副豬嗜血桿菌的分離與鑒定

1、副豬嗜血桿菌的分離與鑒定摘要：從福建省龍巖市l(wèi)例臨床癥狀、病理剖檢變化疑似副豬嗜血桿菌病的患病豬的關(guān)節(jié)液中分離到1株革蘭氏染色陰性可疑菌株，經(jīng)衛(wèi)星現(xiàn)象、生化鑒定等實(shí)驗(yàn)室診斷，進(jìn)一步以副豬嗜血桿菌的16 S rRNA基因設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR鑒定，確定該分離菌為副豬嗜血桿菌。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，分離株對(duì)環(huán)丙沙星、氨芐西林、阿米卡星、慶大霉素、氟苯尼考、磺胺類等藥物敏感；對(duì)阿莫西林、諾氟沙星有抵抗力。關(guān)鍵詞：副嗜血桿菌；分離鑒定；藥敏試驗(yàn)Isolation and Identification of Haemophilus parasuisXiaohua-Li xiaoyan-Yang xinti

2、an-Zheng ailing-Dai gaina-Li1. College of Life Sciences, Longyan University, Longyan, Fujian Province 364000, PR China2. Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine and Biotechnology, Longyan University, Longyan, Fujian Province 364000, PR China3. Engineering Research Center for the Prevention

3、and Control of Zoonosis，F(xiàn)ujian Province 364000, PR ChinaAbstract：A covey of swine whose clinical symptoms looked like Haemophilus parasuis disease were checked by lab technologiesResearch as bacteria observation，cultural characteristics and biochemical properties of Haemophilus parasuis were doneAcc

4、ording to the sequence of bacterium l6S rRNA，special primers were designed for PCR amplification. The results showed that the strain was tentatively identified as Haemophilus parasuisThe drug sensitive tests showed：the strain was sensitive to 環(huán)丙沙星、氨芐西林、阿米卡星、慶大霉素、氟苯尼考、磺胺類等藥物敏感；對(duì)阿莫西林、諾氟沙星Key words：Hae

5、mophilus parasuis；isolation and identification; drug sensitive test李曉華(1968、8) ,女,福建長(zhǎng)汀人，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事實(shí)驗(yàn)室管理及動(dòng)物疫病防控研究?；痦?xiàng)目：福建省科技廳創(chuàng)新平臺(tái)建設(shè)項(xiàng)目（FJ200812） 福建省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2008N2005） *通訊作者豬副嗜血桿菌病(Haemophilus parasuis，Hps)又稱“革拉瑟氏病”(Gllissers Disease)，是由副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis)引起的一種以多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎為特征的疾病1。該菌寄生在健康豬鼻腔等上呼吸道內(nèi)

6、，主要通過空氣直接接觸傳播，其他傳播途徑如消化道等亦可傳播2。主要影響24周齡的豬，感染高峰為46周齡的豬3，發(fā)病率在10%15%，嚴(yán)重時(shí)病死率可達(dá)50%。隨著規(guī)模化養(yǎng)殖和養(yǎng)殖密度的增加，近年來，該病的發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢(shì)，成為危害規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)最嚴(yán)重的細(xì)菌性疾病之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2008年10月，福建龍巖某規(guī)?；i場(chǎng)58周齡的保育豬發(fā)病嚴(yán)重,臨床癥狀主要表現(xiàn)為精神沉郁、食欲減少，體溫升高40-41,流鼻涕,腹式呼吸,被毛粗亂，消瘦、關(guān)節(jié)腫大，病豬不愿站立，跛行，病程達(dá)4個(gè)多月，發(fā)病率40%。剖檢病變主要表現(xiàn)為體內(nèi)有水腫、充血、血液不凝,呈暗紅色,全身臟器多數(shù)有出血斑點(diǎn),膀

7、胱粘膜和腎皮質(zhì)點(diǎn)狀出血,喉、會(huì)咽斑狀出血,胸腔內(nèi)有大量淡紅色液體、纖維性滲出物;心包有大量纖維素性滲出物，似菜花狀；肺臟呈纖維素性胸膜肺炎,腹腔內(nèi)有大量透明黃褐色滲出液；關(guān)節(jié)腔內(nèi)充滿黃色渾濁液。懷疑豬副嗜血桿菌感染而致，隨機(jī)采集病料進(jìn)行病原分離鑒定及藥敏試驗(yàn)。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 病料采自福建省龍巖市某豬場(chǎng)疑似Hps發(fā)病仔豬的肺臟、心血、關(guān)節(jié)積液、心包液、氣管。1.1.2 培養(yǎng)基普通瓊脂培養(yǎng)基、鮮血瓊脂培養(yǎng)基、巧克力瓊脂培養(yǎng)基由實(shí)驗(yàn)室配制、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）培養(yǎng)基購(gòu)于青島海博公司；0.005%NAD巧克力瓊脂培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基購(gòu)于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；

