邊做邊學(xué)目的DNA片段的體外擴(kuò)增

1、課題2 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1、 情景建構(gòu)DNA指紋法在案件偵破中有重要作用，刑偵人員通過案發(fā)現(xiàn)場(chǎng)的血液、頭發(fā)等樣品中提取的DNA，與犯罪嫌疑人的DNA進(jìn)行比較，就由可能為案件的偵破提供證據(jù)。犯罪嫌疑人留在現(xiàn)場(chǎng)的樣品一般都是極少量的，刑偵人員要怎樣才能得到足夠量的DNA呢？2、 基礎(chǔ)知識(shí)引導(dǎo)（一）細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制條件分析條件組分作用模板DNA的兩條單鏈提供復(fù)制的模板原料四種脫氧核苷酸合成DNA子鏈的原料酶解旋酶DNA聚合酶打開DNA雙螺旋催化合成DNA子鏈能量ATP為解螺旋和合成子鏈供能引物RNA為DNA聚合酶提供合成的3端起點(diǎn)（二）細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制過程1、DNA的反向平行結(jié)構(gòu)：（1）

2、核苷酸分子的結(jié)構(gòu)與方向性：（2）DNA分子的平面結(jié)構(gòu)：2、DNA聚合酶的特性：DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，而只能從3端延伸DNA鏈。因此，DNA復(fù)制需要引物。3、DNA合成的方向：53合成（三）PCR的原理1、DNA 分子的熱變性原理：2、體外DNA復(fù)制的條件（PCR 反應(yīng)的條件）DNA模板；四種脫氧核苷酸；兩種引物：分別與兩條模板鏈相結(jié)合；耐高溫的聚合酶（不需解旋酶）；緩沖液：模擬核基質(zhì)，維持pH基本不變；溫控設(shè)備：嚴(yán)格控制溫度（PCR儀）。3、PCR的反應(yīng)過程（1）三個(gè)基本步驟變性、復(fù)性和延伸。（2）反應(yīng)循環(huán)數(shù)：2530。（3）擴(kuò)增倍數(shù)：106109。第一輪反應(yīng)：4、循環(huán)特點(diǎn)上一次

3、循環(huán)的產(chǎn)物為下一循環(huán)的模板；子代DNA中只有2個(gè)DNA含有最初母鏈的一條；其它子代DNA分子都為雙引物形式；處于兩引物之間的DNA序列呈指數(shù)增長(zhǎng)1×2N。二、實(shí)驗(yàn)操作1、PCR反應(yīng)體系：緩沖液、DNA模板，四種脫氧核苷酸原料、熱穩(wěn)定DNA聚合酶、兩種RNA引物，水。2、操作步驟（準(zhǔn)備）按配方將所需試劑擺放在實(shí)驗(yàn)桌上；（移液）用微量移液器按配方在微量離心管中依次加入各組分；（混合）蓋嚴(yán)離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁；（離心）將微量離心管放在離心機(jī)上；（反應(yīng)）將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。三、操作提示1、避免外源DNA污染：所用儀器、緩沖液、蒸餾水等使用前高壓滅菌

4、。2、緩沖液和酶分裝成小份，20低溫保存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。3、在微量離心管中添加反應(yīng)成分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。所有的成分都加入后，蓋嚴(yán)離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管的側(cè)壁，使反應(yīng)液混合均勻，再將微量離心管放在離心機(jī)上，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管底部，再放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。目的：避免外源性DNA大量擴(kuò)增造成假陽(yáng)性反應(yīng)。四、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)1、DNA含量的測(cè)定原理：DNA在260nm的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰。可以利用DNA的這一特點(diǎn)進(jìn)行DNA含量的測(cè)定。2、具體方法將樣品進(jìn)行50倍稀釋：取2LPCR反應(yīng)液，加入98L蒸餾水

5、。以蒸餾水作為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)260nm處，將紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零。加入步驟1中的DNA稀釋液100L至比色杯中，測(cè)定260nm處的光吸收值。根據(jù)下面的公式計(jì)算DNA含量：DNA含量（g/ml）=50 ×（260nm的讀數(shù)）×稀釋倍數(shù)課堂小結(jié)：三、課堂演練一選擇題（10個(gè)）1DNA分子復(fù)制時(shí)，解旋的兩條鏈中（ ）A僅一條作為復(fù)制模板 B兩條鏈作為模板并復(fù)制出兩個(gè)不同的DNA分子C兩條鏈作為模板并復(fù)制出兩個(gè)相同的DNA分子D兩條鏈作為模板，各自合成一條子鏈，然后兩條母鏈重新結(jié)合為原來的雙螺旋分子，兩條新鏈結(jié)合成一個(gè)全新的DNA分子2.下列關(guān)于DNA復(fù)制過程的正確順序是

