植物細(xì)胞工程復(fù)習(xí)

1、植物細(xì)胞工程復(fù)習(xí)第二章名詞解釋植物細(xì)胞工程： 植物體的細(xì)胞中， 含有該植物所有的遺傳信息。 在合 適的條件下， 一個(gè)細(xì)胞可以獨(dú)立發(fā)育成完整的植物體。 利用細(xì)胞的這 種全能性，生物學(xué)家通過(guò)組培來(lái)繁殖名貴花卉、消滅果樹(shù)上的病毒， 以及通過(guò)對(duì)細(xì)胞核物質(zhì)的重新組合， 進(jìn)行植物遺傳改造等。 這就是人 們常說(shuō)的植物細(xì)胞工程。細(xì)胞全能性 (totipotency )：植物細(xì)胞具有該植物有機(jī)體的全部遺傳 信息，并具有形成植物有機(jī)體所有細(xì)胞類型， 直至發(fā)育成完整植株的能力。脫分化 (dedifferentiation)：在離體培養(yǎng)的條件下，已分化的細(xì)胞，失去原有的形態(tài)和機(jī)能，從而形成沒(méi)有分化的無(wú)組織的細(xì)胞團(tuán)或愈

2、傷組織的過(guò)程。再分化 (redifferentiation)： 由脫分化狀態(tài)的細(xì)胞再度分化形成一種或幾種類型細(xì)胞的過(guò)程。包括細(xì)胞分化、組織分化和器官分化等。再分化通過(guò)胚胎發(fā)生途徑或器官發(fā)生途徑實(shí)現(xiàn)。外植體 (e xpla nt)：指切離植物體后用以離體培養(yǎng)的各種接種材料， 包括胚胎材料、各種器官、組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體等。愈傷組織(Callus ):在人工誘導(dǎo)或自然條件下，植物細(xì)胞脫分化, 不斷增殖產(chǎn)生的主要有薄壁細(xì)胞構(gòu)成的不定形的組織。思考題1、影響脫分化有關(guān)的因子及其作用（1）創(chuàng)傷刺激 （除種子外）離體培養(yǎng)均產(chǎn)生創(chuàng)傷，創(chuàng)傷反應(yīng)與組 織培養(yǎng)時(shí)脫分化和再分化的時(shí)間基本一致， 創(chuàng)傷影響細(xì)胞分裂和分

3、化 作用，創(chuàng)傷是引起細(xì)胞脫分化的第一個(gè)因子。（ 2）生長(zhǎng)物質(zhì)的影響 培養(yǎng)基中添加外源植物生長(zhǎng)物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的脫分 化起著決定性的作用°2,4-D等生長(zhǎng)物質(zhì)，能使細(xì)胞脫分化并 分裂；生長(zhǎng)素細(xì)胞分裂素（3）培養(yǎng)細(xì)胞的異質(zhì)性 異質(zhì)性細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)條件刺激有不同敏感度。 異質(zhì)性細(xì)胞：不同染色體倍數(shù)。 如豌豆 2x、3x 和 4x 細(xì)胞的外植體（根） 培養(yǎng)在含 2， 4D 培養(yǎng)基中，只二倍體細(xì)胞脫分化分裂。培養(yǎng)在 2， 4 D+酵母汁培養(yǎng)基中，2x、3x和4x細(xì)胞均脫分化，一周后4x的 脫分化占優(yōu)勢(shì)。異質(zhì)性細(xì)胞：不同生理狀態(tài)菊苣塊莖儲(chǔ)存時(shí)間脫分化所需時(shí)間5個(gè)月2 0 - 2 4小時(shí)12個(gè)月6 0小時(shí)發(fā)

4、現(xiàn)脫分化所需時(shí)間的長(zhǎng)短與細(xì)胞內(nèi) RN變化有關(guān)。貯藏7個(gè)月， 外植體中的RNA含量從8ugi 5ug直線下降。4）光線的影響光下切菊苣外植體t暗培養(yǎng)t 35 40%周緣細(xì)胞進(jìn)入第一次細(xì)胞 分裂。綠光（低強(qiáng)度）取外植體t暗培養(yǎng)t 60 % 75%的細(xì)胞進(jìn)入第一15次分裂。暗培養(yǎng)最初910小時(shí)內(nèi)（DNA開(kāi)始復(fù)制之前），光照10- 秒，分裂細(xì)胞的百分率減少一半。外植體在DNA復(fù)制開(kāi)始后，對(duì)光線就不敏感。2、愈傷組織的特點(diǎn)、類型，及走愈傷組織的優(yōu)缺點(diǎn)：（1） 細(xì)胞大而不規(guī)則、生長(zhǎng)旺盛、高度液泡化、 異質(zhì)性（形狀大小各異）、無(wú)明顯極性，沒(méi)有次生 壁和胞間聯(lián)絲的薄壁細(xì)胞和許多小的分生細(xì)胞群。（ 2） 愈傷組

