化學發(fā)光免疫法檢測AFP的空白限_檢出限和定量檢測限的建立與

1、臨床檢驗雜志2010年11月第28卷第6期Chin J Clin Lab Sci ，Nov2010，Vol28，No6·469·764X （2010）06-469-03文章編號：1001-·質(zhì)量管理研究·化學發(fā)光免疫法檢測AFP 的空白限、檢出限和定量檢測限的建立與評價*溫冬梅，張秀明，王偉佳，黃福達，何娟，肖禮紅，歐陽能良，吳劍楊，李曼，龐嘉琳（中山大學附屬中山醫(yī)院檢驗醫(yī)學中心，廣東中山528403）摘要：目的建立并評價化學發(fā)光免疫法檢測甲胎蛋白（AFP ）的空白限（LoB ）、檢出限（LoD ）和定量檢測限（LoQ ）。方法參A 文件，考CLSI E

2、P17-將AFP 空白樣品和系列低濃度樣品在Bayer Centaur 240化學發(fā)光免疫檢測系統(tǒng)上進行檢測，依據(jù)數(shù)據(jù)LoD 和LoQ ，采用相應(yīng)的統(tǒng)計學方法，確定血清AFP 的LoB 、同時用傳統(tǒng)方法建立AFP 的檢測低限（LLD ）、生物檢的分布規(guī)律，測限（BLD ）和功能靈敏度（FS ）。結(jié)果A 方案建立的LoB 為080ng /ml，LoD 為260ng /ml，LoQ 為330ng /ml；應(yīng)用EP17-應(yīng)用兩種方法建立的LoB 和LLD 均低于BLD 為220ng /ml，F(xiàn)S 為220ng /ml。結(jié)論用常規(guī)方法建立的LLD 為100ng /ml，Bayer Centaur 24

3、0化學發(fā)光免疫系統(tǒng)檢測AFP 的分析靈敏度得到驗證確認；實驗室在驗證儀儀器說明書聲明的靈敏度性能，器聲明的LoB 時，應(yīng)同時建立檢測系統(tǒng)的LoD 和LoQ ，以便為臨床提供更為可靠的檢驗結(jié)果。兩種評價方案均具有實用性，國內(nèi)實驗室可視具體情況選擇不同的評價方案。關(guān)鍵詞：甲胎蛋白；方法學評價；分析靈敏度中圖分類號：R446文獻標識碼：A1根據(jù)醫(yī)療機構(gòu)臨床實驗室管理辦法和醫(yī)時取不同濃度的低濃度樣品各1支，待溶解混勻后與常規(guī)標本同等條件下進行測定。15常規(guī)方法4-5參照文獻確定AFP 的LLD 、BLD 和FS 。空白樣品作10次批內(nèi)重復(fù)測定，低濃度樣品作日間重復(fù)測定，共10d ，記錄光強度值（RLU

4、s ）。16EP17-A 方法A 文件3確定AFP 參照EP17-LoD 和LoQ ?？瞻讟悠愤M行60次測定，的LoB 、每日1批，每批重復(fù)檢測12次，共5d ，記錄濃度值。6個濃度的低濃度樣品作日間重復(fù)測定，每日2批，每批共5d ，記錄濃度值。相隔時間2h ，17統(tǒng)計方法LLD 、BLD 和FS 的統(tǒng)計方法參照文獻空白限（LoB ）按國際標準化組織（ISO ）的1714-5。172建議，設(shè)定類錯誤和類錯誤水平均為5%（=5%），若空白值呈正態(tài)分布，按下式計算空白限：LoB =B +1645B （式中B 和B 分別為空白樣品檢測值的均值和標準差）。若空白值呈非正態(tài)分布，則用非參數(shù)方法估計第95

5、百分位數(shù)（Pct B ）的N B （/100）+05即：LoB =Pct B 100-，即：LoB =在值，095 N B +05位置的結(jié)果。位置的結(jié)果=在注：式中N B 是重復(fù)檢測的次數(shù)，是百分位數(shù)。173檢出限（LoD ）若低濃度樣品檢測結(jié)果呈學實驗室認可的要求2，臨床實驗室必須對檢測系統(tǒng)的主要分析性能進行驗證確認或分析評價，證實其能夠滿足預(yù)期的質(zhì)量要求后才能用于常規(guī)檢測。分析靈敏度是檢測系統(tǒng)的主要性能指標之一，本文參考美國臨床和實驗室標準化協(xié)會（CLSI ）發(fā)布的檢出限和定量檢測限的確定方案，建立化學發(fā)光免疫法檢測AFP 的空白限（LoB ）、檢出限（LoD ）和定量檢測限（LoQ ），

6、并與傳統(tǒng)方法比較，現(xiàn)報道如下。111材料與方法檢測系統(tǒng)Bayer Centaur 240化學發(fā)光免疫4-53建立的檢測低限（LLD ）、生物檢測限（BLD ）和功能靈敏度（FS ）進行分析儀及原裝試劑、校準品（批號為CD54L 、CD54H ）和質(zhì)控品（批號為9827301和9827302）。1213空白樣品低濃度樣品用Bayer 原裝配套AFP 稀釋液作用Bayer 原裝配套AFP 稀釋液為空白樣品。對AFP 濃度為550ng /ml的新鮮血清作系列稀釋，配制成一系列低濃度的AFP 樣品，其理論濃度（ng /ml）分別為0（空白）、110、165、220、330、440、550，介于預(yù)期檢測