8、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）購(gòu)于成都貝斯特試劑有限公司1.1.3 生化微量鑒定管H2S、蔗糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、山梨醇、甘露醇、尿素酶、賴氨酸、鳥氨酸、苯丙氨酸、葡萄糖、D-核糖、葡萄糖酸、檸檬酸鹽均購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。1.1.4 藥敏試紙：強(qiáng)力霉素、阿莫西林、磺胺-6-甲氧嘧啶、環(huán)丙沙星、氨芐西林、頭孢噻呋鈉、阿米卡星、恩諾沙星、諾氟沙星、卡那霉素、慶大霉素、氟苯尼考、復(fù)方治菌磺、 林可大觀、磺胺間甲氧嘧啶、泰妙菌素、泰樂菌素等藥敏紙片由實(shí)驗(yàn)室自制。1.1.5 PCR反應(yīng)試劑：如Taq DNA聚合酶 (5IU/L)、蛋白酶K、dNTPs，均由寶生物(大連)有限公司提供，-2

9、0保存。1.1.6 引物設(shè)計(jì)與合成參照Simone Oliveira等9的報(bào)道合成引物：上游引物P1：5-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3,下游引物P2：5-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3，預(yù)擴(kuò)增片段大小為821bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。1.2 方法1.21細(xì)菌的分離培養(yǎng) 無菌取送檢的疑似患病豬的肺臟、心血、心包液、氣管和關(guān)節(jié)積液，劃線接種于巧克力培養(yǎng)基和5%新生牛血清TSA培養(yǎng)基,置于37恒溫培養(yǎng)箱中，燭缸培養(yǎng)24-48h，觀察結(jié)果。1.2.2 細(xì)菌形態(tài)及生化特性檢查1.2.2.1細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查 挑取TSA平板上生長(zhǎng)的疑似菌落涂片，革蘭氏染色鏡檢，觀察細(xì)

10、菌的形態(tài)特征。12.2.2細(xì)菌培養(yǎng)特性 挑取TSA平板上生長(zhǎng)的單菌落，分別接種于含0.005%NAD的兔鮮血瓊脂培養(yǎng)基平板、5%新生牛血清TSA培養(yǎng)基平板、鮮血瓊脂培養(yǎng)基平板、巧克力瓊脂培養(yǎng)基平板、麥康凱培養(yǎng)基和普通培養(yǎng)基平板中，置于37恒溫培養(yǎng)箱中，燭缸培養(yǎng)24-48h。觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。1.2.3衛(wèi)星試驗(yàn) 在兩個(gè)不含V因子的兔鮮血瓊脂平板上接種可疑菌株，一個(gè)平行劃線接種兩行金黃色葡萄球菌，另一個(gè)作對(duì)照。在培養(yǎng)箱中37燭缸培養(yǎng)48 h，觀察結(jié)果。1.2.4生化鑒定 將分離所得可疑菌株的純培養(yǎng)物分別接種于H2S、蔗糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、山梨醇、甘露醇、尿素酶、賴氨酸、鳥氨酸、苯丙氨酸、葡

11、萄糖、D-核糖、葡萄糖酸、檸檬酸鹽微量生化鑒定管中，每支生化管中同時(shí)加入1L牛血清和1LNAD的（V因子）置于37恒溫培養(yǎng)箱，燭缸培養(yǎng)24-48h,觀察結(jié)果。接觸酶試驗(yàn)：挑取單菌落在一潔凈的玻片上，滴加30%的過氧化氫，30s內(nèi)觀察反應(yīng)結(jié)果。1.2.5 PCR檢測(cè)1.2.5.1 細(xì)菌DNA的提取挑取單菌落進(jìn)行亞克隆培養(yǎng)，用滅菌的雙蒸水小心刮洗菌苔,置于1.5mL離心管中。12000rpm離心30s,棄上清，保留細(xì)胞沉淀；加入567LTE懸浮沉淀，用等體積酚氯仿異戊醇(25241)抽提,，使兩相完全混合，冰浴10分鐘。12000rpm離心10分鐘，吸取上清液，等體積氯仿異戊醇(241)再抽提1次

12、，至溶液中有絮狀的DNA沉淀出現(xiàn)；將DNA沉淀轉(zhuǎn)移到1mL70%乙醇中洗滌，65干燥箱中干燥2分鐘。用50-100LTE緩沖液(含20g/mLRNase)溶解DNA沉淀，即為試驗(yàn)所需模板，4保存?zhèn)溆谩?2.5.2 PCR鑒定以上述方法提取得到的菌株DNA為模板,將P1、P2等比例混合，PCR反應(yīng)體系為50L:10×Taq Buffer5L, 10mol/LdNTP2L,Template2L,5U/LTaqDNA聚合酶1L, H2O36L，上、下游引物(濃度均為10 molL)各1 L，反應(yīng)條件為94 5min；94 30s, 58 30s, 72 1min,30個(gè)循環(huán);72 7min

