真菌檢測中常見問題專家解答

1、干貨】真菌檢測中常見問題專家解答近年來，隨著惡性腫瘤的高發(fā)、艾滋病的流行、化療藥 物、廣譜抗生素、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑等藥物的廣泛使 用，以及人工導(dǎo)管等侵入性操作、器官移植等有創(chuàng)診療技術(shù) 的應(yīng)用，由真菌所引起的感染日益成為臨床各科室面臨的巨 大挑戰(zhàn)。為了提高臨床診斷水平，加強(qiáng)真菌的檢驗(yàn)?zāi)芰︼@得 至關(guān)重要，現(xiàn)在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室有關(guān)真菌檢驗(yàn)的常見問題 匯總?cè)缦?，供大家學(xué)習(xí)參考。1、為什么培養(yǎng)要設(shè)定 35 C?實(shí)驗(yàn)室通常將孵箱溫度設(shè)定為35 C,是為了防止溫度的波動(dòng)對(duì)細(xì)菌或真菌生長的影響。臨床常見細(xì)菌的最適生長溫度為 3337C （嗜熱，嗜中溫菌除外，占少數(shù) ），設(shè)定為35C時(shí)上 下波動(dòng)2C對(duì)培養(yǎng)

2、無影響，如設(shè)定為37C C顯然就不合適了。 至于真菌培養(yǎng) ,要視標(biāo)本來源而定。 一般懷疑淺部真菌感染的 標(biāo)本如皮屑、甲屑、頭屑及毛發(fā)等分離培養(yǎng)于2628C。來源于人體深部組織的標(biāo)本如痰、胸腹水、血及骨髓深部膿腫 等,建議放35 C培養(yǎng)，是剛離體的標(biāo)本在 35 C更接近于人體溫 度,其次臨床最常見的白念珠菌在 35C能形成更為典型的偽 足樣菌落，這與血清出芽試驗(yàn)在 35C做是同樣的道理。同時(shí) 來源于35C初分離的光滑念珠菌具有更高的酶活性。懷疑溫度型雙相真菌感染或個(gè)別真菌需要較高溫度生長時(shí)則需要 兩種溫度同時(shí)培養(yǎng)。 還要注意培養(yǎng)環(huán)境的濕度 ,一般要求大于60%,如果培養(yǎng)箱的濕度不夠 ,最好在平板

3、附近放置盛有無菌 水的容器以保證濕度。 2、CO2 對(duì)真菌生長影響大嗎 ?真菌屬 于異養(yǎng)型微生物， 主要從有機(jī)化合物中獲得碳源 ,而自養(yǎng)型微 生物才需要從C02中獲得碳源，所以真菌一般不需要在二氧 化碳環(huán)境中培養(yǎng)，而且 CO2對(duì)真菌的生長和繁殖均不利，但 一定濃度可刺激孢子形成。3、在血培養(yǎng)中培養(yǎng)出真菌 2次，但是患兒沒有臨床表現(xiàn)， 而 且臨床也沒用抗真菌藥患兒就好了，是考慮污染嗎 ? 這種情況要判斷是否為污染菌，調(diào)查采血過程是否規(guī)、血瓶 轉(zhuǎn)運(yùn)過程是否符合要求、針孔是否適當(dāng)封口、轉(zhuǎn)運(yùn)箱是否受 到污染等眾多因素，最關(guān)鍵的還是患者的臨床表現(xiàn)，如沒有 真菌感染的癥狀，要么考慮污染，要么考慮定植（可能

