基因工程：第七章(共5頁(yè))

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上第七章 克隆基因的表達(dá)7.1 基因表達(dá)的含義生物的遺傳信息是以基因的形式儲(chǔ)存在DNA分子上的，將DNA分子所承載的遺傳信息轉(zhuǎn)變?yōu)橛商囟ò被犴樞驑?gòu)成的多肽或蛋白質(zhì)分子的過(guò)程，即為基因的表達(dá)（gene expression）?；虮磉_(dá)的過(guò)程為：利用各種先進(jìn)的基因?qū)爰夹g(shù)及細(xì)胞培養(yǎng)方法已實(shí)現(xiàn)了外源基因在動(dòng)植物及酵母等真核宿主細(xì)胞中的表達(dá)。利用真核細(xì)胞作宿主表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是：能識(shí)別和除去外源基因中的內(nèi)含子，加工形成成熟的mRNA，即帶內(nèi)含子的天然基因是可以利用的；真核細(xì)胞將表達(dá)的蛋白糖基化，而大腸桿菌表達(dá)的蛋白是無(wú)糖基化的，糖基化對(duì)某些表達(dá)蛋白的免疫原性影響很大。真核細(xì)胞作

2、宿主表達(dá)系統(tǒng)尚存在以下幾個(gè)問(wèn)題：轉(zhuǎn)化真核細(xì)胞的效率低；表達(dá)效率不夠高；細(xì)胞培養(yǎng)（動(dòng)植物）工藝較復(fù)雜，成本高；選擇標(biāo)記及選擇系統(tǒng)較少?？傮w而言，真核細(xì)胞作為表達(dá)宿主尚不成熟，有待于進(jìn)一步發(fā)展、完善。目前普遍采用原核生物作為表達(dá)宿主，原核生物（大腸桿菌）繁殖速度快，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，因此一些用傳統(tǒng)和常規(guī)方法不能或難以大量生產(chǎn)的有生理活性的蛋白，如果采用“工程菌”來(lái)生產(chǎn)就方便得多。7.2 外源基因在大腸桿菌中表達(dá)的基本條件基因的編碼區(qū)域內(nèi)必須無(wú)插入序列（無(wú)內(nèi)含子），因?yàn)樵思?xì)胞中缺乏拼接加工系統(tǒng)；基因必須置于大腸桿菌啟動(dòng)子的控制之下，并能有效地為大腸桿菌RNA聚合酶所識(shí)別和轉(zhuǎn)錄；所生成的mRNA必須穩(wěn)定，且

3、轉(zhuǎn)譯效率高；表達(dá)產(chǎn)物不會(huì)被宿主細(xì)胞的蛋白酶迅速降解。7.3 影響基因表達(dá)的主要因素7.3.1 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄指遺傳信息從DNA分子轉(zhuǎn)移到RNA分子的過(guò)程，是以DNA分子中的一條鏈（有意義鏈、轉(zhuǎn)錄鏈）為模板，在轉(zhuǎn)錄酶的催化下，進(jìn)行的一種聚合反應(yīng)。轉(zhuǎn)錄酶即依賴(lài)于DNA的RNA聚合酶。大腸桿菌的RNA聚合酶由五個(gè)亞基_組成，分子量約46萬(wàn)。完整的RNA聚合酶，即_稱(chēng)為全酶（holoenzyme）；沒(méi)有_亞基的RNA聚合酶稱(chēng)為核心酶（coreenzyme）。_亞基（_因子）容易同核心酶解離，其功能是使核心酶能穩(wěn)定地結(jié)合到DNA的啟動(dòng)子上，故又稱(chēng)為起始因子。真核生物有三種不同的RNA，因而其RNA聚合酶也有三

4、種，分別參與不同類(lèi)型的RNA分子的合成。由RNA聚合酶催化的轉(zhuǎn)錄過(guò)程可分為起始、延長(zhǎng)和終止三個(gè)步驟。7.3.1.1 啟動(dòng)子標(biāo)志基因轉(zhuǎn)錄起始的位點(diǎn)稱(chēng)啟動(dòng)子。在大腸桿菌中，啟動(dòng)子被RNA聚合酶的因子所識(shí)別。啟動(dòng)子是一段DNA序列，常位于基因或操縱子編碼順序的上游，RNA聚合酶結(jié)合在上面。1. 原核細(xì)胞的啟動(dòng)子原核細(xì)胞的啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的上游有兩個(gè)高度保守的區(qū)域：位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游約10個(gè)bp的-10區(qū)域，TATAAT序列（pribnow box），也稱(chēng)-10序列。-10序列的實(shí)際位置在不同啟動(dòng)子中略有變動(dòng)，其不同堿基的出現(xiàn)頻率為：T89A89T50A65A65T100 。-10序列有助于DNA局

