木犀草素體內(nèi)抗炎作用機(jī)制研究

1、木犀草素體內(nèi)抗炎作用機(jī)制研究         11-03-22 10:40:00     編輯：studa20                       作者：張毅，王旭光，楊展，何惠娟【摘要】  目的 探討木犀草素(Lut)的體內(nèi)抗炎療效及作用機(jī)

2、制。方法 采用角叉菜膠致大鼠足爪腫脹模型，觀察Lut對(duì)足爪腫脹度的影響；酶免疫測定法( EIA)測定炎足足跖部的滲出液前列腺素E2（PGE2）的含量；免疫組織化學(xué)法(IHC)及免疫印跡(Western blot)法檢測角叉菜膠致炎大鼠足爪組織環(huán)氧合酶2（COX2）的表達(dá)情況。結(jié)果 Lut可抑制角叉菜膠致炎的大鼠足爪腫脹。80、120 mg/kg Lut可顯著降低足爪炎癥組織前列腺素E2（PGE2）生成，并顯著抑制炎足爪中COX2的蛋白表達(dá)。結(jié)論 Lut具有較強(qiáng)的抗炎作用，其機(jī)制可能與抑制COX2的表達(dá)及PGE2的釋放有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  木犀草素；環(huán)氧合酶2；炎癥；前列腺素E2

3、60;       Abstract: Objective   To investigate the antiinflammatory effect and mechanism of luteolin invivo. Methods   The model of carrageenaninduced edema of rat hind paws was prepared. The edema model was treated with luteolin and dexamethasone (f

4、or a positive control). The PGE2 content in the edema exudate was measured by EIA. The COX2 expression of the edema paws was detected by immunohistochemistry and Western blot. Results   Luteolin reduced the paw edema, the PGE2 contents in the exudate and the COX2 protein expression in the

5、edema paws. Conclusion  Luteolin has an antiinflammatory effect on rat inflammation induced by carrageenan probably through the mechanisms of the inhibition of COX2 protein expression and of PGE2 production.     Key words: luteolin; cyclooxygenase2; inflammation；prostaglandin E2

6、    木犀草素(Luteolin，Lut)屬于黃酮類化合物，主要存在于菊花、忍冬花、紫蘇葉等天然藥物，近年研究表明Lut具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用12。我們研究發(fā)現(xiàn)Lut在體外能抑制環(huán)氧合酶2(COX2) mRNA及蛋白表達(dá)，同時(shí)降低NFB的DNA結(jié)合活性和蛋白表達(dá)3，其抗炎機(jī)制可能與此有關(guān)。為進(jìn)一步探討Lut的抗炎作用機(jī)制，我們建立大鼠足爪腫脹炎癥模型，研究Lut對(duì)炎癥大鼠 COX2 表達(dá)及前列腺素E2（PGE2）生成的影響。    1  材料和方法    1.1 

7、材料    清潔級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量150250 g，由廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。角叉菜膠、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺等為美國Sigma 公司產(chǎn)品；Lut（純度>98%）和PGE2 EIA Kit為美國Cayman公司產(chǎn)品；actin山羊IgG多克隆抗體、COX2山羊IgG多克隆抗體、免疫組化SP試劑盒均為北京中山公司產(chǎn)品；PVDF膜為美國Pall Gelman公司產(chǎn)品。    1. 2  方法1.2.1  大鼠分組50只大鼠隨機(jī)分為5組，分別為空白對(duì)照組、2mg/kg地塞米松(Dex)陽性對(duì)照組及40、8

8、0、120mg/kg Lut 3個(gè)劑量組，每組10只。實(shí)驗(yàn)時(shí)分別腹腔注射等體積生理鹽水、地塞米松及40、80、160mg/kg劑量的Lut。1.2.2  大鼠足爪腫脹測定 腹腔注射給藥30 min后于大鼠右后足跖皮下注射1% 角叉菜膠0.1mL/只致炎，分別在致炎前，致炎后0.5、1、2、3、4、5 h用大鼠足爪容積測定儀測量炎足爪容積，計(jì)算各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)足爪腫脹度。    腫脹度(mL)=致炎后右后足容積致炎前右后足容積。1.2.3  大鼠足爪炎性滲出物中PGE2含量的測定 大鼠右后足致炎5 h后處死大鼠，于大鼠右踝關(guān)

9、節(jié)處剪下足爪，稱重剝皮浸泡于5 mL 生理鹽水中浸泡30 min，取出足爪，離心浸泡液15 min(3000×g)，取上清液0.5 mL，以PGE2 EIA Kit測定其中的PGE2含量(g/g)，并計(jì)算抑制率。抑制率IR(%)=對(duì)照組PGE2含量-給藥組PGE2含量對(duì)照組PGE2含量×100%1.2.3  Western blot 取足跖致炎組織約20 mg加入0.2 mL細(xì)胞裂解液在勻漿器中勻漿后，將裂解液于冰上超聲破碎細(xì)胞（10s/次×3次，間隔15s），4，12 000g離心10 min, 收集上清液，考馬斯亮藍(lán)（G250）染色法測上清

10、液蛋白質(zhì)含量。每組各取50 g蛋白質(zhì)樣品加上樣緩沖液煮沸變性后，進(jìn)行10%SDS PAGE；電轉(zhuǎn)移至PVDF膜；用含5%脫脂奶粉的TBS(PH8.0)封閉2 h；分別加入適量COX2和actin多克隆抗體，搖床上室溫反應(yīng)2 h；洗膜3次每次20 min；加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫反應(yīng)2 h；洗膜后作ECL化學(xué)發(fā)光，X片曝光顯影。圖像經(jīng)掃描儀掃描后，用圖像分析軟件BandScan 5.0進(jìn)行光密度積分值分析，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參照actin蛋白表達(dá)量的光密度積分值之比作為目的蛋白表達(dá)量的相對(duì)含量值。1.2.4  免疫組織化學(xué)（IHC） 取足跖部位的組織，用10%中性緩沖福

11、爾馬林及時(shí)固定，石蠟包埋，切片，貼片，常規(guī)脫蠟。0.1mol/L PBS(pH 7.4)浸泡5 min。微波修復(fù)抗原。滴加正常山羊血清封閉液(試劑B)，室溫20 min。滴加1:50稀釋的COX2羊IgG單克隆抗體，陰性對(duì)照以PBS代替一抗，于4孵育過夜。PBS洗3次。滴加鏈霉菌抗生物素過氧化物酶溶液(試劑C)，室溫孵育10 min， PBS沖洗3次。滴加試劑SABC(試劑D)，37，30 min，PBS沖洗3次。DAB顯色。蘇木素輕度復(fù)染。脫水，透明，中性膠封片。顯微鏡觀察。結(jié)果判斷：以胞漿出現(xiàn)淡黃至褐黃色細(xì)顆粒狀著色為陽性細(xì)胞，光學(xué)顯微鏡下觀察，每組隨機(jī)計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性表達(dá)率。同時(shí)觀察染色強(qiáng)度，按染色強(qiáng)度著色淡黃為弱陽性（+），棕黃為陽性（），棕褐為強(qiáng)陽性（），無著色為陰性（）。1.2.5  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，行單因素方差分析及Dunnett's檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。    2  結(jié)果    2. 1  Lut對(duì)角叉菜膠誘導(dǎo)大鼠足爪腫脹的影響    結(jié)果表明，40 mg/kg Lut組在0.5、1、2、3、4、5 h