大孔吸附樹脂對貫葉金絲桃中苯并二蒽酮類成分的富集

1、大孔吸附樹脂對貫葉金絲桃中苯并二蒽酮類成分的富集樊敏偉1，宋崎 1*，王冰1，宋英1，奚靜芳1，王建新2(1. 上海市中藥研究所，上海 201203；2復(fù)旦大學(xué)，上海 200032)摘要目的考察大孔吸附樹脂對貫葉金絲桃中苯并二蒽酮類成分的富集方法, 并確定工藝路線和吸附參數(shù)。方法本文以貫葉金絲桃中苯并二蒽酮類成分為考察指標，采用動態(tài)和靜態(tài)吸附試驗相結(jié)合來考察大孔吸附樹脂對貫葉金絲桃中苯并二蒽酮類成分的富集工藝。結(jié)果 本文得到穩(wěn)定可行的對貫葉金絲桃中苯并二蒽酮類成分富集的工藝路線和吸附參數(shù)。結(jié)論 該方法可為貫葉金絲桃中苯并二蒽酮類成分的大孔樹脂精制工藝的確定提供參考。關(guān)鍵詞 貫葉金絲桃；苯并二蒽

2、酮；大孔吸附樹脂；靜態(tài)吸附；動態(tài)吸附所屬專業(yè) 中藥與天然藥物（中藥與天然藥物資源的開發(fā)利用和可持續(xù)發(fā)展）Enrichment of Naphthodianthrones in Hypericum perforatum L. with Macroporous ResinFAN Min-wei 1，SONG Qi 1*，WANG Bing1，SONG Ying1，XI Jing-fang1，WANG Jian-xin2 (1.Shanghai Institute of Chinese Meteria Medica Shanghai 201203；2. Fudan University Shangh

3、ai 200032)Abstract Objective To study the enrichment of naphthodianthrones in Hypericum perforatum L. with macropotous resin , and define the refinement process and adsorption factor. Methods The refinement process and adsorption factor of the separation and purification of naphthodianthrones in Hyp

4、ericum perforatum L. with macroporous resin were compared by static and dynamic adsorbing experiments. And the content of naphthodianthrones was developed as its quality standard, screening out the best refinement process and adsorption factor. Results The refinement process and adsorption factor of

5、 the enrichment of naphthodianthrones in Hypericum perforatum L. with macroporous resin are stable and feasible .Conclusion The enrichment method can offer information about the determination of refinement process of Hypericum perforatum L. with macroporous resin.Key words Hypericum perforatum L.; n

6、aphthodianthrones; macropotous resin; static adsorption; dynamic adsorption貫葉金絲桃為藤黃科植物貫葉金絲桃Hypericum perforatum L. 的干燥地上部分。貫葉金絲桃的主要化學(xué)成分包括苯并二蒽酮類化合物, 如金絲桃素、偽金絲桃素、原金絲桃素、原偽金絲桃素等； 黃酮類化合物, 如蘆丁、金絲桃甙、槲皮素、異槲皮素、阿曼托黃素等；間苯三酚類化合物, 包括貫葉金絲桃素、加貫葉金絲桃素等；還含有揮發(fā)油類、香豆素類化合物等1-3。據(jù)文獻報道, 貫葉金絲桃中的抗抑郁活性成分主要有苯并二蒽酮類、黃酮類、間苯三酚類等。其中

7、，苯并二蒽酮類被普遍認為是抗抑郁作用較好的成分，國內(nèi)外對貫葉金絲桃提取物多以金絲桃素計的苯并二蒽酮類含量不低于0.3%作為質(zhì)量控制指標。本文采用大孔吸附樹脂來考察貫葉金絲桃中苯并二蒽酮類的吸附特性，從而進一步確定苯并二蒽酮類活性成分富集方法,得到較高純度的貫葉金絲桃有效部位。1儀器、試劑和材料HP6890氣相色譜儀，HP7694頂空進樣儀；島津UV-2401PC；金絲桃素對照品購自美國SIGMA公司；試劑均為分析純。大孔樹脂均為國產(chǎn)；貫葉金絲桃采購于陜西省漢中市。2實驗部分2.1苯并二蒽酮類的含量測方法2.1.1供試品和對照品的制備供試品溶液：取樣品約0.1g，精密稱定，至50ml棕色量瓶中，