5、織按其形態(tài)結(jié)構(gòu)可分為致 密 愈 傷 ： 細(xì) 胞 小 而 致 密 ， 質(zhì) 地 堅(jiān) 實(shí) ， 生 長(zhǎng) 較 松散愈傷：細(xì)胞較大，結(jié)構(gòu)較松散，淺色，質(zhì)地松散，生長(zhǎng)迅速 （3）誘導(dǎo)培養(yǎng)愈傷組織途徑的優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)a、為細(xì)胞培養(yǎng)提供單細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)b、似乎是大規(guī)模繁殖無(wú)菌苗的途徑之一C是植物脫毒培養(yǎng)的一條有效途徑D繼代培養(yǎng)中可能建立良好的變異系缺點(diǎn)A、繼代次數(shù)增加，染色體倍性變化，愈傷分化再生苗能力漸衰減至B、愈傷組織長(zhǎng)期培養(yǎng)細(xì)胞常發(fā)生變異，分化再生苗不同于親本，喪失應(yīng)有價(jià)值。無(wú)性系快繁工廠化育苗一般不采用此途徑。3、外植體經(jīng)哪些途徑可再分化為完整植株體細(xì)胞胚-童育為植株外植體脫分化一一不定器官 （可能產(chǎn)生愈

6、傷組織具根莖的苗扱器官植抹4單扱器官丁一先莖后根一植抹先根后莖一植株4、影響體細(xì)胞胚形成的因素及調(diào)控。（影響體細(xì)胞胚發(fā)生和發(fā)育的因素）1）生長(zhǎng)物質(zhì)：主要是生長(zhǎng)素2,4-D -58%雙子葉植物，100%!子葉植物體細(xì)胞胚發(fā)生的誘導(dǎo)階 段。雙子葉用量是單子葉植物的1/101/20，誘導(dǎo)脫分化后需及時(shí)降 低或去掉2,4-D，胚性細(xì)胞才能正常發(fā)育。如：雙子葉植物枸杞： MS+0.2mg/L2,4-D callus 繼代4-5次胚性callus MS 體細(xì)胞胚2）氮源：NH4+-N（還原態(tài)氮）有利體細(xì)胞胚發(fā)生。如野生胡蘿卜培養(yǎng)基中只含55mMKNO3無(wú)體細(xì)胞胚發(fā)生，加入5mMNH4Cl體細(xì)胞胚形成。有機(jī)

7、氮促進(jìn)體細(xì)胞胚形成。水解酪蛋白（500-1000mg/L）、酵母提取物（500-1000mg/L）、氨基 酸等，均還原態(tài)氮。3）其他因子K+: 20mM是野生胡蘿卜胚胎發(fā)生所必需的。溶氧：低于一個(gè)臨界值（ 1.5mg/L）?；钚蕴?能提高胡蘿卜體胚發(fā)生的頻率。 糖:誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生不可缺的組成分。（ 4）外植體供體植物的基因型，外植體的來(lái)源和生理狀況（發(fā)育階 段），雙子葉植物用下胚軸、子葉和胚等，單子葉植物用莖尖、葉基 部和胚等第三章名詞解釋植物組織培養(yǎng)（ tissue culture ） 指在含有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和植物生長(zhǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)離體植物組織 （器官或細(xì)胞）并誘導(dǎo)使其長(zhǎng)成完整植株的技術(shù)。

8、基本培養(yǎng)基: 大量元素、微量元素、維生素和氨基酸，碳源和水。常 見(jiàn) MS White、Nitsch、B5 和 N6等。完全培養(yǎng)基: 根據(jù)不同試驗(yàn)要求， 在基本培養(yǎng)基中附加一些物質(zhì)， 如各種植物生長(zhǎng)物質(zhì)以及其它有機(jī)附加物（如椰乳、香蕉汁、番 茄汁、酵母提取物、麥芽等）。植物脫毒培養(yǎng):脫病毒方法:1、物理方法 :X射線、紫外線和高溫處理等f(wàn)病毒鈍化。常用熱處理法。方式：熱水處理（約50 C ）適用于休眠組織；熱空氣處理（35-40 C）對(duì)活躍生長(zhǎng)莖尖等。2 、 化學(xué)方法 : 農(nóng)藥，少用3 、 生物學(xué)方法：無(wú)病毒種子繁殖：較長(zhǎng)的童期，且不能保持親本優(yōu)良性狀；嫁接：0.5mm莖尖才無(wú)病毒，組織小成活率

