白質(zhì)的吸收高峰為280nm。純DNA A260/A280為1.8，純RNA A260/A280為2.0。A260/A280小于1.8，則表明樣品中混有較多的蛋白質(zhì)。若A260/A280接近2.0，則表明樣品中含有較多RNA。實驗三 DNA的瓊脂糖凝膠電泳分析一實驗目的1學習掌握DNA的瓊脂糖凝膠電泳的原理和方法及其運用。二實驗原理由于DNA結(jié)構(gòu)的重復性，核苷酸數(shù)相同的DNA幾乎具有等量的凈電荷，所以核酸攜帶的電荷的差異幾乎不造成對核酸遷移率的差異，而真正決定DNA分子在某一特定電場下的電泳遷移率因素取決于DN

12、A分子的大小、構(gòu)象、構(gòu)型。采用適當濃度的瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠介質(zhì)作為電泳支持物，發(fā)揮分子篩的功能，使大小、構(gòu)象不同的核酸分子泳動率出現(xiàn)較大差異，以達到分離的目的。三材料、試劑和儀器1 質(zhì)粒DNA、細菌基因組DNA2 瓊脂糖、6×Loading Buffer、DNA分子量marker、溴化乙啶（EB）3. 儀器：瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)、紫外透射儀、數(shù)碼相機四實驗步驟1 凝膠的制備（1） 配0.7%的膠：稱取0.21g的瓊脂糖，置于三角瓶中，加入1×TAE 30ml，蓋上鋁箔紙，放在微波爐中化膠，注意用中低火（約12分鐘），避免沸騰和溢出。（2） 輕旋轉(zhuǎn)三角瓶把膠混勻，使膠的

13、溫度冷卻至5060。（3） 正確安裝制膠模及梳子。（4） 將瓊脂糖溶液倒入膠模中，并防止梳子的齒下或齒間及凝膠中產(chǎn)生氣泡。（5） 室溫靜置約30分鐘，使膠能完全凝固。輕輕拔出梳子，把膠放入調(diào)好水平、裝有適量緩沖液的電泳槽內(nèi)，待用。2 電泳（6） 在透明膠帶紙上分滴6×的上樣緩沖液1微升/滴，然后于5微升DNA液混勻，加入到上樣孔上（用微量移液器的tip頭插入1mm深處，輕輕推進樣品，可以看見樣品下沉）。同時上標準DNA分子量Marker。（7） 蓋上電泳槽并通電15V/cm，使DNA向陽極移動。當指示劑泳動至膠的另一端就可停止電泳。（8） 切斷電流，取出凝膠，將膠浸入0.5g/ml的

14、EB溶液中10分鐘，取出后用水漂洗2分鐘，在紫外透射儀下檢查凝膠并攝影。注意：EB是強烈的誘變劑，須小心處理。五思考題1. 哪些因素會影響核酸在瓊脂糖凝膠中的泳動？實驗四 CTAB法小量制備大腸桿菌基因組DNA一實驗目的 1 掌握用CTAB法小量制備大腸桿菌基因組DNA2 了解基因組DNA的其它提取方法二實驗原理CTAB是一種陽離子去污劑，在高離子強度的溶液里，CTAB（十六烷基三乙基溴化銨）與蛋白質(zhì)和大多數(shù)酸性多聚糖以外的多聚糖形成復合物，只是不能沉淀核酸。因此，CTAB可以用于從大量產(chǎn)生粘多糖的有機體如植物以及某些革蘭氏陰性菌（包括E.coli的某些株）中制備純化DNA。本實驗用SDS破碎

15、細胞，利用蛋白酶K消化蛋白，CTAB沉淀多糖，再經(jīng)加熱使蛋白變性與DNA分離，經(jīng)酚氯仿抽提后，乙醇沉淀核酸，得到總DNA。三材料、試劑和儀器1大腸桿菌G1162 TE（pH8.0）、CTAB、蛋白酶K、NaCl、氯仿6無水乙醇8儀器: 高速離心機、微量移液器、滅菌eppendorf管和tips、37搖床、四實驗步驟1 取1.5ml菌液于2ml離心管，10000rpm離心2min，倒去上請，重復該步驟一次。2 加入567l TE（pH8.0），使菌體完全懸浮。3 加入30l 10SDS于離心管中，再加入3l 20mg/ml蛋白酶K，充分混勻。37°C反應1h。4 加入100l 5M N