7、限濃度1 4倍。14樣品保存將配制好的系列低濃度樣品分裝于帶蓋一次性試管內(nèi)于20 冰箱保存，每次測定*基金項目：廣東省醫(yī)學科研基金項目（2009A2009763），中山市科技計劃項目（20091A038）。1976年生，作者簡介：溫冬梅，女，副主任技師，學士，主要從事臨床生物化學檢驗和實驗室管理工作。E-mail ：zxm0760163com 。通訊作者：張秀明，主任技師，碩士研究生導(dǎo)師，·470·臨床檢驗雜志2010年11月第28卷第6期Chin J Clin Lab Sci ，Nov2010，Vol28，No6正態(tài)分布，計算多個低濃度樣品的綜合標準差（SDs ）：SD

8、s =1SD 1+n 2SD 2+n 3SD 3+n m SD m n 1+n 2+n 3+n m和第58個觀察值的均數(shù)。將60個空白檢測值由小第57和第58位置均為08到大排序（見表2），ng /ml，故LoB =08ng /ml。表2秩號5152535455n 2n m 代表不同低濃度樣品的自由度。式中n 1，LoD =LoB +C SD S C 是標準正態(tài)分布第95百分C =1645/（11/4f ），f 是SDs 位數(shù)值的校正因子，。的自由度若低濃度樣品檢測結(jié)果不呈正態(tài)分布，或不能按非參數(shù)方法估計LoD ，計算公式轉(zhuǎn)化為正態(tài)分布，如下：LoD =LoB +D S ，（D S ，是低濃度

9、樣品測定中位數(shù)和第5個百分位數(shù)值的間距）。174定量檢測限（LoQ ）依據(jù)臨床要求和室間質(zhì)量評價的允許誤差，設(shè)定本實驗室AFP 的總誤差在不考慮分析偏差的條件下，總誤差目標為20%，=2CV ，如果低濃度樣品的CV 1/2總誤差，則LoQ =LoD 。221結(jié)果檢測低限（LLD ）批次60個空白值中最高的10個值（ng /ml）空白值0506060608秩號5657585960空白值080808081025檢出限（LoD ）低濃度樣品測定結(jié)果見表3。60個低濃度樣品檢測結(jié)果呈非正態(tài)分布，使用非參D S ，數(shù)程序估計LoD ，即：LoD =LoB +D S ，是低濃度樣品測定值中位數(shù)和低濃度樣品

10、的第5個百分位數(shù)值的間距，低濃度樣品中位數(shù)=320，第5百分位數(shù)的值=（60 005+05）=第35秩號的值=140，D S ，故LoD =LoB +=320140=180，D S ，=080+180=260ng /ml。表3110160170130210230250140120260150低濃度AFP 樣品測定結(jié)果（ng /ml）1651802101602801801902901402201902202703002502803202902501802503303303503904103904403903203203703704904205104804604904604304305204905

11、50620550550570590580520590590550空白樣品10次重復(fù)測定光A 空白為19979，強度值（RLUs ）的均值珔標準差（s ）為126，按997%的可信限，空白樣品RLUs 的3s 為378，550ng /ml檢測限樣本的RLUs 為2088，RLUs 為378時相當于：LLD =（378/2088） 550=100ng /ml，所以本法的LLD 為100ng /ml。22生物檢測限（BLD ）220ng /ml實驗樣品的RLUs 減3s 后RLUs 為384，剛大于378，故本法的生物檢測限為220ng /ml。結(jié)果見表1。表1低濃度樣品AFP （ng /ml）測定

12、的RLUs 結(jié)果及生物檢測限110RLUs X A 空白s CV （%）x 3s 珋5882053492716569917825516522090917519338433013321491128854401743134771342550208811153175426定量檢測限（LoQ ）本實驗室依據(jù)臨床需求及權(quán)威機構(gòu)規(guī)定的分析質(zhì)量要求設(shè)定化學發(fā)光免疫法檢測AFP 的總誤差目標為20%，在不考慮分析偏允許總誤差（TEa ）=2CV ，即CV =1/差的情況下，2TEa 。AFP 濃度在330ng /ml時檢測的日間CV 為956%，剛好小于10%，符合質(zhì)量目標要求，因此LoQ =330ng /m

13、l，結(jié)果見表4。表4化學發(fā)光法測定低濃度AFP 樣品（ng /ml）的日間CV110x （ng /ml）珋s （ng /ml）CV （%）18204926781652040462248220272041150533037503695649046703065055057102747923功能靈敏度（FS ）以日間CV 為20%時對應(yīng)220ng /ml濃度低濃度樣品具有的平均濃度為FS ，的實驗樣品日間CV 為193%，最接近20%，故FS 為220ng /ml。結(jié)果見表1。24空白限（LoB ）空白樣品的檢測結(jié)果呈非正態(tài)分布，故用非參數(shù)程序估計LoB ，即估計第95百LoB =N B （/100

