競爭性化學發(fā)光酶免疫分析法檢測睪酮

1、競爭性化學發(fā)光酶免疫分析法檢測睪酮    劉明澤黃嵐李振雪徐偉張旗劉杰 中國圖書分類號R392-33 摘要目的：建立高靈敏度的化學發(fā)光酶免疫分析法(CLEIA)檢測睪酮。方法：包被抗體、標記抗原或包被抗原、標記抗體，用辣根過氧化物酶標記，魯米諾增敏化學發(fā)光體系作為酶底物。結果：包被二抗、標記睪酮的方法靈敏度高、操作簡便，靈敏度為0.063 ng/ml，睪酮濃度為1.0、5.0和10.0 ng/ml時，批內變異5.8%7.4%(n=20)，批間變異為6.6%8.7%(n=20)，回收率為98.2%104.0%。與5-二氫睪酮交叉反應為20.0%，與其它類固

2、醇無明顯交叉反應。此法與寶靈曼(BM)直接酶免疫分析試劑盒比較有較好的相關性，CLEIA=0.915 BM+0.598 ng/ml，n=128，r=0.971，P0.001。結論：此法靈敏度高，有較好的準確性和重復性，與商品試劑盒有較好的相關性，適合臨床應用。 關鍵詞化學發(fā)光酶免疫分析法睪酮魯米諾 Competitive chemiluminescent enzyme immunoassay for testosterone LIU Ming-Ze, HUANG Lan, LI Zhen-Xue et al. Pilotech Institute of Biomedical Engeneeri

3、ng, People's Hospital, BMU, Beijing 100034 AbstractObjective: To establish a chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA) for testosterone. Methods: Antibody was coated and antigen was labeled or antigen was coated and antibody was labeled. Horseradish peroxidase was used as a label and enhanced

4、chemiluminescent system as substrate. Results: The method with coated second antibody and labeled testosterone had high sensitivity and simple measures. The sensitivity of the assay was 0.063 ng/ml. The testosterone was added to the steroid-free serum at concentrations of 1.0, 5.0 and 10.0 ng/ml, th

5、e within-run coefficients of variation were 5.8%7.4%(n=20), and run-to-runs' were 6.6%8.7%(n=2)respectively. The recovery rates were from 98.2% to 104.0%. The assay was not cross-reacted significantly with other steroids except 5-dihydrotestosterone with 20% cross reactivity. It correlated well

6、with Boehringer Mannheim enzyme immunoassay kit (BM) for testosterone. CLEIA=0.915 BM+0.598 ng/ml, n=128, r=0.971. Conclusion: The chemiluminescent enzyme immunoassay has high sensitivity, good accuracy, repeatability and correlation with commercial kit. The method is helpful to clinical laboratory

7、diagnosis. Key wordsChemiluminescent enzyme immunoassayTestosteroneLuminol 血清中睪酮的測定有著十分重要的意義，在男性可以用于研究性機能減退。在女性，血清睪酮的異常增高常提示腫瘤的可能性。另外，血清睪酮濃度的監(jiān)測還有助于了解男性青春期發(fā)育的情況。近年來國內外建立了多種非放射免疫分析法檢測睪酮1，但使用魯米諾增敏化學發(fā)光體系的方法尚未見報道。本文研究了三種不同的方法，建立了直接的化學發(fā)光酶免疫分析法檢測血清睪酮。 1材料與方法 1.1試劑睪酮、睪酮-C3-羧甲基肟、丹那唑、辣根過氧化物酶(HRP)、山羊抗鼠抗體(GAM)、

8、辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠體(GAM-HRP)均購自Sigma公司。抗睪酮單克隆抗體購自美國Indyhill公司。ProClin 300購自美國Supelco公司。 1.2增敏化學發(fā)光液的配制參見文獻2。 1.3去類固醇血清的制備將10 g活性碳加到100 ml正常人血清中，室溫16 h間斷震蕩，懸液454 000×g離心2 h，用放射免疫分析法檢測，不能測出睪酮。 1.4標準品的配制用無水乙醇將睪酮配制成一定濃度，然后加入去類固醇激素血清中，稀釋成終濃度分別為0.0、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 ng/ml，作為標準品。 1.5緩沖液的配制包被緩沖液：

9、0.05 mol/LpH 9.6 碳酸緩沖液。封閉液：在0.01 mol/L pH 7.4 PBS中加入1%脫脂奶粉。洗滌液：在0.01 mol/L pH 7.4 PBS中加入0.05%吐溫-20。分析緩沖液：在0.01 mol/L pH 7.0 PBS中加入牛血清白蛋白10 mg/ml，丹那唑1 mg/L。各溶液中加入ProClin 300(12 000)防腐。 1.6睪酮的酶聯(lián)標記3根據(jù)文獻加以改進。睪酮-C3-羧甲基肟2.6 mg溶于450 l蒸餾的二氧六環(huán)中，后者含有50 l三正丁胺溶液(用二氧六環(huán) 3100 稀釋)，然后加入50 l氯甲酸異丁酯溶液(用二氧六環(huán)3200稀釋)，混合物1

10、0攪拌30 min，然后加入到HRP溶液中(2 mg/3.5 ml，10%二氧六環(huán)稀釋，用NaOH將pH調到9.0，溫度4)，攪拌5 min，pH調至8.5，4置4 h，透析48 h直到無游離的睪酮-C3-羧甲基肟，加ProClin 300(12 000)。 1.7睪酮-BSA的制備同1.6，用紫外分光光度計和放免法計算睪酮與牛血清白蛋白分子數(shù)之比為101。 1.8睪酮檢測方法方法1：將睪酮抗體用包被緩沖液稀釋，加到96孔板中，每孔100 l，4過夜，次日用封閉緩沖液每孔200 l，封閉30 min，洗滌3次，加入標準血清20 l，睪酮-HRP 100 l(110 000)，室溫孵育60 mi