16、aCl，80l CTAB/NaCl，混勻，65°C反應10min。5 加入780l酚/氯仿/異戊醇（25：24：1），充分混勻，12000rmp室溫離心5min。6 轉(zhuǎn)移上清至新的2ml離心管，再加入等體積氯仿/異戊醇（24：1），充分混勻，12000rmp室溫離心5min。7 轉(zhuǎn)移上清至新的2ml離心管，加入1/10體積的3M 醋酸鈉,2倍體積的無水乙醇，混勻。8 -20°C放置30min或者更長時間。9 13000rmp，離心10min。去上清，加入70乙醇洗滌沉淀，再13000rmp，離心10min。10. 去上清，室溫干燥DNA沉淀。11. 沉淀干燥后加入200l

17、1×TE（pH8.0）溶解沉淀。五思考題試比較細菌基因組DNA和質(zhì)粒DNA提取方法的異同？實驗五 質(zhì)粒DNA的酶切分析一實驗目的1 了解酶切原理。2 掌握酶切體系的建立原則。3 熟悉基因工程所用限制性內(nèi)切酶的特點。二實驗原理 分子生物學中使用的DNA限制性內(nèi)切酶主要是II型II酶，有EcoR I、BamH I、Hind II、Hind III等。其識別的特定堿基順序，并有特異性的酶切位點，因而DNA分子經(jīng)過II類酶作用后，可產(chǎn)生特異性的酶解片斷，這些片斷可用凝膠電泳法進行分離、鑒別。相當一部分酶(如EcoR I、BamH I、Hind等)的切口，作用點有180°旋轉(zhuǎn)對稱性，

18、因而可形成粘性末端，但也有一些II類酶如A1u I、BsuR I、Bal I、Hal III、HPa I、Sma I等切割DNA分子并不產(chǎn)生粘性末端，而只形成平整末端。依據(jù)限制性內(nèi)切酶的生物學活性特點，建立一個細胞體外的液體環(huán)境，使酶能夠最大限度地發(fā)揮其切割DNA的作用。三材料、試劑和儀器1 質(zhì)粒DNA（psiRNA）2 限制性內(nèi)切酶BpiI及其Buffer3. 儀器：水浴鍋、瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)等四實驗步驟1酶切反應體系質(zhì)粒（psiRNA） 8 l10×反應緩沖液 2 l酶 (Hind II或Bpi I） 1 lH2O 9 l2向一個管內(nèi)加入以上各個成分，注意各成分的體積要準確，酶最

19、后加入。3混勻管中的各成分后再離心到管底。4放在37，1小時。5瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切結(jié)果，酶切產(chǎn)物可以進一步進行重組。五思考題1 簡要說明切酶反應電泳圖譜，其結(jié)果說明了什么問題？2 酶切反應的關鍵有哪些？實驗六 質(zhì)粒載體與外源DNA片段的連接一實驗目的學習掌握外源DNA與質(zhì)粒載體的重組連接技術二實驗原理用限制性內(nèi)切酶（如Bpi I）酶切質(zhì)粒后形成線性化載體，載體帶有粘性末端。預先獲得的雙鏈目的DNA片段兩端也帶有與其互補的粘性末端。這樣線性化載體的兩段就可以目的DNA片段的兩段進行正確的配對。在連接酶的催化下，就可以把目的片段連接到質(zhì)粒載體中，形成含有目的片斷的重組載體。此連接產(chǎn)物可轉(zhuǎn)化感受

20、態(tài)細胞并進行重組克隆的篩選。三材料、試劑和儀器1 帶粘性末端的雙鏈DNA片段2 酶切過的質(zhì)粒（psiRNA）3 儀器：恒溫儀或低溫水浴鍋四實驗步驟1反應體系：20l反應體系： l滅菌蒸餾水 13外源片段 3T4 DNA Ligase Buffer(10´) 2酶切過的質(zhì)粒（psiRNA） 1T4 DNA Ligase(5-10U/l) 1 2混勻反應液，在恒溫儀中16過夜五. 思考題1連接反應中如何優(yōu)化載體與外源片段的比例？2目的基因的獲得有哪些途徑？實驗七 CaCl2法制備E.coli感受態(tài)細胞一、實驗目的通過本實驗，掌握大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化的方法及技術。二、實驗原理細菌

