質(zhì)粒載體介紹(質(zhì)?；咎匦院头N類及標(biāo)記基因)

1、質(zhì)粒載體介紹（質(zhì)?；咎匦院头N類及標(biāo)記基因）2010-01-25 13:25:29來源：易生物實(shí)驗(yàn) 瀏覽次數(shù)：6084網(wǎng)友評論0條一、質(zhì)粒的基本特性二、標(biāo)記基因三、質(zhì)粒載體的種類關(guān)鍵詞：質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體標(biāo)記基因一、質(zhì)粒的基本特性1 質(zhì)粒的復(fù)制通常一個(gè)質(zhì)粒含有一個(gè)與相應(yīng)的順式作用控制要素結(jié)合在一起的復(fù)制起始區(qū)（整個(gè)遺傳單位定義為復(fù)制子）。在不同的質(zhì)粒中，復(fù)制起始區(qū)的組成方式是不 同的，有的可決定復(fù)制的方式，如滾環(huán)復(fù)制和9復(fù)制。在大腸桿菌中使用的大多數(shù)載體都帶有一個(gè)來源于pMB1質(zhì)?；駽olE1質(zhì)粒的復(fù)制起始位點(diǎn)。圖 3-1是其復(fù)制其始示意圖。在復(fù)制時(shí)，首先合成前RNA II，即前引物，并與DNA

2、形成雜交體；而后 RNase H切割前RNA I，使之成為成熟的RNA I，并形成三葉草二級結(jié)構(gòu)， 該引物引導(dǎo)質(zhì)粒的復(fù)制。形成的 RNA I可控制RNA I形成二級結(jié)構(gòu)，同時(shí) Rop增強(qiáng)RNA I的作用，從而控制質(zhì)粒的拷貝數(shù)。削弱 RNA I和RNA I 之間相互作用的突變，將增加帶有 pMB1或（ColE1 ）復(fù)制子的拷貝數(shù)。nriRNAI圖3-1帶pMB1 （或ColE1 ） 復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒在復(fù)制起始階段所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄的方向及其粗略大小。2質(zhì)粒的拷貝數(shù)質(zhì)?？截悢?shù)分為嚴(yán)謹(jǐn)型與松馳型。嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒每個(gè)細(xì)胞中拷貝數(shù)有限，大約1幾個(gè)；松馳型質(zhì)粒拷貝數(shù)較多，可達(dá)幾百。表5-1就是不同類的質(zhì)粒與復(fù)制子及拷

3、貝數(shù)的大致關(guān)系表3-1:質(zhì)粒載體及其拷貝數(shù)質(zhì)粒復(fù)制子拷貝數(shù)PBR322及其衍生質(zhì)粒pMB11520pUC系列質(zhì)粒及其衍生質(zhì)粒突變的pMB1500700pACYC及其衍生質(zhì)粒p15A10 212pSC101及其衍生質(zhì)粒pSC1015ColE1ColE11520pUC系列質(zhì)粒的復(fù)制單位來自質(zhì)粒 pMB1 ，但其拷貝數(shù)較高。pMB1質(zhì)粒 的復(fù)制并不需要質(zhì)粒編碼的功能蛋白，而是完全依靠宿主提供的半衰期較長的酶（DNA聚合酶I , DNA聚合酶 川），依賴于DNA 的RNA 聚合酶，以及 宿主基因dnaB、dnaC 、dnaD和danZ的產(chǎn)物。因此，存在抑制蛋白質(zhì) 合成并阻斷細(xì)菌染色體復(fù)制的氯霉素或壯觀

4、霉素等 抗生素時(shí)，帶有pMB1 （或 ColEI ）復(fù)制子的質(zhì)粒將繼續(xù)復(fù)制，最后每個(gè)細(xì)胞中可積聚23千個(gè)質(zhì)粒。3 質(zhì)粒的不相容性兩個(gè)質(zhì)粒在同一宿主中不能共存的現(xiàn)象稱質(zhì)粒的不相容性，它是指在第二個(gè) 質(zhì)粒導(dǎo)入后，在不涉及DNA限制系統(tǒng)時(shí)出現(xiàn)的現(xiàn)象。不相容的質(zhì)粒一般都利 用同一復(fù)制系統(tǒng)，從而導(dǎo)致不能共存于同一宿主中。兩個(gè)不相容性質(zhì)粒在同一個(gè) 細(xì)胞中復(fù)制時(shí)，在分配到子細(xì)胞的過程中會競爭， 隨機(jī)挑選，微小的差異最終被 放大，從而導(dǎo)致在子細(xì)胞中只含有其中一種質(zhì)粒。而不相容群指那些具有不相容性的質(zhì)粒組成的一個(gè)群體，一般具有相同的復(fù)制子。在大腸桿菌中現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)30多個(gè)不相容群，如 ColE1 和pMB1 ，pS