9、低； 莖尖分生組織培養(yǎng)：最有效。人工種子（ artificial seeds ） 植物離體培養(yǎng)中產(chǎn)生的體細(xì)胞 胚或能發(fā)育成完整植株的分生組織（芽、枝尖等）包裹在含有營(yíng) 養(yǎng)物質(zhì)和具有保護(hù)功能的外殼形成的在適宜條件下能夠發(fā)芽出 苗的顆粒體。人工種子組成：胚性組織、人工胚乳、人工種皮圖15* 3人工種子的結(jié)構(gòu)思考題1、什么是植物快繁技術(shù)（微型繁殖）？總結(jié)其主要操作步驟。無(wú)性快繁技術(shù)：應(yīng)用植物組織培養(yǎng)方法，以無(wú)性系為材料大量快 速繁殖植物的技術(shù)。微型繁殖一般涉及4個(gè)步驟：無(wú)菌培養(yǎng)物的建立；莖芽的增殖；根的誘導(dǎo)；試管苗的移栽2、工廠化育苗中，要考慮那些因素？試管育苗需估計(jì)的參數(shù)：市場(chǎng)因素：技術(shù)因素：1）

10、增殖率：經(jīng)1次繼代培養(yǎng)獲得增殖體與原轉(zhuǎn)移增殖體的個(gè)數(shù)比值。(2)代期：每次繼代培養(yǎng)所用的時(shí)間。(3)代次高限：如香蕉不超過(guò)8代等。( 4 )變異率：試管苗變異率較常規(guī)繁殖高。( 5)培養(yǎng)基配方：降低生產(chǎn)成本。如液培代 固培；化學(xué)純代分析純；食用糖代蔗 糖；自來(lái)水代蒸餾水等。( 6)環(huán)境條件的優(yōu)化控制：調(diào)光、溫等。組織培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)程序和技術(shù)要點(diǎn)一、無(wú)菌培養(yǎng)物的建立二、莖芽的增殖三、根的誘導(dǎo)培養(yǎng)四、試管苗的移栽3、莖芽的增殖方式1、通過(guò)愈傷組織誘導(dǎo)不定芽的形成不定芽( adventitious buds )指從非正常(葉腋和莖尖)出芽 的位置上誘導(dǎo)而形成的芽，如從根、葉和愈傷組織中誘導(dǎo)的芽 。不足：

11、遺傳上不穩(wěn)定性，苗為二倍體、多倍體和 非整倍體等；愈傷組織再生能力隨著時(shí)間推移而下降。2、直接從外植體誘導(dǎo)不定芽的產(chǎn)生 優(yōu)點(diǎn)：誘導(dǎo)的不定芽形成一致的二倍體。缺點(diǎn)：具遺傳嵌合性的品種，在不定芽形成時(shí)招致嵌合體裂解，出現(xiàn)純型植株情況。如花斑葉天竺葵某個(gè)嵌合體品種，由葉柄節(jié)段直接形成的不定芽長(zhǎng)成植株后， 葉片或綠色或白色，無(wú)綠色與白色嵌合體。3、增強(qiáng)腋芽生枝能力腋芽去頂f代頂芽發(fā)育成主干f過(guò)程多次重復(fù)f外植體成一叢新枝f新枝f相同培養(yǎng)基f重復(fù)枝條增殖。把枝條培養(yǎng)在含CTK GA和生長(zhǎng)素等的培養(yǎng)基，可增強(qiáng)枝條腋芽生枝能力。優(yōu)點(diǎn)：開(kāi)始速度慢，一時(shí)期后，枝條數(shù)目以對(duì)數(shù)增加；莖尖培養(yǎng)，不發(fā)生基因型的變化。4

12、、配制培養(yǎng)基：100ml 大量元素 + 10ml 微量元素 + 10ml 鐵鹽+ 10ml 有機(jī)物 + 生長(zhǎng)物質(zhì) + 30g 蔗糖 + 7g 瓊脂，煮沸溶解，調(diào)pH,定容1L,滅菌備用。滅菌后的培養(yǎng)基一般隔天再用，pH偏酸0.1-0.3 。培養(yǎng)基在低溫暗中可保存一段時(shí)間（ <1 個(gè)月）。1、母液的配制和保存：培養(yǎng)基母液指按培養(yǎng)基配方配制濃度高10 100倍的高濃度溶液。大量元素10 倍微量元素10 0倍Fe 鹽（FeS04-7H2O10 0倍Na2-EDTA丄 U U | 口有機(jī)物10 0倍植物生長(zhǎng)物質(zhì)0.11.0 mg/L5、莖尖脫毒培養(yǎng)的原理：根據(jù)病毒在植物體輸導(dǎo)組織傳播，造成分布不