5、部雙鏈解開(kāi)，因?yàn)?10序列含有較多的A-T對(duì)，所以雙鏈分開(kāi)所需的能量較低。中心約在-35位置的TTGACA序列，也稱(chēng)為-35序列或識(shí)別區(qū)。各堿基出現(xiàn)的頻率為：T83T83G81A61C69A52 。-35序列提供RNA聚合酶識(shí)別的信號(hào)。這兩個(gè)區(qū)域?qū)τ跊Q定啟動(dòng)子的強(qiáng)度非常重要，事實(shí)上很小的差異對(duì)啟動(dòng)子指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的效率有重大影響。一般啟動(dòng)子序列與保守序列相似程度越高，啟動(dòng)子就越強(qiáng)。強(qiáng)啟動(dòng)子是能維持高頻率轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，通?？刂颇切┘?xì)胞需要其大量轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物的基因轉(zhuǎn)錄；而弱啟動(dòng)子具有相對(duì)較低的轉(zhuǎn)錄效率，指導(dǎo)那些僅需要其少量轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物的基因轉(zhuǎn)錄。利用基因工程技術(shù)，可將由弱啟動(dòng)子所控制的基因放在強(qiáng)啟動(dòng)子的下游，從

6、而獲得高效表達(dá)。兩個(gè)保守區(qū)之間的DNA對(duì)啟動(dòng)子的功能也有影響，各啟動(dòng)子都需要一些最適的間隙，通常認(rèn)為間隙為17 bp的啟動(dòng)子功能較強(qiáng)。2. 真核細(xì)胞啟動(dòng)子中可以找到三個(gè)保守區(qū)：位于-12至-32 bp之間的TATA框，序列為T(mén)ATAATATA，其功能可能為DNA雙鏈開(kāi)始解開(kāi)并決定轉(zhuǎn)錄的起點(diǎn)位置。位于-70至-80 bp區(qū)域的CAAT框，序列為GGTCAATCT，其主要作用可能與RNA聚合酶的結(jié)合有關(guān)。位于更上游約-70至-100 bp處的GC框，序列為GGGCGG，也稱(chēng)為增強(qiáng)子（enhancer），其作用為促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄，對(duì)基因的表達(dá)可產(chǎn)生顯著的增強(qiáng)作用。增強(qiáng)子有時(shí)位于基因3端下游區(qū)或在內(nèi)含子

7、中。CAAT框和GC框均為上游因子（upstream elements），它們對(duì)轉(zhuǎn)錄的起始頻率有較大的影響。真核生物的啟動(dòng)子極為復(fù)雜，不同啟動(dòng)子之間的差異較大。例如5s rRNA基因，啟動(dòng)子在基因下游，且在基因內(nèi)部：又如爪蟾tRNAMet基因，啟動(dòng)子分成兩部分：真核生物與原核生物的基因結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)譯過(guò)程均有明顯差異，大腸桿菌的RNA聚合酶不能識(shí)別動(dòng)物啟動(dòng)子順序，真核細(xì)胞的啟動(dòng)子在原核細(xì)胞中功能很差，所以要得到真核細(xì)胞蛋白的有效表達(dá)，應(yīng)將真核基因放在原核細(xì)胞的強(qiáng)啟動(dòng)子控制之下。3. 常用于表達(dá)載體的啟動(dòng)子：PLac ：乳糖啟動(dòng)子，是控制Lac Z基因轉(zhuǎn)錄的序列。Lac啟動(dòng)子可被IPTG誘導(dǎo)，加入