4、性不大）。4、我們基層醫(yī)院實(shí)際工作中做陰道分泌物真菌培養(yǎng)， 生化鑒定幾乎做不了，很多直接報(bào)白念珠菌，這樣合適嗎？ 這樣做不合適。目前有些檢驗(yàn)科甚至分不清酵母菌和霉菌， 在陰道白帶、尿液和糞便中鏡檢發(fā)現(xiàn)念珠菌后報(bào)告為“找到 霉菌”。霉菌是指絲狀多細(xì)胞真菌；酵母菌是指單細(xì)胞形態(tài) 的真菌，二者不可混為一談。陰道中感染的酵母菌大多是白 念珠菌，但不排除其他酵母菌。克柔念珠菌對(duì)氟康唑和5-氟胞嘧啶天然耐藥，如果遇到類似存在天然耐藥的菌株，會(huì)影 響后續(xù)的治療。5、痰標(biāo)本中少量念珠菌需要在報(bào)告中體現(xiàn)嗎?還是不報(bào)告 ?標(biāo)本要求和檢驗(yàn)程序用要體現(xiàn)，臨床醫(yī)生會(huì)綜合考慮。雖然 白色念珠菌導(dǎo)致肺部真菌感染的概率很小，

5、遇到痰標(biāo)本真菌 培養(yǎng)中分離出該真菌，還是建議報(bào)告，臨床醫(yī)生結(jié)合影像學(xué) 結(jié)果綜合考慮。先進(jìn)性痰標(biāo)本直接涂片，標(biāo)本質(zhì)量合格的情 況下，見到真、假菌絲或大量孢子，痰培養(yǎng)有真菌生長，還 是要報(bào)給臨床醫(yī)生，臨床醫(yī)生會(huì)綜合考慮的。至于是否要做 藥敏，可和醫(yī)生溝通后決定。建議留樣本前5%打水漱口；清晨第一口痰； 連送 3d 結(jié)果是否一致。 最好和臨床醫(yī)生 溝通一下 ,或平時(shí)對(duì)醫(yī)生、 護(hù)士進(jìn)行標(biāo)本采集方法的培訓(xùn)。 報(bào) 告之前 ,結(jié)合痰涂片鏡檢結(jié)果 ,備注標(biāo)本質(zhì)量信息及污染可能 性。6、請(qǐng)問一下：前幾天遇到一個(gè)抽出的膿液標(biāo)本，打到血培 養(yǎng)中， 報(bào)陽后涂片顯示真菌孢子， 轉(zhuǎn)種后涂片， 形態(tài)上圓形， 墨汁染色陽性，

6、但是沒有莢膜，轉(zhuǎn)種科瑪嘉沒有顏色，后有 白色有點(diǎn)黃色，用某國產(chǎn)鑒定顯示近平滑，藥敏全耐。問題 是:這個(gè)結(jié)果可信不孑墨汁用的是普通汁有影響嗎 ？該 如何改進(jìn) ?墨汁染色是針對(duì)標(biāo)本中懷疑隱球菌屬的莢膜進(jìn)行 負(fù)染，特別是新生隱球菌才做的試驗(yàn)，對(duì)純培養(yǎng)的隱球菌屬 不可作為鑒定試驗(yàn)。 (1)將之前的膿液標(biāo)本做個(gè) 10%KOH 濕 片檢，尋找真菌孢子和真、假菌絲。(2)培養(yǎng)結(jié)果應(yīng)該是可信的，最好和臨床醫(yī)生溝通一下，看患者是否有癥狀。(3)對(duì)某國產(chǎn)品牌不熟悉 ,鑒定結(jié)果和藥敏結(jié)果不好判斷 (4)按照全國操作規(guī)程配制念珠菌的鑒定生化管，用原衛(wèi)生部質(zhì)控真菌鑒 定符合率還是很好的，可以考慮自配生化鑒定管，用質(zhì)控真