13、均一性。老葉及成熟的組織或器官中病毒含量較高，幼嫩及未成熟的組織和器官中病毒含量較低，生長(zhǎng)點(diǎn)（0.1-1mm區(qū)域）由于輸導(dǎo)組織尚未形成， 幾乎不含病毒6、抽濾滅菌法對(duì)象：高溫高壓易被破壞的成分（GA IAA、ZT 、ABA尿素和某些維生素等） 或液體培養(yǎng)基。操作：濾膜（孔徑0.45微米）、過(guò)濾器和 抽濾瓶等高壓滅菌，無(wú)菌條件下 溶液經(jīng)濾膜流入抽濾瓶中或已冷卻（V40 C)的培養(yǎng)基中。7、如何調(diào)整培養(yǎng)基配方以促進(jìn)根和芽的分化？一般增殖芽長(zhǎng)到12厘米時(shí)， 轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基培養(yǎng)。篩選生根培養(yǎng)基配方的原則： 發(fā)根快、多而粗壯，莖基部不形成愈傷組織。生根培養(yǎng)基：去除CTK降生長(zhǎng)素濃度，甚至在無(wú)激素； 1/

14、2 或 1/4MS。第四章懸浮培養(yǎng)( suspension culture )在愈傷組織液體培養(yǎng)的基礎(chǔ)上 發(fā)展起來(lái)。 指將單個(gè)游離細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培 養(yǎng)增殖的技術(shù)。成批培養(yǎng) ( Batch culture )： 細(xì)胞接種到一個(gè)與外界隔絕的只允許氣體和揮發(fā)性的代謝物 質(zhì)交換的、營(yíng)養(yǎng)液體積保持不變的密閉系統(tǒng)中培養(yǎng)。培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡時(shí)，細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)停止。取小部分 的懸浮培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入相同新鮮培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)(約稀釋了5 倍)。連續(xù)培養(yǎng)( Continuous culture )： 在一定容積但非密閉的反 應(yīng)器中進(jìn)行， 培養(yǎng)過(guò)程中不斷注入新鮮培養(yǎng)基， 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)連續(xù)得 到補(bǔ)充，細(xì)胞的

15、生長(zhǎng)和增殖連續(xù)進(jìn)行。固相化細(xì)胞培養(yǎng) ：細(xì)胞固定在一種惰性基質(zhì)上 (如瓊脂、 藻酸鹽、 聚丙烯酰胺和纖維等膜)，細(xì)胞不能運(yùn)動(dòng)，營(yíng)養(yǎng)液在胞間流動(dòng)， 供應(yīng)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)方法。單細(xì)胞培養(yǎng) (Single cell culture)，也稱單細(xì)胞克隆技術(shù)。指單離細(xì)胞在一定培養(yǎng)條件下進(jìn)行增殖、 分化并形成完整植株的 過(guò)程。植板率(%)=(細(xì)胞團(tuán)數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))X 100%1、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的類型及培養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)注意的事項(xiàng)？ 懸浮培養(yǎng)類型：成批培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)(封閉式連續(xù)培養(yǎng)、開(kāi)放式 連續(xù)培養(yǎng)、恒化培養(yǎng)、恒濁培養(yǎng))成批培養(yǎng)注意事項(xiàng)：( 1 )培養(yǎng)期間培養(yǎng)罐內(nèi)的壓力應(yīng)保持在 0.5 kg/cm2 。( 2)指數(shù)生長(zhǎng)期

16、內(nèi)，應(yīng)追加消泡劑(如丙烯乙二醇等)。連續(xù)培養(yǎng)注意：(1) 防pH變動(dòng)，加固態(tài)磷酸緩沖劑，如磷酸鈣、EDTA等。( 2)培養(yǎng)過(guò)程中加入消泡劑。( 3)加入抗菌劑防反應(yīng)器污染，如泰樂(lè)菌素和制菌素等。2、單細(xì)胞培養(yǎng)的技術(shù)方法有哪些？1、平板培養(yǎng)(plating culture ):瓊脂+液體培養(yǎng)基-熔化-冷卻約35°C與等體積的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液混合倒培養(yǎng)皿凝固薄層(約1mm 封口膜培養(yǎng)單個(gè)細(xì)胞或由幾個(gè)細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)生長(zhǎng)、分裂，形成起源于單細(xì)胞的小群落f編號(hào)f分離 小群落f進(jìn)一步擴(kuò)大繁殖f形成起源單細(xì)胞的無(wú)性系。不加瓊脂即液體淺層培養(yǎng)。2、 看護(hù)培養(yǎng) (nurseculture )懸浮細(xì)胞液