8、加甲醇40ml，超聲處理（功率350W、頻率35KHz）40分鐘，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，過濾。精密量取續(xù)濾液2ml，置10ml棕色量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。對照品溶液：精密稱取五氧化二磷減壓干燥24h的金絲桃素對照品，加甲醇-吡啶(9:1)配制成每1ml含金絲桃素20g的溶液，置棕色量瓶中，作為對照品儲備液。2.1.2測定方法分別取供試品溶液和對照品溶液，以試劑作空白，照分光光度法（中國藥典2005年版一部附錄VB），在588nm波長處測定吸收度，計算，即得。2.1.3線性范圍的考察分別精密量取對照品儲備液1.0ml、2.0ml、4.0ml、6.0ml、8.0ml于10ml棕色量瓶中，加

9、甲醇-吡啶(9:1)稀釋至刻度，搖勻，照分光光度法 (中國藥典2005年版一部附錄VB)，在588nm波長處測定吸收度，以吸收度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。結(jié)果得到回歸方程：C=0.2939+23.53A ， r=0.9988。結(jié)果表明在1.98-19.8g/ml范圍內(nèi)苯并二蒽酮類濃度與吸收度有良好的線性關(guān)系。2.2大孔吸附樹脂有機殘留物檢查 照有機溶劑殘留量測定法（中國藥典2005年版二部附錄VIII P 第二法）測定。2.2.1色譜條件 用鍵合/交聯(lián)聚乙二醇毛細管色譜柱（30m0.25mm0.25m HP-INNOWAX Agilent公司）；柱溫50，進樣口及檢測器溫度分別為2

10、60及300；載氣為氮氣，流速：2.0ml/min；頂空取樣瓶加熱條件：120加熱15min。2.2.2供試品和對照品的制備供試品溶液的制備：取樣品約0.2g，精密稱定，置20ml頂空取樣瓶中，精密加入0.6%十二烷基硫酸鈉溶液5ml，搖勻，即得。對照品溶液的制備：精密稱取正己烷，苯，甲苯，對二甲苯，鄰二甲苯，苯乙烯和1,2-二乙基苯適量，加0.6%十二烷基硫酸鈉溶液配制成每1ml分別含15g，10g，12g，12g，13g，16g和13g的溶液，搖勻，精密量取5ml，置20ml頂空取樣瓶中，即得。2.2.3 測定法分別取對照品溶液和供試品溶液，在120加熱15min，依法測定，按外標法以峰面

11、積計算，即得。2.3 貫葉金絲桃提取液的制備取貫葉金絲桃藥材，加60%乙醇回流提取二次，每次1.5h，合并提取液，濾過，濾液減壓濃縮至1ml溶液約相當于1g藥材，離心，備用。2.4大孔樹脂的預(yù)處理以95%乙醇濕法裝柱, 以95%乙醇洗脫，不時檢測流出的乙醇，當流出的乙醇與水混合后不呈白色渾濁時即可，再以蒸餾水洗至無醇味。實際操作中，乙醇洗至柱體積的4倍時與水混合不渾濁，洗至6倍時，無樹脂味。2.5影響大孔樹脂靜態(tài)吸附的因素2.5.1樹脂型號的篩選選取6種經(jīng)預(yù)處理的濕態(tài)樹脂5g（ D-101、DA-101、DA-201、 DB-301、AB-8、LSA-20）置100ml 具塞錐形瓶中，取貫葉金

12、絲桃提取液加入瓶中，在25搖床中振蕩 24h，吸附達到平衡后，濾去樹脂，定量移取清液，測定含量，計算吸附率。結(jié)果，吸附率依次為72.13，73.08，60.12，61.78，65.51，80.35。本文根據(jù)吸附率結(jié)合樹脂成本綜合考慮，最終選擇LSA-20型大孔吸附樹脂。2.5.2吸附時間的考察取30g濕態(tài)LSA-20型大孔吸附樹脂，置于100ml具塞錐形瓶中，加入貫葉金絲桃提取液，在25搖床中振蕩 24h，取樣時間依次為1，2，4，6，8，10，24h。測定吸附率，考察吸附時間對靜態(tài)吸附的影響。結(jié)果為，結(jié)合吸附率和時間成本綜合考慮，最終選擇吸附時間為2h。2.6影響大孔樹脂動態(tài)吸附的因素2.6