7、 菌進(jìn)行驗(yàn)證。 (5)對(duì)每批號(hào)的某國產(chǎn)鑒定管用質(zhì)控真菌進(jìn)行驗(yàn) 證 ,如果結(jié)果符合 ,應(yīng)該沒問題。 (6)最好參加原衛(wèi)生部微生物 質(zhì)控培訓(xùn)， 無論細(xì)菌、 酵母菌方面 ,都會(huì)幫助你提高業(yè)務(wù)水平 和驗(yàn)證你所用的試劑質(zhì)量。 (7)墨汁只要粗細(xì)均勻，顆粒越細(xì) 小越好，推薦素功墨汁，試劑公司也有印度墨汁可采購。7、臨床常見痰標(biāo)本初次檢出曲霉后 ,流程是怎么進(jìn)行下去的 ? (1)痰標(biāo)本初次培養(yǎng)出絲狀真菌菌落， 前提是痰標(biāo)本必須是新 鮮的或不能立即送檢應(yīng) 4C冰箱保存。流程是接受痰標(biāo)本t 鏡檢培養(yǎng)鑒定。在痰標(biāo)本合格的情況下，先做個(gè)10%KOH 濕片鏡檢 ,低倍鏡尋找真菌菌絲，是透明或暗色，是否有 45 度分枝

8、。如果痰標(biāo)本合格，又找到菌絲，聯(lián)系臨床，告訴醫(yī) 生有絲狀真菌生長，懷疑是 XXXX ，容易的直接報(bào)告臨床， 難的點(diǎn)種沙氏瓊脂平板或察氏瓊脂平板，再做進(jìn)步鑒定。 (2) 若標(biāo)本不合格或合格但標(biāo)本中未見菌絲，和臨床醫(yī)生溝通， 告知有真菌生長， 讓醫(yī)生綜合考慮。 鑒定正常進(jìn)行 ,并報(bào)告臨 床,備注不排除污染可能。&酵母菌同化試驗(yàn)為什么放 28 C而不是35C?同化試驗(yàn)和發(fā) 酵試驗(yàn)有何區(qū)別 ?為什么教科書上說凡能發(fā)酵某種糖， 一定能 同化該糖，同化某種糖則不一定發(fā)酵該糖 ?多數(shù)酵母菌體外最 適生長溫度為28-30 C,故其體外試驗(yàn)選用此溫度。通話和發(fā)酵分別指真菌的有氧呼吸和無氧酵解，前者將糖類

9、分解為 二氧化碳和水，后者將糖類分解為二氧化碳和酒精等。其代 首先進(jìn)行的是有氧呼吸獲得能量，再進(jìn)一步進(jìn)行無氧酵解， 這由細(xì)菌和真菌的相關(guān)酶類決定。酵母菌多數(shù)為專性需氧 菌，所以其試驗(yàn)設(shè)計(jì)多以糖同化試驗(yàn)為主。比如隱球酵母只 能進(jìn)行有氧呼吸，所以只能同化葡萄糖而不能發(fā)酵，而釀酒 酵母可將糧食發(fā)酵為酒，既發(fā)酵也同化葡萄糖。 9、鑒于目前真菌培養(yǎng)不是很規(guī)，如何選擇培養(yǎng)基、溫度、 報(bào)告時(shí)間和方式 ?請(qǐng)講述實(shí)驗(yàn)室的具體流程。 (1)培養(yǎng)基：沙氏葡萄糖瓊脂、馬鈴薯葡萄糖瓊脂、腦心浸膏 瓊脂等適宜真菌生長的培養(yǎng)基，臨床疑似酵母菌及酵母樣菌 感染，有條件實(shí)驗(yàn)室可平行接種顯色培養(yǎng)基，推薦采用螺口 管斜面培養(yǎng)法，標(biāo)