8、該試劑到培養(yǎng)基后，將使表達(dá)載體中Lac啟動(dòng)子下游插入的基因開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，表達(dá)產(chǎn)物為包含半乳糖苷酶的融合蛋白。Ptrp ：色氨酸啟動(dòng)子，通常是編碼參與色氨酸生物合成過(guò)程中的幾種酶的基因簇上游序列。trp啟動(dòng)子被色氨酸抑制，但易被吲哚丙烯酸誘導(dǎo)，也可用色氨酸饑餓誘導(dǎo)，所合成的蛋白質(zhì)產(chǎn)量高于PLac表達(dá)載體系統(tǒng)。PL ：噬菌體左向啟動(dòng)子，負(fù)責(zé) DNA分子轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子之一。PL是一種可被大腸桿菌RNA聚合酶識(shí)別的強(qiáng)啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子被 cI基因產(chǎn)物所抑制，用 PL構(gòu)建的表達(dá)載體上結(jié)合一個(gè)溫敏型阻遏物基因（ cI857），在較低溫度（低于30）下cI蛋白可抑制PL，在較高溫度（42）時(shí)cI蛋白失活，導(dǎo)致克隆基

9、因的轉(zhuǎn)錄。Ptac ：由Ptrp和PLac雜合而成，啟動(dòng)效果比二者均強(qiáng)，仍可被IPTG誘導(dǎo)。目前市售的Ptac有兩類(lèi)（PtacI和PtacII）。上述啟動(dòng)子都是誘導(dǎo)型強(qiáng)啟動(dòng)子，表達(dá)能力強(qiáng)，但菌生長(zhǎng)不好。7.3.1.2 終止子提供轉(zhuǎn)錄停止信號(hào)的DNA序列稱(chēng)為終止子，它可被RNA聚合酶識(shí)別并停止合成mRNA。通常終止信號(hào)是一小段DNA片段，它的RNA轉(zhuǎn)錄本上堿基對(duì)可自身相互配對(duì)形成柄-環(huán)結(jié)構(gòu)。目前已檢測(cè)了20多種終止序列，其一般特性為：有一個(gè)逆向重復(fù)的堿基序列，可表示為：ABCDEF-XYZ-FEDCBA，其中A和A，B和B等均為互補(bǔ)堿基對(duì)，故可發(fā)生鏈內(nèi)的堿基配對(duì)（轉(zhuǎn)錄時(shí)雙鏈解開(kāi)），在RNA轉(zhuǎn)錄本

10、上形成柄-環(huán)（stem and loop）結(jié)構(gòu)。臨近環(huán)端的假柄區(qū)段（有時(shí)完全在柄內(nèi)）的G+C堿基含量豐富。終止序列有時(shí)存在高A+T區(qū)段（有時(shí)不存在這種區(qū)段），這種結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的RNA，則會(huì)產(chǎn)生出68個(gè)U堿基（U末端序列）。終止子有兩種不同的類(lèi)型，一種只取決于DNA的堿基順序，另一種需要終止蛋白質(zhì)的參與。依賴(lài)于蛋白質(zhì)的終止反應(yīng)，對(duì)一些調(diào)節(jié)機(jī)理而言是十分重要的。協(xié)助RNA聚合酶識(shí)別終止信號(hào)的輔助因子（蛋白質(zhì)）稱(chēng)為終止因子（termination factors）。有些終止子的作用可被特異的因子所阻止，使RNA聚合酶得以越過(guò)終止子繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，這稱(chēng)為通讀（readthrough），這類(lèi)引起抗終止作用的

11、蛋白質(zhì)叫抗終止子因子（antitermination factors）。在克隆基因的末端，存在一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)是十分重要的，這是因?yàn)椋喝舾煞潜匦璧霓D(zhuǎn)錄本的合成，會(huì)使耗細(xì)胞消耗巨大的能量，用于制造大批不必要的蛋白質(zhì)；在轉(zhuǎn)錄本上有可能形成一些不希望其出現(xiàn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而降低轉(zhuǎn)譯效率；有時(shí)會(huì)出現(xiàn)啟動(dòng)子阻塞現(xiàn)象，克隆基因啟動(dòng)子所開(kāi)始的轉(zhuǎn)錄，有時(shí)會(huì)干擾另一個(gè)必要的基因或調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的存在，可使上述這幾種不利的現(xiàn)象得以避免。7.3.2 轉(zhuǎn)譯（翻譯）轉(zhuǎn)譯是指按mRNA信息，由氨基酸合成酶、結(jié)構(gòu)蛋白、激素、抗體等各種功能蛋白的過(guò)程。原核生物的轉(zhuǎn)譯過(guò)程包括多肽鏈合成的起始、延長(zhǎng)和終止三個(gè)步驟。1.