21、處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)叫感受態(tài)。轉(zhuǎn)化是指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導入細菌的過程。其原理是細菌處于0，CaCl2低滲溶液中，菌細胞膨脹成球形。轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復合物粘附于細胞表面，經(jīng)42短時間熱擊處理，促進細胞吸收DNA復合物。將細菌放置在非選擇性培養(yǎng)基中保溫一段時間，促使在轉(zhuǎn)化過程中獲得的新的表型（如kanamycin等）得到表達，然后將此細菌培養(yǎng)物涂在含有氨芐青霉素的選擇性培養(yǎng)基上。制備出的感受態(tài)細胞暫時不用時，可加入占總體積15%的無菌甘油或-70保存（有效期6個月）。三材料、試劑和儀器1GT116菌株2LB培養(yǎng)基30.1M CaCl2： 4

22、0.1M CaCl2-MgCl2：5. 滅菌甘油6儀器：冷凍離心機、冰盒等四實驗步驟1 從凍存管取菌GT116劃LB平板，37過夜培養(yǎng)。2 挑取形態(tài)飽滿單菌落，接種3ml LB液體培養(yǎng)基，250rpm，37 過夜培養(yǎng)。3 1：100轉(zhuǎn)接至100ml LB液體培養(yǎng)基，37 ，250rpm培養(yǎng)23h，測OD6000.350.4（培養(yǎng)2.5小時后開始取液測OD，每10min測一次，直至OD0.4，立即停止培養(yǎng)）4 冰上預冷1個2ml EP管，取菌至EP管，每管1.5ml，冰上放置10min。5 4000rpm， 4，離心10min。6 小心倒掉上清，將管倒置紙巾上1min流盡殘液。7 每管加入500

23、l預冷的0.1M CaCl2-MgCl2重懸細胞沉淀，冰浴15min。8 小心倒掉上清，將管倒置紙巾上1min流盡殘液。9 每管加100l 冰預冷的0.1M CaCL2重懸菌體。此時可以按實驗八的步驟進行轉(zhuǎn)化實驗，也可加入總體積15的甘油凍存于80。五思考題 CaCl2法制備感受態(tài)細胞的原理可能是什么？實驗八 重組DNA的轉(zhuǎn)化和克隆篩選一實驗目的1 熟練掌握用重組DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的技術，為基因克隆打好基礎2 學習掌握藍白篩選重組子的原理及操作方法二實驗原理轉(zhuǎn)化是將外源DNA分子入受體細胞，使之獲得新的遺傳特征的一種方法，它是微生物遺傳、基因工程研究等領域的基本實驗技術。本實驗用的psiRN

24、A質(zhì)粒帶有卡那霉素抗性基因（Kan）和LacZ基因。可通過Kan抗性和互補兩種特征來篩選轉(zhuǎn)化子，即：不帶有psiRNA質(zhì)粒DNA的細胞，因無Kan抗性，不能在含有Kan的選擇培養(yǎng)基上生長，僅有psiRNA載體的轉(zhuǎn)化子由于具有-半乳糖苷酶活性，在選擇培養(yǎng)基上呈現(xiàn)為藍色菌落；只帶有重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子由于失去了-半乳糖苷酶活性，故呈現(xiàn)為白色菌落，白色菌落就是轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子擴增后，可將轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA提出，進行電泳和酶切等進一步鑒定。三材料、試劑和儀器1GT116感受態(tài)細胞懸液2重組DNA質(zhì)粒連接溶液3液體SOC培養(yǎng)基、Kan-SOB培養(yǎng)基平板4pUC19質(zhì)粒DNA5滅菌ddH2O6X-ga1（2，m/v

25、）：0.2g X-ga1，用10ml二甲基甲酰胺溶解7IPTG（20，m/v）：2g IPTG，加10ml dH2O溶解8儀器：水浴鍋、冰盒四實驗步驟1 取100l搖勻后的感受態(tài)細胞懸液（如果是冰凍保存則需在冰上解化凍后進行下述的操作）2 加入重組質(zhì)粒DNA連接溶液（含量不超過50ng，體積不超過10l），輕輕吹打以混合內(nèi)容物，冰上放置30分鐘。3 將管放入42水浴中，恰好90s。4 快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，冷卻2 min。5 每管加入400l SOC培養(yǎng)基，（預先加熱SOC培養(yǎng)基至37），然后將管轉(zhuǎn)移到搖床上100rpm輕柔搖動，45min。6 將7ul 20 IPTG 與40 ul 2X-g