17、細(xì)胞分裂形成愈傷級(jí)織愈傷組織廣j I濾紙:|產(chǎn)*' 仟宀 4牙芥寧£三弋于奇T' jEb-i_ -:*亠二二 Ji 盞3亜 - t: ” r"3d I-食傷組織增殖培養(yǎng)/看護(hù)培養(yǎng)示意圖3、微室培養(yǎng)(micro-chamber culture ):無(wú)菌下，含培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)在微室，顯微鏡下連續(xù)觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)、分裂和小細(xì)胞團(tuán)形成的全過(guò)程。4、 條件培養(yǎng)(conditional culture ):加入條件培養(yǎng)液(經(jīng)一定時(shí)間細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)液)。5、飼喂層技術(shù)(feeder layer technique ):核失活的植物活細(xì)胞制一薄層，單細(xì)胞以液體淺層或平板培

18、養(yǎng)在薄層上。3、細(xì)胞大量培養(yǎng)生產(chǎn)有用物質(zhì)的技術(shù)因素有哪些？1、高產(chǎn)目的物細(xì)胞系的選擇(1) 以特異器官為外植體，建立高產(chǎn)細(xì)胞系。(2) 化學(xué)誘變或紫外線照射等篩選高產(chǎn)細(xì)胞系。（3）利用克隆技術(shù)篩選出高產(chǎn)色素、維生素、生物堿和甾類等 化合物的細(xì)胞系。2、二步培養(yǎng)法 第一步：解決生物產(chǎn)量，即增加細(xì)胞量。 第二步：解決次生物質(zhì)生產(chǎn)問(wèn)題，即促進(jìn)次生物質(zhì)的合成。紫草寧生產(chǎn)：先 LS 培養(yǎng)基中促細(xì)胞的生長(zhǎng)；后轉(zhuǎn) White 培養(yǎng)基 促紫草寧生產(chǎn)。紫草寧衍生物產(chǎn)量比僅在 White 培養(yǎng)基上翻一 番，僅在 LS 培養(yǎng)基上幾乎測(cè)不出紫草寧衍生物。3、在培養(yǎng)基中適時(shí)加入次生代謝物的前體 如培養(yǎng)一周的曼陀羅愈傷組

19、織振蕩培養(yǎng)液中，添加0.2%苯丙氨酸，生物堿產(chǎn)量比對(duì)照高 3 倍；但培養(yǎng)三周后添加 0.2%苯丙氨 酸，導(dǎo)致生物堿產(chǎn)量減少。紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)中，在培養(yǎng)第 15 天向培養(yǎng)基中同時(shí)加入果糖和 前體物質(zhì)，獲得較高產(chǎn)量的紫杉醇。4、培養(yǎng)基中植物生長(zhǎng)物質(zhì)的作用：常用2,4-D、IAA、IBA、NAA和細(xì)胞分離素。如煙草愈傷組織培養(yǎng)中， 含 IAA 的培養(yǎng)基上能合成煙堿； 毛地 黃愈傷組織培養(yǎng)基中含IAA，合成毛地黃蒽醌能力高；培養(yǎng)三分 三愈傷組織時(shí)，在生長(zhǎng)后期添加 1mg/LKT, 使東莨菪堿的含量高 于植物體中。是次生代謝產(chǎn)物的啟動(dòng)因子。5、培養(yǎng)條件的影響：光強(qiáng)： 如煙草細(xì)胞培養(yǎng)物中黃酮類的合成需光；蕓

20、香愈傷 組織在光和暗中精油的成分不同。光質(zhì) ：紅光提高胡蘿卜愈傷組織中葉綠素及胡蘿卜素的含 量；藍(lán)光抑制八仙花細(xì)胞培養(yǎng)物中多酚化合物的合成。溫度 ：如胡蘿卜愈傷組織低溫處理能形成花青素；植物細(xì)胞培養(yǎng)物的脂肪酸的積累在15C下積累最多第五章原生質(zhì)體融合( protoplast fusion )或體細(xì)胞雜交( somatic hybridization )不同親本的原生質(zhì)體間在人工條件下互相融為 一體，通過(guò)離體培養(yǎng)，使其再生雜種植株的技術(shù)。自發(fā)融合和誘 導(dǎo)融合。自發(fā)融合 (spontaneous fusion )在酶解細(xì)胞壁過(guò)程中，胞間連 絲的擴(kuò)展和黏連，有些相鄰的原生質(zhì)體能彼此融合形成同核體 (