11、n后，洗滌3次，每孔加入200 l發(fā)光液，520 min檢測，檢測時間為1 s，檢測儀器為EG&G Berthold 96P(德國)。方法2：將羊抗鼠抗體用包被緩沖液稀釋成5 g/ml，加到乳白色96孔板中，每孔100 l，4過夜，次日用每孔200 l封閉液封閉30 min，洗滌3次，加入標準血清20 l、稀釋的抗睪酮單克隆抗體50 l及睪酮-HRP 50 l(110 000)，孵育、洗滌、檢測同方法1。方法3：將睪酮-BSA溶于包被緩沖液中，濃度為10 g/ml，加到乳白色96孔板中，每孔100 l，4過夜，次日用每孔200 l封閉液封閉30 min，加入20 l標準血清及100 l

12、用分析緩沖液稀釋的抗睪酮單克隆抗體，室溫孵育60 min，洗滌3次，加入HRP標記的山羊抗鼠抗體，室溫孵育30 min，洗滌3次，加發(fā)光液，檢測同方法1。 2結果 2.13種方法的比較以BB0為90%作為檢測靈敏度，方法1、方法2和方法3的檢測靈敏度分別為0.196、0.063和0.078 ng/ml。 2.2重復性和準確性采用方法2，當空白血清中加入1.0、5.0、10.0 ng/ml睪酮檢測，批內變異系數(shù)分別為7.4%、6.1%和5.8%(n=20)，批間變異系數(shù)分別為8.7%、6.6%和6.9%(n=20)，回收率為98.2%104.0%。     

13、; 2.3特異性此法與5-二氫睪酮交叉反應為20.0%，與雄烯二醇和雄烯二酮的交叉反應為0.7%。 2.4與其它方法的比較用寶靈曼直接酶免疫試劑盒檢測同一批標本，與此法相比，二者所得數(shù)值有顯著相關性，見圖1，CLEIA=0.915 BM+0.598 ng/ml，n=128,r=0.971,P0.001。 圖1化學發(fā)光酶免疫分析法與寶靈曼公司酶免疫分析試劑盒的比較 Fig.1Comparison of the chemiluminescent enzyme immunoassay with Boehringer Mannheim enzyme immunoassay kit 3討論 在競爭法檢測

14、抗原時，待檢抗原和標記抗原競爭結合限量抗體，抗體的量越少，檢測方法的靈敏度越高4-7。我們通過比較三種不同形式的競爭性免疫分析法，建立了靈敏度較高的化學發(fā)光酶免疫方法。方法2較方法1靈敏度高，這可能是由于在方法1中，結合到固相載體上的抗體量不易控制，包被濃度高，會降低靈敏度，包被濃度低，可能導致包被失敗。而方法2中，加入反應體系中的抗睪酮抗體的量直接反映參與反應量，可通過減少其濃度提高靈敏度。方法3與方法2比較，靈敏度接近，但在方法3中，影響靈敏度的因素較多，包括包被抗原的量、抗原中半抗原與載體分子數(shù)之比以及抗體的濃度和純度等，條件較方法2復雜，因此我們選用方法2。 此法具有很好的特異性，除了

15、與5-二氫睪酮有20.0%的交叉反應外，與其它類固醇交叉反應較小。由于5-二氫睪酮的含量僅為睪酮的十分之一，所以不會對睪酮的檢測產生較大影響。 在睪酮的檢測中，以辣根過氧化物酶作為標記酶，魯米諾增敏化學發(fā)光體系作為底物，這種增敏化學發(fā)光免疫分析法與放免法比較有許多優(yōu)點，除了避免使用放射性物質外，標記物較穩(wěn)定，檢測速度快。與普通酶免疫分析法相比，檢測線性范圍寬，更適用于定量測定。由于使用增敏化學發(fā)光液作為反應底物，可達到與放免相當?shù)撵`敏度。將固相載體選為可拆性96孔板，使操作簡便，試劑用量減少，一次可以處理大量標本。 總之，此法有較高的靈敏度和特異性，有較好的準確性和重復性，與已建立的方法有很好

16、的相關性，適于臨床應用。 作者簡介：劉明澤，34歲，醫(yī)學碩士，主治醫(yī)師，主要從事臨床免疫檢驗學研究 作者單位：北京醫(yī)科大學人民醫(yī)院引航醫(yī)學生物技術研究所，北京100034 4參考文獻 1Rassaie M J, Kumari L G, Pandey P K et al. A highly specific heterologous enzyme linked immunosorbent assay for measuring testosterone in plasma using antibodycoated immunoassay plates or polyproplyene tube.

17、 Steroids, 1992;57:288 2劉明澤，王子健，王虹et al. 化學發(fā)光免疫分析法測定血清甲狀腺素.中國免疫學雜志，1996；12(3)：178 3Kominami G, Fujisaka I, Yamauchi A et al. A sensitive enzyme immunoassay for plasma cortisol. Clin Chim Acta, 1980;381:391 4Rajkowski K M, Hanquez C H, Bouzoumou A et al. A competitive microtitre plate enzyme immunoas

18、say for plasma testosterone using polyclonal anti-testosterone immunoglobulins. Clin Chim Acta, 1989;183:197 5Ali E, Sengupta J, Dhar T K. Sandwich immunoassay of small molecules (I): investigation with testosterone as model hapten. J Immunol Methods, 1992;147:173 6Masters A M, Hahnel R. Investigation of sex-hormone binding globulin