26、al混合，用鋪菌器平鋪于Kan-SOB培養(yǎng)基平板表面，靜置數(shù)分鐘晾干。7 將菌液用移液器輕輕吹打均勻。將適當體積（每個平板200l）已轉(zhuǎn)化的細胞轉(zhuǎn)移到已鋪有IPTG和X-gal的Kan-SOB培養(yǎng)基平板上。8 將平板置于室溫直至液體被吸收。9 倒置平板，37培養(yǎng)過夜，觀察菌落。10 對需顯色反應的篩選培養(yǎng)基還需理將平板放于4冰箱3-4小時，使顯色反應充分，藍色菌落明顯。五思考題1.細菌轉(zhuǎn)化實驗應注意哪些事項？ 2如何理解藍白斑篩選（-互補現(xiàn)象）實驗九 利用PCR技術從質(zhì)粒DNA擴增功能基因一實驗目的學習掌握PCR技術的原理及基本操作二實驗原理PCR(Polymerase Chain React

27、ion)技術是Kary Mullis 在1985年建立起來的在細胞外擴增合成DNA的一種方法，即利用DNA聚合酶依賴于DNA模板的特性，在附加兩個引物與模板雜交之后，按堿基配對的原則經(jīng)酶促反應合成DNA片斷，包括模板變性、引物退火及用DNA聚合酶延伸兩個引物之間的DNA的一定次數(shù)的重復循環(huán)，使包括在兩個引物5端限定的特異片斷形成指數(shù)式積累。三材料、試劑和儀器1 重組前和重組后的質(zhì)粒（psiRNA）DNA2 上游和下游引物3 4種dNTPs、Taq polymerase及其Buffer、ddH2O4 儀器：PCR儀、冰盒、凝膠電泳檢測系統(tǒng)等四實驗步驟1反應體系 （l） 水: 38質(zhì)粒： 0.75

28、buffer： 5dNTP: 4引物1： 1引物2： 1酶： 0.25 2反應條件 94 5min94 30s57 30s72 30s72 7min4 2h | |30 cycles 3反應完成后，取3l做電泳以鑒定PCR產(chǎn)物。五思考題1影響PCR效果的因素主要有哪些？2舉例說明PCR技術的應用實驗十 考馬斯亮藍法定量測定蛋白質(zhì)一、實驗目的： 學習考馬斯亮藍（Coomassie Brilliant Blue）法測定蛋白質(zhì)濃度的原理和方法。二、實驗原理考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)濃度，是利用蛋白質(zhì)染料結(jié)合的原理，定量的測定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法。這種蛋白質(zhì)測定法具有超過其他幾種方法的

29、突出優(yōu)點，因而正在得到廣泛的應用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測定法?？捡R斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰（lmax）的位置，由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。通過測定595nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。研究發(fā)現(xiàn)，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合?？捡R斯亮藍染色法的突出優(yōu)點是：（1）靈敏度高， （2）測定快速、簡便， （3）干擾物質(zhì)少。但是仍有一些物質(zhì)干擾此法的測定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）等。三、試劑與器材1、試劑考馬斯亮藍

30、試劑：考馬斯亮藍G250 100mg溶于50mL 95%乙醇中，加入100mL 85%磷酸，用蒸餾水稀釋至1000mL。2、標準和待測蛋白質(zhì)溶液（1）標準蛋白質(zhì)溶液結(jié)晶牛血清蛋白，用0.15mol/L NaCl配制成1mg/mL蛋白溶液。（2）待測蛋白質(zhì)溶液。3、器材恒溫水??；分光光度計。四、實驗方法1、制作標準曲線取7支試管，按下表平行操作。試管編號0123456標準蛋白溶液（mL）00.010.020.030.040.050.060.15mol/L NaCl（mL）0.10.090.080.070.060.050.04考馬斯亮藍試劑（5mLmL）搖勻，1h內(nèi)以0號管為空白對照，在595nm