12、轉(zhuǎn)譯起始序列mRNA有效地轉(zhuǎn)譯依賴(lài)于mRNA的穩(wěn)定性及結(jié)合到核糖體上的能力。大腸桿菌mRNA的核糖體結(jié)合位點(diǎn)是轉(zhuǎn)譯的起始密碼子及SD序列，要獲得良好的表達(dá)，關(guān)鍵是起始密碼子以及SD序列必須處在易接觸的部位。細(xì)菌的起始密碼子（initiation codon, initiator）通常是AUG，它轉(zhuǎn)譯為n-甲酰基甲硫氨酸；少數(shù)情況下是GUG，轉(zhuǎn)譯為纈氨酸。真核生物的起始密碼子總是AUG，并轉(zhuǎn)譯為甲硫氨酸（其在DNA中的相應(yīng)順序?yàn)锳TG）。所謂SD序列是由Shine-Dalgarno首先提出，為細(xì)菌核糖體有效結(jié)合和轉(zhuǎn)譯起始所需要的序列。它以不同長(zhǎng)度（39個(gè)bp）組成，包含5-UAAGGAGGU-3

13、的全部或其中的一部分，位于mRNA 5-末端不轉(zhuǎn)譯的前導(dǎo)區(qū)段內(nèi)，其起點(diǎn)距轉(zhuǎn)譯起始密碼子AUG約311個(gè)堿基。這個(gè)SD序列與16s核糖體RNA的3-末端堿基AUUCCUCCACUAG（反SD序列）互補(bǔ)，控制轉(zhuǎn)譯的起始。2. 影響mRNA轉(zhuǎn)譯效果的因素：SD序列與反SD序列的互補(bǔ)程度：互補(bǔ)程度高，則表達(dá)強(qiáng)。SD序列與AUG之間的間隔距離（spacer），使用不同的啟動(dòng)子，表達(dá)不同的基因，其最佳間隔不一樣。20 bp到13 bp這一段序列中不要有二級(jí)結(jié)構(gòu)（發(fā)卡結(jié)構(gòu)）。連接在SD序列后面的4個(gè)堿基的改變，會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)譯效率發(fā)生很大的影響，如果這個(gè)區(qū)域由4個(gè)A組成，其轉(zhuǎn)譯作用最為有效；而當(dāng)其被4個(gè)C或G替代，

14、則轉(zhuǎn)譯效率僅為最高值的2550%。直接位于起始密碼子AUG左側(cè)的堿基三聯(lián)體的組成，對(duì)轉(zhuǎn)譯效率也有重要影響，以半乳糖苷酶mRNA的轉(zhuǎn)譯為例，三聯(lián)體為UAU或CUU時(shí)，轉(zhuǎn)譯最有效，而若為UUC或UCA時(shí)，則轉(zhuǎn)譯水平下降20倍。在起始密碼子AUG后面的核苷酸序列對(duì)核糖體結(jié)合也有一定影響。3. 轉(zhuǎn)譯后的修飾與加工在很多情況下，由mRNA轉(zhuǎn)譯成蛋白質(zhì)，最初合成的肽鏈需經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)譯后的加工和修飾才能成為有活性的功能蛋白。在真核細(xì)胞中，有時(shí)需將前體蛋白降解為功能蛋白，有時(shí)需要發(fā)生某種修飾，如進(jìn)行糖基化變?yōu)樘堑鞍椎?。而?xì)菌細(xì)胞中沒(méi)有這一過(guò)程，這就可能造成克隆基因在細(xì)菌中合成的功能蛋白不具有與原來(lái)完全相同的生物活性