13、.1洗脫溶劑的篩選精密吸取貫葉金絲桃提取液100ml(每ml含生藥1g)上柱, 依次用蒸餾水、20%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇梯度洗脫, 每瓶收集一個柱體積的洗脫液,依次按1，2，3編號，分別濃縮至干, 測定每份洗脫液中苯并二蒽酮量。以收集量瓶編號(X)為橫坐標，苯并二蒽酮量(Y)為縱坐標, 繪制洗脫曲線, 見圖1。 01234567891號2號3號4號5號6號7號8號9號10號11號12號13號14號15號16號17號18號19號20號21號22號23號24號25號26號編號苯并二蒽酮(mg)圖1 貫葉金絲桃大孔樹脂吸附苯并二蒽酮類梯度洗脫曲線圖15號：水洗脫；610號：20%

14、乙醇洗脫；1115號：50%乙醇洗脫；1622號：70%乙醇洗脫；2326號：95%乙醇洗脫結(jié)果顯示，50、70、95乙醇洗脫液中苯并二蒽酮量占總量的94%，說明苯并二蒽酮主要集中在50、70、95乙醇洗脫液中。而其中50乙醇洗脫液和70乙醇洗脫液中苯并二蒽酮量占總量的84%，95乙醇洗脫液中苯并二蒽酮量較少。70%乙醇的極性與50%乙醇接近，且小于50%乙醇，相對而言可洗脫下的水溶性雜質(zhì)也較少，可基本涵蓋50%乙醇洗脫液可洗脫的苯并二蒽酮量。因此，綜合考慮減少操作工序, 節(jié)約生產(chǎn)成本等因素，初步確定洗脫條件為先用蒸餾水、20乙醇洗去水溶性雜質(zhì)，再以70%乙醇洗脫，收集70乙醇洗脫部分。2.6

15、.2洗脫劑用量的確定 精密吸取貫葉金絲桃提取液100ml(每ml含生藥1g)上柱,。先用蒸餾水、20乙醇洗脫，再以70乙醇洗脫，每瓶收集一個柱體積的洗脫液,依次按1，2，3編號，分別濃縮至干, 測定每份洗脫液中苯并二蒽酮量。 以收集量瓶編號(X)為橫坐標，苯并二蒽酮量(Y)為縱坐標, 繪制洗脫曲線, 見圖2。圖2考察70%乙醇洗脫溶媒量對苯并二蒽酮類洗脫終點的判斷15：水洗脫；610：20% 乙醇洗脫；1119號：70%乙醇洗脫；圖2結(jié)果顯示，當以水洗脫4倍柱體積、20乙醇洗脫3倍柱體積時，洗脫曲線已近橫軸且所收集的洗脫液幾乎無色，因而確定除去雜質(zhì)的水用量為4倍柱體積，20乙醇用量為3倍柱體積

16、。采用70乙醇洗脫，洗脫至7倍柱體積時曲線已接近橫軸，且前7倍柱體積洗脫液中苯并二蒽酮量約占70乙醇總洗脫量的96以上，故確定洗脫溶媒為7倍柱體積的70乙醇。2.6.3影響大孔樹脂吸附性能因素的研究2.6.3.1大孔吸附樹脂的吸附性能的考察 大孔吸附樹脂的吸附性能與藥液濃縮比、上樣流速、柱徑高比等因素有關(guān)。本文采用L9(34)正交試驗篩選最佳的上柱工藝條件。正交設(shè)計的因素水平表見表1。表1L9（34）正交設(shè)計因素水平表 因素水平藥液濃縮比 A半徑：柱高比 B上樣流速 C11:0.51201BV/h2111102 BV/h312153 BV/h2.6.3.2 試驗方法及結(jié)果本正交試驗以70%乙醇