31、處比色A595nm 繪制標準曲線：以A595nm為縱坐標，標準蛋白含量為橫坐標，在坐標紙上繪制標準曲線。 2、未知樣品蛋白質(zhì)濃度測定測定方法同上，取合適的未知樣品體積，稀釋至其測定值在標準曲線的直線范圍內(nèi)。根據(jù)所測定的A595nm值，在標準曲線上查出其相當于標準蛋白的量，從而計算出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）。注意事項· 在試劑加入后的520min內(nèi)測定光吸收，因為在這段時間內(nèi)顏色是最穩(wěn)定的。 · 測定中，蛋白染料復合物會有少部分吸附于比色杯壁上，測定完后可用乙醇將藍色的比色杯洗干凈。 五、思考題試比較該法與其他幾種常用蛋白質(zhì)定量測定方法的有缺點。

32、實驗十一 蛋白質(zhì)的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳一實驗目的掌握蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳原理和操作技術及應用。二實驗原理DTT及-巰基乙醇等還原劑，能使蛋白質(zhì)分子中二硫鍵還原且不易被氧化，蛋白質(zhì)在SDS存在下能形成SDS-多肽復合物。又知十二烷基磺酸根帶有負電，使各種SDS-多肽復合物都帶有相同密度的負電荷，而且每克蛋白能與1.4克SDS結(jié)合，這樣復合物中SDS的負電荷量大超過了蛋白質(zhì)多肽分子原有的電荷量，因而掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)多肽分子間原有的電荷差別，同時，在水溶液中，SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，改變了蛋白質(zhì)原有的構(gòu)象，所有的SDS-多肽復合物都具有近似長橢圓的形狀，并且不同SDS多肽復合物的短軸

33、長度趨于一致，而長軸與分子量成正比，這樣，SDS-多肽復合物在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的遷移率不再受蛋白質(zhì)多肽原有電荷和形狀的影響，而只與其分子量有關，并且在一定條件下與遷移率成線性關系，可采用此方法測定未知蛋白質(zhì)的分子量。三材料、試劑和儀器1E.coli菌液230丙烯酰胺混合液3Tris-甘氨酸電泳緩沖液4考馬斯亮藍染色液5甲醇：水：冰醋酸脫色液 61×蛋白質(zhì)SDS-PAGE上樣緩沖液1 ml： 710SDS，10過硫酸胺（現(xiàn)配現(xiàn)用），TEMED8儀器：電泳設備、離心機、脫色搖床四實驗步驟1從保存的菌種平板上挑取單個GT116菌落接種于2ml LB液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)過夜。

34、2按1：100轉(zhuǎn)接至100ml LB液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)過夜。3菌液1.5ml，10000轉(zhuǎn)/分離心1分鐘。4棄去上清液，向沉淀中加入100l 1×SDS-PAGE 上樣緩沖液，沸水浴5分鐘。5. 15000rpm 離心5分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中。取10l進行電泳分析。6. 按儀器說明書安裝好灌膠裝置。標記梳齒下0.7cm的位置。7按下述配方和順序，依次混勻各成分制備分離膠，灌膠前才加TEMED。 分離膠（12，10ml）H2O 3.3ml30 丙烯酰胺混合液 4.0ml1.5M Tris-HCl(pH8.8) 2.5ml10% SDS 0.1ml10%過硫酸銨 0.1m

35、lTEMED（灌膠前加） 0.004ml8. 一旦加入TEMED后，凝膠即開始聚合。應立即快速旋動混合物并進行下一步。9. 用10ml注射器將溶液灌至兩塊玻璃板之間的間隙中，至液面到達梳齒下0.7cm的位置。尖頭滴管小心的在丙稀酰胺溶液上方覆蓋一層水。10. 待聚合完成（約30min），倒掉覆蓋層，用去離子水清洗凝膠頂部數(shù)次以除去殘留的未聚合的丙稀酰胺，盡可能排去凝膠上的液體，再用濾紙條吸盡殘留的水。11. 按下述配方和順序，依次混勻各成分制備濃縮膠，灌膠前才加TEMED。 濃縮膠（5，4ml）H2O 2.7ml30丙烯酰胺混合液 0.67ml1.0 M Tris-HCl(pH6.8) 0.5