13、。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳,觀察結(jié)果。1.2.6藥敏試驗(yàn)無菌棉簽蘸取分離菌的菌懸液,涂布接種于含NAD及新生犢牛血清的TSA平板上,然后把做好的藥物紙片用無菌鑷子分別平貼于培養(yǎng)基表面,于37CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,測(cè)量抑菌環(huán)直徑并判定結(jié)果。判斷標(biāo)準(zhǔn)為：抑菌圈直徑小于15 mm的為不敏感，1520 mm的為中度敏感，20 mm以上的為高度敏感。2 結(jié)果2.1細(xì)菌的分離培養(yǎng)取關(guān)節(jié)液劃線接種的巧克力培養(yǎng)基上出現(xiàn)無色、透明的小菌落,接種于普通培養(yǎng)基不生長(zhǎng)。接種于TSA平板，可見有針尖大小、圓形、光滑濕潤(rùn)、無色透明、邊緣整齊的小菌落生長(zhǎng)。2.2細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查取分離所得可疑菌落涂片，革蘭氏染色后

14、在光學(xué)顯微鏡下見到革蘭氏陰性的短桿狀或球桿狀小桿菌，以纖細(xì)桿狀居多。 2.3培養(yǎng)特性該菌在普通瓊脂平板、麥康凱培養(yǎng)基中均未見生長(zhǎng)，在鮮血瓊脂平板、巧克力平板上生長(zhǎng)不好，在TSA平板、NAD鮮血瓊脂平板上生長(zhǎng)良好。表1 細(xì)菌培養(yǎng)特性Table 1.The Cultural Characteristics of the isolatied strains培養(yǎng)基 生長(zhǎng)情況 菌落形態(tài)普通培養(yǎng)基 -麥康凱培養(yǎng)基 -SS培養(yǎng)基 -鮮血瓊脂培養(yǎng)基 + 極少數(shù)無色透明、邊緣光滑、濕潤(rùn)的針尖狀大小菌落，傳代后幾乎不生長(zhǎng)巧克力瓊脂培養(yǎng)基 + 無色透明、邊緣光滑、濕潤(rùn)、針尖狀大小的菌落，傳代后幾乎不生長(zhǎng)0.005%

15、NAD的鮮血瓊脂培養(yǎng)基 + 無色透明、邊緣光滑、濕潤(rùn)的菌落，菌落呈針尖狀大小，邊緣整齊含5%新生牛血清和0.005%NAD TSA培養(yǎng)基 + 無色透明、邊緣光滑、濕潤(rùn)的菌落，菌落呈針尖狀大小，邊緣整齊，大量的菌落連成一片注：“+”生長(zhǎng)良好；“+”生長(zhǎng)一般；“+”生長(zhǎng)但生長(zhǎng)較差；“+”生長(zhǎng)但極難生長(zhǎng)； “-”不長(zhǎng)。2.4衛(wèi)星現(xiàn)象試驗(yàn)觀察結(jié)果可見，越接近葡萄球菌所形成的菌株，菌落越大、越多，離葡萄球菌愈遠(yuǎn)，菌落越小、越少，甚至不生長(zhǎng)，呈現(xiàn)出明顯的“衛(wèi)星現(xiàn)象”。2.5生化鑒定結(jié)果分離株生化鑒定結(jié)果見表2。表2：分離菌生化鑒定結(jié)果Table 2.The biochemistries identific

16、ation of isolatied strains項(xiàng)目ItemH2S蔗糖Saccharose麥芽糖Maltobiose乳糖lactose半乳糖Galactose山梨醇Sorbitolum甘露醇Manciol尿素酶urase接觸酶Catalase結(jié)果Result-+-+項(xiàng)目Item賴氨酸lysine鳥氨酸ornithine苯丙氨酸L-Phenylalanine葡萄糖DextrosD-核糖Ribose葡萄糖酸鹽gluconate檸檬酸鹽citrate結(jié)果Result-+-注:“- ”陰性;“+ ”陽性。 Note:" + "positive ," - "