5、C101 和p15A。4 .轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒具轉(zhuǎn)移性。它是指在自然條件下，很多質(zhì)?？梢酝ㄟ^稱為細(xì)菌接合的作 用轉(zhuǎn)移到新宿主內(nèi)。它需要移動基因 mob ，轉(zhuǎn)移基因tra ，順式因子bom及 其內(nèi)部的轉(zhuǎn)移缺口位點(diǎn)nic。二、標(biāo)記基因按其用途可將標(biāo)記基因分為選擇標(biāo)記基因和篩選標(biāo)記基因。選擇標(biāo)記用于鑒 別目標(biāo) DNA （載體）的存在，將成功轉(zhuǎn)化了載體的宿主挑選出來，篩選標(biāo)記 可用于將特殊表型的重組子挑選出來。（一） 選擇標(biāo)記抗生素 抗性基因是目前使用最廣泛的選擇標(biāo)記。1氨芐青霉素抗性基因（ Ampicillin resistance gene, ampr） 氨芐青霉素抗性基因是基因操作中使用最廣泛的選擇標(biāo)記

6、，絕大多數(shù)在大腸 桿菌中克隆的質(zhì)粒載體帶有該基因。 青霉素可抑制細(xì)胞壁肽聚糖的合成， 與有關(guān) 的酶結(jié)合并抑制其活性， 抑制轉(zhuǎn)肽反應(yīng)。 氨芐青霉素抗性基因編碼一個(gè)酶， 該酶 可分泌進(jìn)入細(xì)菌的周質(zhì)區(qū)，抑制轉(zhuǎn)肽反應(yīng)并催化禺內(nèi)酰胺環(huán)水解，從而解除了氨芐青霉素的毒性。 青霉素是一類化合物的總稱， 其分子結(jié)構(gòu)由側(cè)鏈 R-CO- 和 主核6-氨基青霉烷酸（6-APA）兩部分組成。在6-APA 中有一個(gè)飽和的噻唑 環(huán)（A）和一個(gè) 伕內(nèi)酰胺環(huán)，6-APA為由L-半脫氨酸和纈氨酸縮合成的二肽。 2四環(huán)素抗性基因（ Tetracycline resistance gene, tetr）四環(huán)素可與核糖體 30S 亞基

7、的一種蛋白質(zhì)結(jié)合， 從而抑制核糖體的轉(zhuǎn)位。 四 環(huán)素抗性基因編碼一個(gè)由 399 個(gè)氨基酸組成的膜結(jié)合蛋白，可阻止四環(huán)素進(jìn)入 細(xì)胞。 pBR322 質(zhì)粒除了帶有氨芐青霉素抗性基因外， 還帶有四環(huán)素抗性基因。 3氯霉素抗性基因（ chloramphenicol resistance gene, Cmr, cat）氯霉素可與核糖體 50S 亞基結(jié)合并抑制蛋白質(zhì)合成。 目前使用的氯霉素抗性 基因來源于轉(zhuǎn)導(dǎo)性 P1 噬菌體（也攜帶 Tn9 ）。 cat 基因編碼氯霉素乙酰 轉(zhuǎn)移 酶，一個(gè)四聚體 細(xì)胞質(zhì)蛋白（每個(gè)亞基 23kDa ）。在乙酰輔酶 A 存在的條件下， 該蛋白催化氯霉素形成氯霉素羥乙酰氧基衍生

8、物，使之不能與核糖體結(jié)合。 4卡那霉素和新霉素抗性基因（ kanamycin/neomycin resistance gene, kanr, neor）卡那霉素和新霉素是一種脫氧鏈霉胺氮基糖苷，都可與核糖體結(jié)合并抑制蛋 白質(zhì)合成?？敲顾睾托旅顾乜剐曰?qū)嶋H就是一種編碼氨基糖苷磷酸 轉(zhuǎn)移酶 （APH （3'） -H , 25kDa ）的基因，氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶可使這兩種抗生素磷酸 化，從而干擾了它們向細(xì)胞內(nèi)的主動轉(zhuǎn)移。 在細(xì)胞中合成的這種酶可以分泌至外 周質(zhì)腔，保護(hù)宿主不受這些抗生素的影響。5琥珀突變抑制基因 supF在基因的編碼區(qū)中，若某個(gè)密碼子發(fā)生突變后變成終止密碼子，則稱這樣的