21、homokaryon) ，每個(gè)同核體包含 240 個(gè)核。誘發(fā)融合 (i nduced fusion) 質(zhì)膜表面負(fù)電性，原生質(zhì)體間互相排 斥，一定誘導(dǎo)方法，促原生質(zhì)體的融合。不同來(lái)源的原生質(zhì)體融 合形成的雜種原生質(zhì)體稱異核體( heterokaryon )1、影響植物原生質(zhì)體的制備的因素有哪些?A 、 原生質(zhì)體制備的原始材料 葉片：最方便最普遍的來(lái)源，分離到較均勻一致的原生質(zhì)體。B、酶混合液 纖維素酶( Cellulase )： Onozuka R-10 ， Onozuka R-S ，EA3-867。消化細(xì)胞壁的纖維素。 半纖維素酶(Hemicelluase ) : RhozymeHP-150。

22、消化細(xì)胞壁 的半纖維素。 果膠酶(Pectinase ) : Pectalyase Y-23。溶解細(xì)胞間由果膠 質(zhì)組成的胞間層。 崩潰酶(Driselase ):含纖維素酶、果膠酶、 蛋白酶和核酸酶等。 蝸牛酶：含多種解離酶，分解抱粉素和木質(zhì)素，用花粉母細(xì)胞 和四分體的小孢子等。配置酶制劑原則：最少品種和最少量， 但能分離得到健康的原生質(zhì)體。 纖維素酶和 果膠酶為必需酶。一般葉片用纖維素酶和果膠酶； 愈傷組織或根再添加半纖維素酶2、滲透壓穩(wěn)定劑 離體原生質(zhì)體基本屬性：滲透破碎性。在酶溶液、原生質(zhì)體清洗 介質(zhì)和原生質(zhì)體培養(yǎng) 基中加入適當(dāng)?shù)臐B透壓穩(wěn)定劑。 在合適滲透壓溶液中，原生質(zhì)體呈球形。滲透壓

23、穩(wěn)定劑： 甘露醇、山梨醇、葡萄糖等。目的：( 1)使細(xì)胞產(chǎn)生輕度質(zhì)壁分離；( 2)保持原生質(zhì)體的完整性；（ 3）原生質(zhì)體生命活動(dòng)的碳源 葉片用前兩者；懸浮細(xì)胞用葡萄糖。濃度 450-800 mmol/L3、原生質(zhì)膜穩(wěn)定劑無(wú)機(jī)鹽類或其它化合物如：CaCI2、KH2PO4葡聚糖硫酸鉀等。目的：降低酶制劑中的 RNA酶活性、防止質(zhì)膜被破壞、提高原生質(zhì)體的活力。C、酶混合液：1、酶制劑2、滲透壓穩(wěn)定劑3、原生質(zhì)膜穩(wěn)定劑pH值一般為5.46.0 貯存于冰箱，使用時(shí)化凍即可，可保存數(shù)月。2、融合的雜種細(xì)胞如何選擇 ?（1）雙熒光標(biāo)記法熒光染料異硫氰酸熒光素（FITC,綠色）和異硫氰酸羅丹明（RTTC 紅光

24、）分別標(biāo)記兩種來(lái)源的原生質(zhì)體。熒光顯微鏡，選擇雜種細(xì) 胞。（ 2）互補(bǔ)選擇法：在遺傳上、生理上和抗性上互補(bǔ)等的方法。白化（aB） + 白化（Ab）-綠（AaBb）營(yíng)養(yǎng)缺陷（aB）+營(yíng)養(yǎng)缺陷（Ab）-自養(yǎng)（AaBb）3、體細(xì)胞雜種的鑒定（1）形態(tài)學(xué)觀察：株高、葉形、花形和花色等。雜種植株具有雙親形態(tài)特征， 或雙親的中間類型，或與親本有區(qū)別。種間趨雙親間； 屬間則 偏向某一方。（2）細(xì)胞學(xué)觀察：應(yīng)用染色體計(jì)數(shù)法、 核型分析和顯帶技術(shù)鑒定觀察染色體數(shù)目、 大小與形態(tài)變化。（3）生化鑒定：同功酶譜分析法：酯酶、過(guò)氧化物酶和 6- 磷酸 葡萄糖脫氫酶等。體細(xì)胞雜 種常表現(xiàn)雙親酶譜的特征。4、體細(xì)胞融合的