36、ml10% SDS 0.04ml10%過硫酸銨 0.04 mlTEMED （灌膠前加） 0.004ml12 將濃縮膠溶液直接灌至聚合好的分離膠上，立即在其中插入一塊干凈的梳子，注意不要混入氣泡，然后再加一些濃縮膠溶液徹底填滿梳子之間的孔隙。13. 在濃縮膠聚合完成后（約30分鐘）小心的拔下梳子，立即用去離子水洗滌加樣槽，以除去未聚合的丙稀酰胺。14. 將凝膠玻璃板固定在電泳裝置上，在上下槽中加入Tris-甘氨酸電泳緩沖液。15. 按順序加樣。每個樣品加10ul。每加完一個樣品后可在下槽緩沖液中洗滌吸頭。在不用的樣品孔中加等體積的1×SDS凝膠上樣緩沖液。16. 將電泳裝置與電源連接（

37、正極接下槽），在凝膠上加8V/cm電壓。待染料前沿進入分離膠后，將電壓提高到15V/cm繼續(xù)電泳，直至溴酚藍達到分離膠的底部，然后關閉電源。17. 從電泳裝置上脅下玻璃板，小心撬開玻璃板，切下凝膠一角，記住切角方向。18. 將凝膠泡在至少5倍體積染色液中，置于脫色搖床上平緩搖動至少4小時。19. 移出染液。將凝膠浸泡于脫色液中，平緩搖動48小時，其間更換脫色液三、四次。20. 脫色后，將凝膠保存在水中，封存在塑料袋內(nèi)（可加入20甘油長期保存）。五思考題SDS、TEMED、過硫酸胺等試劑有何作用？實驗十二 Western Blotting（示教）一實驗目的了解蛋白質(zhì)印跡的方法和操作要點。二實驗原

38、理蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移并固定在化學合成膜的支撐物上，然后以特定的親和反應、免疫反應或結(jié)合反應及顯色系統(tǒng)分析此印跡。蛋白質(zhì)印跡(免疫印跡)的實驗包括5個步驟：1)固定：蛋白質(zhì)進行聚丙烯酰胺凝膠電泳并從膠上轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。2)封閉：保持膜上沒有特殊抗體結(jié)合的場所，使場所處于飽和狀態(tài)，用以保護特異性抗體結(jié)合到膜上,并與蛋白質(zhì)反應。3)初級抗體(第一抗體)是特異性的。4)第二抗體或配體試劑對于初級抗體是特異性結(jié)合并作為指示物。5)適當保溫后的酶標記蛋白質(zhì)區(qū)帶，產(chǎn)生可見的、不溶解狀態(tài)的顏色反應，或催化底物發(fā)光，用膠片記錄結(jié)果?；瘜W發(fā)光底物由于具有更高的靈敏度

39、，近年已得到廣泛使用。三材料、試劑和儀器1 轉(zhuǎn)移緩沖液2 Tris緩沖鹽溶液（TBS）、TBST3 封閉液：4 麗春紅S： 5 PVDF膜、濾紙6 載有哺乳動物細胞裂解蛋白的電泳凝膠 7 第一抗體（兔抗actin）、第二抗體（標記HRP的羊抗兔）8 顯色底物（DAB）9 儀器：電轉(zhuǎn)移設備、玻璃器皿、塑料袋四實驗步驟1戴手套將PVDF膜裁成比凝膠略大的小塊。將濾紙裁成比凝膠略小的小塊，共六塊。2. 用甲醇浸泡PVDF膜2分鐘。（NC膜和尼龍膜無需此步驟）3將載有蛋白的凝膠、PVDF膜和六塊濾紙分別放入轉(zhuǎn)移緩沖液中漂洗10min4將并凝膠、PVDF膜和濾紙做成“三明治”狀，濾紙上下各三塊。放入轉(zhuǎn)印

40、夾中（見下圖）極極濾紙印跡夾海綿電泳凝膠PVDF膜5 在轉(zhuǎn)印槽中倒入轉(zhuǎn)印緩沖液，將印跡夾放入，膠朝負極，PVDF膜朝正極。6 300mA電流下，轉(zhuǎn)印1.5h。7 轉(zhuǎn)印結(jié)束后，取下PVDF膜，用麗春紅S染液染色5分鐘。8 用水輕柔漂洗PVDF膜5分鐘，可看到被染色的蛋白質(zhì)條帶。9 將PVDF膜浸入適量封閉液中，置于脫色搖床上緩慢搖動，室溫封閉1小時。10 用TBS漂洗膜三次，每次5min。11 將一抗按照合適的比例用TBST稀釋，將PVDF膜浸入一抗稀釋液中，放在脫色搖床上平緩搖動，4過夜。12 用TBS漂洗膜三次，每次5min。13 將二抗按照合適的比例用封閉液稀釋，將PVDF膜浸入一抗稀釋液