6、（ ）互補(bǔ)堿基對(duì)之間氫鍵斷裂互補(bǔ)堿基對(duì)之間形成氫鍵DNA分子在解旋酶的作用下解旋以解旋后的母鏈為模板進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)子鏈與母鏈盤旋成雙螺旋狀結(jié)構(gòu)A B C D3.下列各項(xiàng)過程中，遵循“堿基互補(bǔ)配對(duì)原則”的有（ ）DNA復(fù)制RNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄A B C D4.實(shí)驗(yàn)室內(nèi)模擬生物體DNA的復(fù)制必需的一組條件是（ ）酶游離的脫氧核苷酸ATPDNA分子mRNAtRNA適宜的溫度適宜的酸堿度A B C D5.利用PCR技術(shù)，把一個(gè)雙鏈DNA分子當(dāng)作第一代，經(jīng)過3次循環(huán)，在第四代DNA分子中，有幾條第一代脫氧核苷酸的長(zhǎng)鏈？（ ）A 2 B 4 C 8 D 16，6.關(guān)于DNA分子的敘述中，正確的是（

7、）A .DNA的兩條鏈?zhǔn)菢O性相同，同向平行 B.DNA的兩條鏈?zhǔn)菢O性相同，反向平行C.DNA的兩條鏈中極性不同，反向平行的 D.DNA的兩條鏈?zhǔn)菢O性不同，同向平行7.假設(shè)PCR反應(yīng)中，只有一個(gè)DNA的片段作為模板，請(qǐng)計(jì)算在30次循環(huán)后，反應(yīng)物中大約有多少這樣的DNA片段（ ）A 215 B 230 C 260 D 2318.DNA的合成方向總是（ ）延伸。A從DNA分子的左端向右端 B從DNA分子的右端向左端C從子鏈的5，端向3，端 D從子鏈的3，端向5，端9.要使PCR反應(yīng)在體外的條件下順利地進(jìn)行，需要嚴(yán)格的控制（ ）A 氧氣的濃度 B酸堿度 C溫度 D 大氣的濕度10.DNA分子經(jīng)PCR反

8、應(yīng)循環(huán)一次后，新合成的那條子鏈的脫氧核苷酸的序列應(yīng)與（ ）A模板母鏈相同 B非模板母鏈相同 C兩條模板母鏈相同 D兩條模板母鏈都不相同二非選擇題（2個(gè)）1PCR技術(shù)是把某一DNA片段在實(shí)驗(yàn)條件下，合成許許多多相同片段的一種方法，利用這種技術(shù)能快速而特異的擴(kuò)增任何要求的目的基因或者DNA分子片段，“人類基因組計(jì)劃”的研究中常用到這種技術(shù)。請(qǐng)結(jié)合有關(guān)知識(shí)，回答有關(guān)此技術(shù)的一些問題：PCR技術(shù)能把某一DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，依據(jù)的原理是： 在實(shí)驗(yàn)條件下，DNA分子進(jìn)行擴(kuò)增，除了所要擴(kuò)增的DNA片段處，還需要 、和 、 等條件。某DNA片段有160個(gè)堿基，其中有腺嘌呤35個(gè)，若讓該DNA分子擴(kuò)增三次（即復(fù)制三次）至少需要腺嘌呤脫氧核苷酸和鳥嘌呤脫氧核苷酸的數(shù)目分別是 和 個(gè)。2將大腸桿菌置于含15N的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。這樣，后代大腸桿菌細(xì)胞中的DNA雙鏈均被15N標(biāo)記。然后將被15N標(biāo)記的大腸桿菌作為親代轉(zhuǎn)到普通培養(yǎng)基中，繁殖兩代。親代、第一代、第二代大腸桿菌DNA的狀況如圖所示。第一代大腸桿菌DNA貯存的遺傳信息與親代大腸桿