17、negative.2.6 PCR反應(yīng)結(jié)果以提取的總DNA產(chǎn)物作為模板,用PCR方法擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察，發(fā)現(xiàn)被檢菌株有約821bp的特異性條帶，其大小與預(yù)期的擴(kuò)增片段大小相符。如圖2:圖2：PCR檢測(cè)結(jié)果M：DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2000；1:分離株P(guān)CR產(chǎn)物；2：陰性對(duì)照Figure 2.Results of PCR identificationM: DNA Marker DL 2000; 1: Results of PCR amplification ;2.7分離菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌對(duì)環(huán)丙沙星、卡那霉素、強(qiáng)力霉素、頭孢噻呋鈉、氨芐西林、慶大霉素高敏，對(duì)泰樂

18、菌素、磺胺-6-甲氧嘧啶中敏，對(duì)林可大觀、泰妙菌素、諾氟沙星 磺胺間甲氧嘧啶低敏，見表3。表3:分離菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果藥物 抑菌圈直徑/mmDrugs Diameter環(huán)丙沙星Ciprolfloxacin 32卡那霉素 Kanamycin 30強(qiáng)力霉素 Doxycycline 26頭孢噻呋鈉Ceftiofur Sodium 24氨芐西AmpicillinSuppositories 23慶大霉素Gentamicin 22阿米卡星 Amikacin 20泰樂菌素 Tylosin 18磺胺-6-甲氧嘧啶Sulfamonmethoxine 17林可大觀Spectinomycin Hydrochloride

19、 14泰妙菌素 Tiamulin 12諾氟沙星 Norfloxacin 10磺胺間甲氧嘧啶Sulfamonomethoxine 6注：抑菌直徑d20mm為高度敏感;15mmd<20mm為中度高敏; d<15mm為不敏感。3 討論與小結(jié)3.1 根據(jù)分離菌的菌落形態(tài)特征、鏡檢結(jié)果、生化特性及衛(wèi)星現(xiàn)象結(jié)果，初步鑒定為副豬嗜血桿菌，以HPS的16SrRNA中的基因序列設(shè)計(jì)合成引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，成功擴(kuò)增出長(zhǎng)約821bp的16sRNA基因片段,說明分離菌株為HPS。該菌在普通瓊脂平板、麥康凱培養(yǎng)基中均未見生長(zhǎng)，在鮮血瓊脂平板、巧克力平板上生長(zhǎng)不好，在TSA平板、NAD鮮血瓊脂平板上生長(zhǎng)良好

20、。說明5%新生牛血清TSA培養(yǎng)基是HPS的理想培養(yǎng)基。3.2 該菌的藥敏結(jié)果顯示，對(duì)環(huán)丙沙星、卡那霉素、強(qiáng)力霉素、頭孢噻呋鈉、氨芐西林、慶大霉素高敏，對(duì)泰樂菌素、磺胺-6-甲氧嘧啶中敏，對(duì)林可大觀、泰妙菌素、諾氟沙星 磺胺間甲氧嘧啶低敏，與高鵬程、呂素芳等的研究結(jié)果基本相同。3.3 本研究根據(jù)Hps的l6 S rRNA序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過熱裂解法和CTABA裂解法對(duì)PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化，成功擴(kuò)增出了821bp片段，所建立的PCR檢測(cè)方法不僅可從分離培養(yǎng)物中對(duì)Hps進(jìn)行鑒定，而且可以直接對(duì)病料進(jìn)行PCR檢測(cè)，在臨床診斷中具有實(shí)用性。3.4 近年來，副豬嗜血桿菌病已成為影響世界養(yǎng)豬業(yè)

21、的典型細(xì)菌性疾病，危害日益嚴(yán)重，已經(jīng)在全球范圍影響著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，成為斷奶前后仔豬和保育豬頭號(hào)殺手，死亡率高達(dá)50一9，給養(yǎng)豬業(yè)帶來的危害與經(jīng)濟(jì)損失已不容忽視。國(guó)內(nèi)在北京、黑龍江、遼寧、河南、湖南、寧夏、湖北、江蘇、上海、安徽、廣西、浙江、江西、山東、福建等省市都均有發(fā)生，損失慘重【6】。本研究借助傳統(tǒng)方法和特異性高的PCR方法鑒定副豬嗜血桿菌病，為深入研究豬HPS感染的快速診斷及有效防治提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。3.5 由于豬副嗜血桿菌對(duì)抗生素的耐藥性問題，目前大多采用疫苗對(duì)豬副嗜血桿菌病進(jìn)行防制，然而，豬副嗜血桿菌的血清型較多，且不同血清型之間無交叉保護(hù)力，若不知當(dāng)?shù)亓餍械难逍投S便應(yīng)用商品化疫苗，豬副嗜血桿菌病就不能得到有效控制。目前已知的副豬嗜血桿菌至少可分為15 種血清型，還有20%以上的分離株無法定型【9-10】。而且HPS 具有明顯的地方性特征，不同地區(qū)流行的血