15、?？寺』蚝铣傻牡鞍踪|(zhì)常常遇到新的宿主細(xì)胞中蛋白酶的迅速降解，尤其是短肽。實(shí)驗(yàn)證明，在細(xì)菌中真核基因以融合蛋白表達(dá)比非融合蛋白更為穩(wěn)定。所謂融合蛋白是指它的氨基端是原核細(xì)胞序列，羧基端是真核細(xì)胞序列，這種融合蛋白仍具有真核細(xì)胞的抗原性，可用作抗原。該融合蛋白包括位于氨基端的原核蛋白（通常為半乳糖苷酶或內(nèi)酰氨酶的一部分），能被蛋白酶或溴化氰裂解的特殊序列，以及目的蛋白（多肽）。一般融合蛋白要經(jīng)過(guò)后加工，切除原核細(xì)胞序列，才表現(xiàn)出活性，所以在多肽前設(shè)計(jì)一個(gè)特殊序列，如Met（甲硫氨酸），用溴化氰裂解，打斷Met與其他氨基酸之間的肽鍵，即可將原核序列切除掉。注意，該方法的前提是多肽中無(wú)Met。融合蛋

16、白的有用性質(zhì)：許多融合蛋白在細(xì)菌中較為穩(wěn)定，可保護(hù)基因產(chǎn)物不被降解；有些融合蛋白用化學(xué)方法處理后可以釋放出有生物活性的真核肽，如人體胰島素等；有些融合蛋白可以用作抗原，如制備口蹄疫疫苗等。融合蛋白要比多數(shù)大腸桿菌的菌體蛋白大，因此在蛋白質(zhì)凝膠電泳中易于鑒定?？蓪⑷诤系鞍讞l帶從凝膠中切割下來(lái)，凍干，碾成粉末，即可用作抗原。為了合成融合蛋白，常采取與表達(dá)載體上編碼半乳糖苷酶或內(nèi)酰氨酶的基因相連接的方法，構(gòu)建成雜合基因。pUR278292這些Lac Z融合載體在Lac Z基因的3端有適應(yīng)所有三種讀框的克隆位點(diǎn)：BamH I、Sal I、Pst I、Xba I、Hind III和Cla I。在適當(dāng)?shù)目?/p>

17、隆位點(diǎn)插入DNA片段，即可產(chǎn)生由DNA片段編碼的并有半乳糖苷酶活性的融合蛋白。7.3.3 其他因素1. 質(zhì)粒拷貝數(shù)及穩(wěn)定性對(duì)表達(dá)效率的影響：細(xì)胞中的核糖體數(shù)量，與任何一種mRNA分子數(shù)目相比，都是大大超量的。提高克隆基因表達(dá)效率的途徑之一，是增加相應(yīng)的mRNA分子的數(shù)量。而影響mRNA分子合成速率的因素有兩種：(1) 啟動(dòng)子強(qiáng)度；(2) 基因的拷貝數(shù)。對(duì)于第一種情況，可采用強(qiáng)啟動(dòng)子；對(duì)于第二種情況，可將基因克隆到高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體上。隨著重組體克隆基因表達(dá)水平的上升，寄主細(xì)胞的生長(zhǎng)速率便相應(yīng)地下降，同時(shí)形態(tài)上也會(huì)出現(xiàn)一些明顯的變化，如細(xì)胞纖維化、脆弱性增加等。如果細(xì)菌由于突變而失去了重組質(zhì)粒、或無(wú)法表達(dá)重組質(zhì)粒、或質(zhì)?？截悢?shù)大大降低，那么這樣的突變體菌株便會(huì)有很高的生長(zhǎng)速度，迅速成為培養(yǎng)物種的優(yōu)勢(shì)菌株；而具有重組質(zhì)粒的寄主細(xì)胞，最終會(huì)被“稀釋”掉，使克隆基因無(wú)法得到表達(dá)。由缺陷性分配引起的質(zhì)粒丟失現(xiàn)象，叫做質(zhì)粒分離的不穩(wěn)定性。天然質(zhì)粒具有一段分配功能區(qū)par，能保證質(zhì)粒分子在每次細(xì)胞周期中都能準(zhǔn)確地進(jìn)行分離，并均等地分配到子代細(xì)胞中去。而在pBR322等質(zhì)粒中，這個(gè)par區(qū)已經(jīng)缺失，所以在其寄主細(xì)胞分裂時(shí)，pBR322質(zhì)粒只能作隨機(jī)的分離。盡管pBR322質(zhì)粒仍然是高拷貝數(shù)的，而且產(chǎn)生無(wú)質(zhì)粒細(xì)胞的幾率也極小，