41、中，放在脫色搖床上平緩搖動，室溫1小時。14 用TBS漂洗膜三次，每次5min。15 將膜浸入DAB顯色液中顯色。小心的觀察顯色過程。一旦條帶顏色深度達到要求，即用水略漂洗終止反應。五、思考題 Western blotting的原理是什么？實驗十三 應用ELISA技術檢測乙肝表面抗原一、實驗目的：熟悉ELISA技術的原理和方法二、實驗原理：1971年Engvall和Perlmann發(fā)表了酶聯(lián)免疫吸附劑試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量測定的文章，使得1966年開始用于抗原定位的酶標抗體技術發(fā)展成液體標本中微量物質(zhì)的測定方法。這一

42、方法的基本原理是：使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關，故可根據(jù)顏色反應的深淺刊物定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大地地放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。

43、ELISA的類型有：1. 雙抗體夾心法測抗原雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：（1）將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。（2）加受檢標本：使之與固相抗體接觸反應一段時間，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合，形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。（3）加酶標抗體：使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量正相關。（4）加底物：夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。根據(jù)同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結(jié)合物，即可

44、用雙抗原夾心法測定標本中的抗體。2. 雙抗原夾心法測抗體 3. 間接法測抗體 間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標記的抗抗體以檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：（1）將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。（2）加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結(jié)合，在洗滌過程中被洗去。（3）加酶標抗抗體：與固相復合物中的抗體結(jié)合，從而使該抗體間接地標記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測人對某種疾病的抗體，

45、可用酶標羊抗人IgG抗體。（4）加底物顯色：顏色深度代表標本中受檢抗體的量。本法只要更換不同的固相抗原，可以用一種酶標抗抗體檢測各種與抗原相應的抗體。4. 競爭法競爭法可用于測定抗原，也可用于測定抗體。以測定抗原為例，受檢抗原和酶標抗原競爭與固相抗體結(jié)合，因此結(jié)合于固相的酶標抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下：（1）將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體。洗滌。（2）待測管中加受檢標本和一定量酶標抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應。如受檢標本中無抗原，則酶標抗原能順利地與固相抗體結(jié)合。如受檢標本中含有抗原，則與酶標抗原以同樣的機會與固相抗體結(jié)合，競爭性地占去了酶標抗原與固相載體結(jié)合的機會

46、，使酶標抗原與固相載體的結(jié)合量減少。參考管中只加酶標抗原，保溫后，酶標抗原與固相抗體的結(jié)合可達最充分的量。洗滌。（3）加底物顯色：參考管中由于結(jié)合的酶標抗原最多，故顏色最深。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差，代表受檢標本抗原的量。待測管顏色越淡，表示標本中抗原含量越多。5. 捕獲包被法測抗體血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在，后者會干擾IgM抗體的測定。因此測定IgM抗本多用捕獲法，先將所有血清IgM（包括異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再測定特異性IgM。操作步驟如下：（1）將抗人IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗人IgM。洗滌。（2）加入

47、稀釋的血清標本：保溫反應后血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質(zhì)成分。（3）加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結(jié)合。洗滌。（4）加入針對特異性的酶標抗體：使之與結(jié)合在固相上的抗原反應結(jié)合。洗滌。（5）加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標本中的特異性IgM抗體存在，是為陽性反應。三、儀器、材料、試劑1. HBsAg ELISA檢測試劑盒2. 酶標儀四、實驗方法參照試劑盒使用說明書。五、思考題ELISA的原理是什么？有哪些類型？附錄一 溶液配方一、培養(yǎng)基1. LB培養(yǎng)基配制每升LB培養(yǎng)基，在950ml去離子水中加入：胰化蛋白胨 10g酵母提取物 5gN