9、突變?yōu)轸魇蛔?（突變?yōu)?UAA ），或琥珀突變 （突變?yōu)?UAG ），或乳白突變（突 變?yōu)?UGA ）。 supF 基因編碼細(xì)菌的抑制性 tRNA ，可在 UAG 密碼子上編譯 酪氨酸。如果在某一宿主中含具琥珀突變的 tetr 基因和 ampr 基因，只有當(dāng)宿 主含有 supF 基因時(shí)才會對 Amp 和 Tet 具有抗性。相應(yīng)的， supE 基因在 UAG 密碼子上編譯谷氨酰氨。由于目前所用的標(biāo)記基因使用方便，因此用這類 標(biāo)記的載體較少。6其它還有一些正向選擇標(biāo)記，表達(dá)一種使某些宿主菌致死的基因產(chǎn)物，而含有外 源基因片段插入后，該基因便失活。如蔗糖致死基因 SacB ，來自淀粉水解芽 胞桿菌

10、 （Bacillus amyloliquefaciens ） ，編碼果聚糖蔗糖酶。在含蔗糖的培養(yǎng) 基上 sacB 基因的表達(dá)對大腸桿菌來說是致死的， 因此該基因可用于插入失活篩 選重組子。（二）篩選標(biāo)記篩選標(biāo)記主要用來區(qū)別重組質(zhì)粒與非重組質(zhì)粒，當(dāng)一個(gè)外源 DNA 片段插入 到一個(gè)質(zhì)粒載體上時(shí)， 可通過該標(biāo)記來篩選插入了外源片段的質(zhì)粒， 即重組質(zhì)粒。1 . a-互補(bǔ)（acomplementation ）a-互補(bǔ)是指lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱 基因區(qū)段的 俟半乳糖苷酶（B-galactosidase ，由1024個(gè)氨基酸組成）陰性 的突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)。a-互補(bǔ)是基

11、于在兩個(gè)不同的缺陷伕半乳糖苷酶之間可實(shí)現(xiàn)功能互補(bǔ)而建立的。大腸桿菌的乳糖lac操縱子中的lacZ基因編碼 伕半乳糖苷酶，如果lacZ基因發(fā)生突變，則不能合成有活性的 B半乳糖苷酶。例如， lacZ M15基因是缺失了編碼B半乳糖苷酶中第11-41個(gè)氨基酸的lacZ基因，無酶學(xué)活性。 對于只編碼 N- 端 140 個(gè)氨基酸的 lacZ 基因 （稱為 lacZ'） ， 其產(chǎn)物也沒有酶學(xué)活性。但這兩個(gè)無酶學(xué)活性的產(chǎn)物混合在一起時(shí)，可恢復(fù)B-半乳糖苷酶的活性，實(shí)現(xiàn)基因內(nèi)互補(bǔ)。在 lacZ' 編碼區(qū)上游插入一小段 DNA 片段（如 51 個(gè)堿基對的多克隆位 點(diǎn)），不影響 俟半乳糖苷酶的功

12、能內(nèi)互補(bǔ)。但是，若在該 DNA小片段中再插入一個(gè)片段，將幾乎不可避免地導(dǎo)致產(chǎn)生無a互補(bǔ)能力的 禺半乳糖苷酶片段。利用這一互補(bǔ)性質(zhì)，可用于篩選在載體上插入了外源片段的重組質(zhì)粒。在相應(yīng)的載體系統(tǒng)中，lacZ M15放在F質(zhì)粒上,隨宿主傳代；lacZ'放在載體上，作為 篩選標(biāo)記 （圖3-2）。相應(yīng)的受體菌有JM系列、TG1和XL1-Blue ，前 二者均帶有 D （lac - proAB）F' proAB + lacIq lacZD M15基因型。其中 lacI 為lac阻抑物的編碼基因，laclq突變使阻抑物產(chǎn)量增加，防止lacZ基因滲漏 表達(dá)。lacZ基因是乳糖lac操縱子中編碼

13、 &半乳糖苷酶的基因，乳糖及其衍生物可 誘導(dǎo)其表達(dá)。乳糖既是lac操縱子的誘導(dǎo)物，也是作用的底物。異丙基-伕D-硫 代半乳糖苷（IPTG ）是乳糖的衍生物，可作為lac操縱子的誘導(dǎo)物，但不能作 為反應(yīng)的底物；5-溴-4-氯-3-吲哚-俟D-半乳糖苷（X-gal）可作為lac操縱子的底物，但不能作為誘導(dǎo)物。底物X-gal還可充作生色劑，被伕半乳糖苷酶分解后可產(chǎn)生蘭色產(chǎn)物，可使菌落或噬菌斑呈蘭色LacZ-團(tuán)二13和如玄多肚泊結(jié)構(gòu)關(guān)系莊刑通過伍互補(bǔ)產(chǎn)生的苗蒂莎色變化（右）2 插入失活通過插入失活進(jìn)行篩選的質(zhì)粒主要有 pBR322 ，該質(zhì)粒具有四環(huán)素抗性基因（tetr）和氨芐青霉素抗性基因（a