25、意義是什么 ?（1）合成新的物種， 多種利用價(jià)值的新經(jīng)濟(jì)植物。（2）培育抗病新種質(zhì)，一種植物抗性（抗病、抗寒等）轉(zhuǎn)入另 一植物，研究最多是馬鈴薯。馬鈴薯野生種抗多種病毒。（3）低光合作用效率的植物轉(zhuǎn)變成高光效植物。如：C3 X C4（4）將豆科植物的共生結(jié)瘤固氮能力轉(zhuǎn)入非豆科植物。（5）得到高含量次生代謝產(chǎn)物（生物堿等）的植物。第六章單倍體育種以單倍體為材料的育種程序，含花粉培養(yǎng)、花藥培養(yǎng)、未受精子房培養(yǎng)和胚珠培養(yǎng)等?；ㄋ幣囵B(yǎng)( anther culture ) ：對(duì)花粉發(fā)育到一定階段的花藥 進(jìn)行培養(yǎng)， 改變花藥內(nèi)花粉粒的發(fā)育途徑， 形成花粉胚或花粉愈 傷組織，后由胚狀體直接發(fā)育為植 株，或使

26、愈傷組織分化成植株的過(guò)程?；ǚ叟囵B(yǎng)( Pollen culture ) ：從花藥游離出花粉粒通過(guò)培養(yǎng) 使花粉粒脫分化啟動(dòng)發(fā)育為單倍體植株的過(guò)程。幼胚 (immature embryo) 培養(yǎng) 指發(fā)育未成熟的胚培養(yǎng)， 要求較好 的培養(yǎng)條件和較復(fù)雜的操作技術(shù)(胚剝離)，越早期的胚，培養(yǎng) 越困難。1、通過(guò)離體培養(yǎng)獲得單倍體的途徑有哪些？ 以單倍體為材料的育種程序，含花粉培養(yǎng)、花藥培養(yǎng)、未受精子 房培養(yǎng)和胚珠培養(yǎng)等2、花藥培養(yǎng)中如何選擇外植體？(1)供試材料的遺傳背景： 不同種、不同品種間花藥，離體培養(yǎng)反應(yīng)能力有明顯差異。如馬 鈴薯 tuberosum 種的 80 多個(gè)品種花藥培養(yǎng)中， 只 12 個(gè)品

27、種被啟 動(dòng)，其中只 2 個(gè)品種得到單倍體植株?；ㄋ幹行℃咦赢a(chǎn)生植株的能力被稱為花藥培養(yǎng)力。 已證明花 藥培養(yǎng)力與一些基因的表達(dá)有關(guān)。(2) 供試材料的生理狀態(tài)：A 、多年生植物中幼年比老年好。B、草本植物生長(zhǎng)健壯和生殖生長(zhǎng)高峰期的花藥誘導(dǎo)頻率高。如煙草開(kāi)花早期花藥易產(chǎn)生花粉植株，約在始花期 6天時(shí)花藥的花粉胚誘導(dǎo)頻率最高。C 、一定程度的逆境下有利于花藥萌發(fā)。如高緯度和高海拔的小麥花藥培養(yǎng)成功率較高。逆境有利于花藥中的小抱子在培養(yǎng)條件下表達(dá)細(xì)胞全能性。(3) 花粉的發(fā)育時(shí)期：誘導(dǎo)花粉胚或花粉愈傷組織適宜的培養(yǎng)時(shí)期為單核中晚期(即單核靠邊期)到雙核早期。3、花藥培養(yǎng)與花粉培養(yǎng)有什么不同?花藥培養(yǎng)

28、與花粉培養(yǎng)的比較外植體花藥培養(yǎng)花藥花粉培養(yǎng)花務(wù)組織培養(yǎng)觀念器官培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)再生植株倍性單倍及雙倍體單倍體取材簡(jiǎn)單難1倍性鑒定難簡(jiǎn)單4、花藥培養(yǎng)過(guò)程中花藥為何要經(jīng)過(guò)低溫處理？(1) 低溫預(yù)處理明顯提高花粉胚的誘導(dǎo)頻率。低溫作用：保持高比例的強(qiáng)生活力花粉， 同時(shí)延緩體細(xì)胞組 織的衰老；激發(fā)花粉產(chǎn)生原胚；促使細(xì)胞同步分裂。5、花藥培養(yǎng)時(shí)為什么要用較高濃度蔗糖和較低濃度的激素？高濃度2,4-D主要誘導(dǎo)花藥形成愈傷組織， 增加二倍體細(xì)胞發(fā)育 的機(jī)會(huì)?；ㄋ幣囵B(yǎng)基的激素水平要相對(duì)較低才能抑制花藥壁等二倍體細(xì)胞的分裂。6、花藥培養(yǎng)中再生植株的形成途徑與再生植株倍性有何關(guān)系？ 胚狀體途徑；愈傷組織途徑。馬鈴磬花