48、aCl 10g搖動容器至溶質(zhì)溶解，用5M NaOH調(diào)pH值至7.0，用去離子水定容至1L。在1.05kg/cm2高壓蒸汽滅菌20分鐘。2. SOB培養(yǎng)基配制每升SOB培養(yǎng)基，在950ml去離子水中加入：胰化蛋白胨 20g酵母提取物 5gNaCl 0.5g搖動容器至溶質(zhì)溶解，加10ml 250mM KCl溶液（將1.86g KCl用100ml去離子水溶解即配成250mM KCl溶液）。用5M NaOH調(diào)pH值至7.0，用去離子水定容至1L。在1.05kg/cm2高壓蒸汽滅菌20分鐘。該溶液在使用前，加入5ml滅菌的2M MgCl2（用90ml去離子水溶解19g MgCl2，用去離子水調(diào)整體積為1

49、00ml，在1.05kg/cm2高壓蒸汽滅菌20分鐘。）3. SOC培養(yǎng)基SOC培養(yǎng)基除含有20mM 葡萄糖以外，其他成分與SOB相同。SOB培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后冷至60或60以下，加20ml除菌的1M葡萄糖溶液（用90ml去離子水溶解18g 葡萄糖，用去離子水調(diào)整體積為100ml，用0.22l濾器過濾除菌）4. 含有瓊脂的培養(yǎng)基按上述配方配制液體培養(yǎng)基，高壓滅菌前加入細菌培養(yǎng)用瓊脂（15g/L），在1.05kg/cm2高壓蒸汽滅菌20分鐘。溫度降至5060，方可加入不耐熱物質(zhì)（如抗生素）。為避免產(chǎn)生氣泡，混勻培養(yǎng)基應采用旋動方式，然后倒置平板。二、緩沖液和其他溶液1. 溶液I（制備質(zhì)粒）50m

50、M葡萄糖、25mM Tris-Cl（pH8.0）、10mM EDTA（pH8.0），在1.05kg/cm2高壓蒸汽滅菌15分鐘，保存于4。2. 溶液II（制備質(zhì)粒）0.2N NaOH（從10N貯存液中現(xiàn)用現(xiàn)稀釋）、1（m/v）SDS。溶液II要現(xiàn)用現(xiàn)配，常溫下使用。3. 溶液III（制備質(zhì)粒）5M乙酸鉀 60ml冰乙酸 11.5mlH2O 28.5ml保存于4，用時置冰浴。4. Tris-Cl 1M用800ml蒸餾水溶解121.1g Tris堿，加濃鹽酸調(diào)pH至所需值。pH HCl7.4 70ml7.6 60ml8.0 42ml溶液冷卻至室溫后方可調(diào)定pH值。加水定容至1L，分裝后高壓蒸汽滅菌

51、。5. EDTA （0.5M，pH8.0）將186.1g EDTA二鈉加入800ml水中，在磁力攪拌器下劇烈攪拌。用NaOH固體顆粒調(diào)節(jié)溶液pH值8.0，定容至1L。分裝后高壓蒸汽滅菌。EDTA二鈉鹽需將pH值調(diào)至接近8.0時才會溶解。6. TE以下為10×TE（Tris EDTA）的配方pH 7.4100mM Tris-Cl（pH7.4）10mM EDTA（pH8.0）pH 7.6100mM Tris-Cl（pH7.6）10mM EDTA（pH8.0）pH 8.0100mM Tris-Cl（pH8.0）10mM EDTA（pH8.0）分裝后在1.05kg/cm2高壓蒸汽滅菌20分鐘

52、，室溫保存。7. STE10mM Tris-Cl（pH8.0）、0.M NaCl、1mM EDTA（pH8.0），在1.05kg/cm2高壓蒸汽滅菌15分鐘，保存于4。8. SDS （10，m/v）用900ml溶解100g電泳級SDS，加熱到68并在磁力攪拌器下劇烈攪拌。無需滅菌，室溫保存。9. 乙酸鈉（3M，pH5.2和7.0）用800ml水溶解408.3g三水乙酸鈉，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至5.2或用稀乙酸調(diào)pH至7.0。用水定容至1L，分裝成小份，高壓蒸汽滅菌。10. RNA酶A25mg溶解于0.01M乙酸鈉（pH5.2）2.5ml，濃度為10mg/ml，加熱到100，15min，室溫慢慢冷卻。用0.1體積（0.25ml）1M Tris-Cl調(diào)整到pH7.4，分裝后-20凍存。11. 普通抗生素溶液抗生素貯存液工作濃度濃度保