10、本處理后接種于培養(yǎng)基斜面中下部，真菌 絕大多數(shù)為需氧菌建議平行接種兩管。(2)培養(yǎng)條件及報(bào)告時(shí)間：深部真菌28 ± 1C培養(yǎng)714d，如懷疑雙相真菌感染， 應(yīng)同時(shí)在28 士 1C及35 士 1C培養(yǎng)。懷疑罕見真菌慢生長真 菌感染或臨床已用抗真菌藥物時(shí)，延長觀察時(shí)間至少培養(yǎng) 4 周。如CSF宜置28 C及35 C兩個(gè)溫度培養(yǎng)至少一周；痰 /尿 /糞一般35 C 48h即可，如未見絲狀真菌生長， 則延長培養(yǎng)時(shí) 間；組織標(biāo)本一般 30C, 24周。10、是否可以用科瑪嘉顯 色培養(yǎng)基作為真菌初代培養(yǎng)基 ？ 可作為初代培養(yǎng)基之一，建議另外接種沙氏培養(yǎng)基或酵母氮 培養(yǎng)基 (YPDA) ， SDA

11、 和 YPDA 一般是酵母樣菌的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng) 基。11、咽拭子真菌培養(yǎng)有意義嗎 ?咽拭子培養(yǎng)真菌意義不大， 存在定植除非患者有臨床表現(xiàn)。12、請(qǐng)問痰標(biāo)本念珠菌定植率那么高，痰涂片看到比較多的 孢子和假菌絲要怎么報(bào)告才比較合理 ?個(gè)人覺得還是要如實(shí)報(bào)告臨床醫(yī)生、并將標(biāo)本質(zhì)量是否合格 告知臨床醫(yī)生， 至于是否感染， 臨床醫(yī)生會(huì)根據(jù)影像學(xué)資料、 患者臨床表現(xiàn)等綜合考慮的。13、患者的手上有濕疹一樣的丘疹 ,懷疑真菌感染 ,請(qǐng)問怎么 樣采樣好 ?對(duì)于皮損類的標(biāo)本采集， 需要用 70%的酒精先將患處消毒處 理，再使用已消毒的不銹鋼刮刀或外科手術(shù)刀在皮損邊緣刮 取皮屑，裝在無菌容器送檢。14、我們用一次性手套

12、裝 SDA 平板可以嗎 ?一次性手套無論是 PV還是乳膠，都會(huì)產(chǎn)生相對(duì)低氧的環(huán)境， 而真菌是需氧菌會(huì)影響真菌的生長，不建議這樣操作?？梢?使用透氣性好的膠帶 (靜脈輸液固定針頭的 )封閉平板，注意 不要封太死。 15、用的墨汁在顯微鏡下不是均勻的黑色背景， 而是一些細(xì)小黑色顆粒，這是不是墨汁的質(zhì)量不好?還有 ,生物安全柜、超凈工作臺(tái)和通風(fēng)柜三者有什么區(qū)別 ?墨汁本身就 是一些細(xì)微小顆粒加入溶媒形成的，墨汁質(zhì)量的好壞在于顆 粒的大小和均一性。一般的墨汁檢測隱球菌應(yīng)該能觀察，它只是作為背景 ,莢膜不染色，為透明的，背景是黑色。生物安 全柜和超凈工作臺(tái)的區(qū)別在于風(fēng)吹的方向：生物安全柜的風(fēng) 向是先垂直

13、向下再向柜， 經(jīng)過循環(huán)通過 HEPA 過濾后再排出， 柜形成一個(gè)相對(duì)負(fù)壓的環(huán)境；超凈工作臺(tái)的風(fēng)向是先向下再 向外吹，保證柜的清潔無塵，通常用來配置平板和操作一些 簡單的分子克隆相關(guān)實(shí)驗(yàn)。通風(fēng)柜是通過風(fēng)機(jī)將柜的空氣排 到實(shí)驗(yàn)室外，通常用來配置有揮發(fā)性的化學(xué)品試劑，有害氣 體排向室外。 16、痰涂片中看到曲霉頭，有多大臨床意義?毛霉有沒有污染可能？或者是定值？在痰里一直檢查到青 霉菌 ,沒有意義嗎 ?如果痰標(biāo)本直接鏡檢發(fā)現(xiàn)曲霉頭，那就要 考慮是曲霉感染。培養(yǎng)可以確定是哪一種曲霉。毛霉存在污 染的可能性，空氣中也可以存在，但又因其高度的侵襲性， 報(bào)告需謹(jǐn)慎，定值的可能性很小，但操作中污染的情況還是