14、mpr）兩種抗性標(biāo)記。當(dāng)外源DNA片段插入 tetr基因后，導(dǎo)致tetr基因失活，變成只對氨芐青霉素有抗性。這樣就可通過 對抗生素是雙抗還是單抗來篩選是否有外源片段插入到載體中。三、質(zhì)粒載體的種類（一）克隆載體克隆載體主要用于擴(kuò)增或保存 DNA片段，是最簡單的載體。1. pBR322圖 M 3m pER322 JSfeBlSpBR322 質(zhì)粒的大小為4361bp, GenBank 注冊號為 V01119 和J01749,含有30多個(gè)單一位點(diǎn)，具有四環(huán)素抗性基因(tetr )和氨芐青霉素抗性基因(ampr)，其質(zhì)粒復(fù)制區(qū)來自pMB1 (如圖3-3 )。目前使用廣泛的多質(zhì)粒載體 幾乎都是由此發(fā)展而

15、來的。利用四環(huán)素抗性基因內(nèi)部的BamH I位點(diǎn)來插入外 源DNA片段，可通過插入失活進(jìn)行篩選。2. pUC18 和 pUC19pUC18和pUC19大小只有2686bp ，是最常用的質(zhì)粒載體，其結(jié)構(gòu)組成 緊湊，幾乎不含多余的 DNA片段，GenBank注冊號為L08752 ( pUC18 )和 X02514 ( pUC19 )。由 pBR322 改造 而來，其中 lacZ ( MSC ) 來自 M13mp18/19 圖3-4 是其質(zhì)粒圖譜。這兩個(gè)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)幾乎是完全一樣的，只是多克隆位點(diǎn)的排列方向相反。這些質(zhì)粒缺乏控制拷貝數(shù)的rop基因，因此其拷貝數(shù)達(dá)500-700。 pUC系列載體含有一段l

16、acZ蛋白氨基末端的部分編碼序列，在特定的受體細(xì)胞中可表現(xiàn)a-互補(bǔ)作用。因此在多克隆位點(diǎn)中插入了外源片段后，可通過a-互補(bǔ)作用形成的藍(lán)色和白色菌落篩選重組質(zhì)粒。puciaGA.ATTGGAGCTCGGTACCCGGGATGCTCTAGAGTCGAGCTGCA£iGCATGCTTGGCF>UCigGCCAAGCTTGCATQCCrGCAGGTCQACTCTAGAQQATCCCCGGGTACCQAGCTCGAATTCHirld IIIJ11 J11Xhl 1ElainH |Kpn IXmalEcoOlDBI (2&74Him II4480Vs«pi (25O1JS

17、m J (217?)*SDt hg< unitwPUC18/192&MbpktU II (1O5O：.uAtaN 1(1217)CttlOl (1779)圖3-4 : pUC18/19 質(zhì)粒圖譜3. pUC118 和 pUC 119由pUC18/19 增加了一些功能片段改造而來，大小為 3162bp, GenBank注冊號為 U07649 (pUC118 )和 U07650 (pUC119 )。相當(dāng)于在 pUC18/19 中 增加了帶有M13噬菌體DNA合成的起始與終止以及包裝進(jìn)入噬菌體顆粒所必需的順式序列4. pGEM-3Z/4ZPGEM-3Z/4Z由pUC18/19 增加了一

18、些功能片段改造而來，大小為 2.74kb, Gen Ba nk 注冊號為 X65304 ( pGEM-3 Z, 2743bp )和 X65305 ( pGEM-4 Z, 2746)。與pUC18/19 相比，在多克隆位點(diǎn)的兩端添加了噬菌體的轉(zhuǎn)錄啟動子， 如Sp6和T7噬菌體的啟動子。pGEM-3Z 和pGEM-4Z 的差別在于二者互換了兩個(gè)啟動子的位置5.多功能質(zhì)粒載體在上述載體的基礎(chǔ)上，人們設(shè)計(jì)出一些多功能的質(zhì)粒載體，這類質(zhì)粒載體綜合了以上質(zhì)粒的特點(diǎn)。除了作為質(zhì)粒載體基本要素外，綜合了上述功能要素，如多克隆位點(diǎn)、a互補(bǔ)、噬菌體啟動子和單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制與包裝信號。典型的這類質(zhì)粒有pBluescript n KS ( ± ,這類質(zhì)粒一般由4個(gè)質(zhì)粒組成一套系統(tǒng)， 其差別在于多克隆位點(diǎn)方向相反(根據(jù)多克隆位點(diǎn)兩端Kpn I和Sac I的順序，用KS或SK表示)，或單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制啟始方向相反(或者說，引導(dǎo)DNA