14、）+05=分位數(shù)（Pct B ）的值，60 （95/100）+05=575位置的結(jié)果，即第57松柏3討論Petersen 、Gregori Casals 、國內(nèi)外相關(guān)報道中，鄭4-8等分別對化學發(fā)光免疫檢測系統(tǒng)檢測不同臨床檢驗雜志2010年11月第28卷第6期Chin J Clin Lab Sci ，Nov2010，Vol28，No6·471·BLD 和FS 進行確定或驗證，項目的LLD 、本實驗以AFP 為例對LLD 、BLD 和FS 的研究結(jié)果與文獻4-5報道的結(jié)果基本一致，證實了廠商聲明的性能。A 方案建立的LoB 本實驗結(jié)果顯示，用EP17-為08ng /ml，低于

15、儀器說明書聲明的靈敏度13ng /ml，LoD 為260ng /ml，LoQ 為330ng /ml。即該檢測系統(tǒng)在符合質(zhì)量要求下能可靠地檢出AFP 的最低實際濃度為330ng /ml。本實驗室用該檢測系統(tǒng)檢測AFP 結(jié)果報告時，若AFP 結(jié)果低于08“分析物未檢出，；ng /ml，則報告濃度小于08ng /ml”若AFP 檢測結(jié)果高于08ng /ml小于260ng /ml，“有分析物檢出，則報告但不能準確定量，濃度小于260ng /ml”；若AFP 檢測結(jié)果高于330ng /ml，則直接報告檢測結(jié)果。臨床醫(yī)生可放心使用濃度高于330ng /ml的AFP 結(jié)果。兩種靈敏度評價方法主要有以下區(qū)別9

16、能符合臨床的質(zhì)量需求。（5）目前所有的試劑廠商在試劑說明書中只提供了按常規(guī)方法檢測得出的檢測低限，沒有提供必須滿足實驗室質(zhì)量要求的定量檢測限以及在接近定量檢測限處的不確定度，廠商A 文件對檢測系統(tǒng)所有檢驗項目的檢若參照EP17-實驗數(shù)據(jù)的收集和測低限和定量檢測限進行確定，統(tǒng)計學處理科學嚴謹，可以方便臨床實驗室通過簡單的程序?qū)ζ浣⒌臋z測限值及不確定度進行驗證和確認。A 文件建立LoD 和LoQ 是綜上所述，用EP17-評價化學發(fā)光免疫檢測系統(tǒng)靈敏度性能的標準方法，可更好地為臨床提供準確可靠的AFP 低濃度結(jié)果，為臨床診斷、治療監(jiān)測提供重要信息，但成本較高。常規(guī)方法操作簡便、成本較低，若數(shù)據(jù)呈正

17、態(tài)分布，也具有較高的應(yīng)用價值。國內(nèi)實驗室可視具體情況選擇不同的評價方案。4參考文獻：（1）常規(guī)方法確定化學發(fā)光免疫檢測系統(tǒng)檢測AFP 的LLD 、BLD 和FS 的空白樣品檢測數(shù)為10次，低濃度A 方案要求確定LoD 的樣品檢測數(shù)為10次。EP17-最小檢測數(shù)為60次，樣品重復(fù)檢測的次數(shù)多，估計的LoD 不確定度較小，結(jié)果更可靠。（2）參照常規(guī)方法確定化學發(fā)光免疫檢測系統(tǒng)檢測AFP 的LLD 、BLD 、FS 均使用光強度值（RLUs ）來計算，但目前實驗室部份儀器存在局限性，即只能報告分析物的濃度，而沒有原始的分析信號。所以常規(guī)方法不適用于實驗室對所有儀器的靈敏度進行評價。參照EP17-A

18、文件進行化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)檢測AFP LoD 和LoQ ，的LoB 、直接使用檢測出的分析物濃度進行計算，符合實驗室的實際情況，統(tǒng)計分析輸入檢測數(shù)據(jù)時簡便易行。（3）常規(guī)方法對靈敏度性能評價均假設(shè)實驗數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，使用參數(shù)的程序進行估計，但實際中大部份實驗數(shù)據(jù)均呈非正態(tài)分布，EP17-A 方案可以彌補常規(guī)方法的不足，可根據(jù)實驗LoD 。數(shù)據(jù)分布選擇參數(shù)或以非參數(shù)程序確定LoB 、（4）常規(guī)方法確定生物檢測限只是考慮了樣品單次檢測的信號有95%或99%的可能性，這樣的低值結(jié)A 方案考慮果有很大誤差，影響了臨床應(yīng)用；EP17-了分析物在低水平處的偏倚與不精密度，以檢驗的充分保證了低濃度檢測結(jié)果允許誤差來估計LoQ ，12006-02-07中國衛(wèi)生部醫(yī)療機構(gòu)臨床實驗室管理辦法Z 2ISO /DIS151892-2007醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力的要求S 2007中國國家實驗室國家認可委員會，3EP17-AProtocols for Determination of Limits of Detection and Lim-its of Quantitation ；Approved Guideline S NCCLS ，200