14、不少的。 若標(biāo)本合格， 濕片鏡檢有 90 度分枝及粗大、 不分隔 的菌絲，那就要考慮感染了，否則有污染可能，最好及時(shí)聯(lián) 系臨床醫(yī)生。青霉菌是一種條件致病真菌，如果痰中直接鏡 檢查到菌絲，培養(yǎng)陽性，還是考慮感染。 17、在經(jīng)驗(yàn)積累的 初期，如何得到足夠的菌株，用于練習(xí)各類染色、閱片呢 ? 有條件的話，最好到相關(guān)醫(yī)院真菌室進(jìn)修學(xué)習(xí)濕片鏡檢、真 菌鑒定，將保存的菌株分批轉(zhuǎn)種后，仔細(xì)研究其菌落顏色、 大小質(zhì)地等變化和鏡檢變化，并做好筆記。或參加醫(yī)學(xué)真菌 專業(yè)培訓(xùn)班進(jìn)行系統(tǒng)學(xué)習(xí)。 18、如何保存真菌菌株 ?最好的方 法就是真空干燥、低溫凍存。國際菌株保藏機(jī)構(gòu)都是這種方法。（1）將生長的斜面直接放在-10

15、 c冷凍，表皮癬菌和許多 接合菌綱菌種不可用此法保存。（2）蒸餾水保存法：將生長在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基上的成熟的菌落，刮取菌絲體、芽孢或 酵母細(xì)胞或利無菌蒸餾水沖洗斜面表面，再以吸管吸取放在 無菌小管中，密封阻止蒸發(fā)，置于室溫保存。（3）另一種方法為直接加無菌礦物油至霉菌生長的瓊脂斜面，至少可保存半 年以上。 （4）基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中加入 1 5%30%甘油，將新鮮 成熟菌落挑至其中，-80C保存。19、一般什么樣的患者我們 會(huì)重點(diǎn)去關(guān)注是否為真菌感染呢 ? 免疫缺陷病患者、器官移植患者、腫瘤患者、中性粒細(xì)胞減 少患者糖尿病患者及較長時(shí)間使用廣譜抗生素的患者。20、霉菌培養(yǎng)箱（28C）被污染后如何

16、處理？培養(yǎng)基放進(jìn)培養(yǎng)箱 后很快長污染菌，尤其門上的密封條上也長菌了，怎么辦 ? 斷電后， 甲醛熏蒸 ,5%苯酚（石炭酸）擦拭后停留 30min 后，清 水擦拭，打開通風(fēng) 24h 后再使用。21、 血培養(yǎng)中可能培養(yǎng)出哪些絲狀真菌?哪些是污染 ? 血培養(yǎng)陽性的絲狀真菌主要有組織胞漿菌、馬爾尼菲藍(lán)狀 菌、鐮刀菌、念珠菌、隱球菌、毛孢子菌、賽多孢，人眼球 組織 （研磨后打入血培養(yǎng)瓶 ）里曾培養(yǎng)出紫色擬青霉。腹水打 入血培養(yǎng)瓶培養(yǎng)出棕黑腐殖霉。文獻(xiàn)報(bào)告皮炎芽生菌、伊蒙 菌、球孢子菌都可以從血培養(yǎng)里培養(yǎng)出來。 煙曲霉是污染的 ,有報(bào)告土曲霉的心膜炎患者外周血培養(yǎng)出來土曲霉 I ClinMicrobiol.1998Nov;36(11):3347-51 。 22、呼吸科患者，男， 61歲，診斷支氣管肺炎，HI W陰性，在合格痰培養(yǎng)出馬爾尼 菲藍(lán)狀菌 3+，可以診斷嗎 ?有必要復(fù)檢嗎 ?他肝脾大嗎 ?是否有骨骼受累及 ?