29、藥培養(yǎng)中胚狀體和愈傷組織的倍性植物來(lái)源倍性細(xì)胞類型胚狀體n愈傷組織n, 2n, 2n+單個(gè)花粉粒單個(gè)或多個(gè)花粉粒、花 粉細(xì)胞與花藥壁細(xì)胞等來(lái)源愈傷組織：植株分化時(shí)出現(xiàn)混倍體現(xiàn)象。7、幼胚培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)是什么？A、取材時(shí)期：球形胚至魚(yú)雷胚時(shí)期。B 、幼胚剝離：一個(gè)胚為一個(gè)植株，剝離成功與否是幼胚培養(yǎng)能 否成功的關(guān)鍵。借助解剖鏡，剝離過(guò)程要保濕（幼胚半透明、高 黏稠狀組織，易失水），操作快速。C 、接種培養(yǎng)：立即接種培養(yǎng)基中培養(yǎng)。8、植物胚培養(yǎng)的意義 ? 克服雜交育種中雜種胚的早期夭折 遠(yuǎn)緣雜交常發(fā)生雜種不育現(xiàn)象：胚發(fā)育不良；胚乳發(fā)育不良；有 時(shí)胚和胚乳間的障礙物質(zhì)阻礙了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸?shù)取?克服珠

30、心胚干擾，提高育種效率 自然界中有些植物種子存在多胚現(xiàn)象如柑橘、 芒果等。 受精只產(chǎn)生的一個(gè)有性胚， 珠心細(xì)胞發(fā)育成多胚。 珠心胚干擾雜種胚的 確定，珠心胚造成雜種胚夭折。通過(guò)幼胚培養(yǎng)可克服。 理論研究領(lǐng)域的應(yīng)用，如研究胚發(fā)育中胚乳的作用等。9、幼胚培養(yǎng)條件 培養(yǎng)基：幼胚處于異養(yǎng)狀態(tài)，培養(yǎng)基不僅要完全的 營(yíng)養(yǎng)成分，對(duì)培養(yǎng)基滲透壓（ 4 -12 蔗糖）。因原胚“浸沒(méi)” 在高滲透壓的胚乳液中，若處低滲中，幼胚生長(zhǎng)停頓或死亡。胚 小f大，滲透壓?jiǎn)Jf 低。激素水平：為控制胚性生長(zhǎng)，促進(jìn)胚發(fā)育成熟，要求生長(zhǎng)素和細(xì) 胞分裂素配合使用。低濃度 GA和KT能促進(jìn)幼胚早熟萌發(fā)， GA 有時(shí)具有胚柄作用，GA是必

31、需的，一般為0.5mg/L。附加物： 幼胚培養(yǎng)多處于異養(yǎng)階段， 需胚乳和周圍的母體組織提供營(yíng)養(yǎng)。常用復(fù)雜的天然植物提取物（胚乳提取物必不可少，椰乳、玉米胚乳和麥芽提取物等），它既含多種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑， 又提供胚發(fā)育所需的豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)?；钚蕴浚和ǔ＜尤肱囵B(yǎng)基，吸收胚培養(yǎng)中釋放的有毒物或過(guò)量 抑制胚生長(zhǎng)的物質(zhì)，使胚順利發(fā)育成熟、成苗。光照：培養(yǎng)初期黑暗條件是必需的。黑暗時(shí)間與胚發(fā)育時(shí)期有關(guān)，早期胚暗期長(zhǎng)。如球型胚至心 形胚暗培養(yǎng)2周后光照。芥菜實(shí)驗(yàn)，早期光照 不利胚根的發(fā)育，但胚芽發(fā)育需一定的光照。溫度：與該植物種子萌發(fā)溫度一致。第七章遺傳轉(zhuǎn)化：是指同源或異源的游離DNA分子（質(zhì)粒和染色體DNA） 被自然或人工感受態(tài)細(xì)胞攝取，并得到表達(dá)的水平方向的基因轉(zhuǎn)移過(guò) 程。直接轉(zhuǎn)化：將裸露的DNA直接導(dǎo)入植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化方法。裸露的DNA可以