17、洗脫液中苯并二蒽酮量（以100g貫葉金絲桃藥材計）為考察指標，結(jié)果見表2。表2 正交試驗設(shè)計及結(jié)果試驗號藥液濃縮比(A)半徑：柱高比(B)上樣流速 (C)空白(D)苯并二蒽酮類量(10-2g)111114.86212224.47313333.32421236.49522314.98623124.29731324.82832134.22933213.2512.6516.1713.3713.0915.7613.6714.2113.5812.2910.8613.1214.034.225.394.464.365.254.564.744.534.03.624.374.68R1.151.770.370.3

18、2上述數(shù)據(jù)表明：在設(shè)置水平范圍內(nèi)，以苯并二蒽酮量為指標, 由于極差R的大小顯示影響因素的主次，所以其影響順序為BAC；綜合分析，B為主要因素，A次之。通過直觀分析，最優(yōu)組合應(yīng)為B1A2C2，即半徑：柱高比為1:20；藥液濃縮比為1:1；藥液上樣流速為2 BV/h。2.6.3.3方差分析由于藥液上樣流速C列與空白D列的R值相近，說明藥液上樣流速對結(jié)果的影響較小。因此本文采用正交設(shè)計助手II V3.1軟件，進而以C列和D列作為誤差項進行方差分析，結(jié)果見表3。表3 方差分析表方差來源離差平方和自由度F比F臨界值（=0.05）顯著性A2.43213.346.94B4.71225.856.94誤差0.3

19、64由方差分析結(jié)果可知，A列（藥液濃縮比）、B列（半徑柱高比 ）對洗脫結(jié)果有顯著性差異，C列（藥液上樣流速）無顯著性差異。綜合直觀分析和方差分析結(jié)果及生產(chǎn)實際，最終確定上柱工藝條件為半徑：柱高比為1:20；藥液濃縮比為1:1；藥液上樣流速為3 BV/h。2.7驗證試驗按照上述實驗條件，進行驗證試驗，測定70%乙醇洗脫液的浸膏得率，浸膏中苯并二蒽酮類含量和大孔樹脂有機殘留量，結(jié)果見表4。表4 驗證試驗結(jié)果實驗次數(shù)上樣量相當于生藥克數(shù)（g）70乙醇洗脫液所得浸膏重量（g）浸膏得率（）苯并二蒽酮類含量()苯并二蒽酮類轉(zhuǎn)移率()有機殘留物檢查（）1100038.33.831.4655.92甲苯：0.0

20、037其余未檢出2100033.33.331.5250.62甲苯：0.0013其余未檢出3100037.83.781.4855.94甲苯：0.0016其余未檢出上述數(shù)據(jù)可以看出，該條件穩(wěn)定可行。大孔樹脂殘留也符合藥品注冊的國際技術(shù)要求（質(zhì)量部分）（ICH指導(dǎo)委員會周海鈞主譯）。3討論3.1苯并二蒽酮類的含量測定方法主要參考美國草藥典4 , 樣品溶液經(jīng)波長掃描，其最大吸收值與對照品一致, 均為588nm，空白溶液經(jīng)掃描在588nm波長處無吸收。因此，選擇測定波長為588nm。3.2綜合上述實驗研究，大孔吸附樹脂對貫葉金絲桃中苯并二蒽酮類成分的分離純化工藝歸納如下：選用LSA-20型大孔吸附樹脂，上柱藥液濃縮比為1:1，柱高比為1:20，藥液上樣流速為3 BV/h，吸附時間為2h。先用4倍柱體積蒸餾水和3倍柱體積20乙醇洗脫棄去，再選用7 倍柱體積70乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓干燥，即得。本文“2.2 貫葉金絲桃提取液的制備”項下所用貫葉金絲桃藥材含苯并二蒽酮類約為0.10%，所制備的上柱藥液含苯并二蒽酮類約為0.26%。本文通過大孔吸附樹脂富集后，樣品中苯并二蒽酮類含量約達到1.48%,為藥材含量的14.8 倍和上柱藥液含量的5.7倍。通過驗證試驗說明該富集方法的工藝路線穩(wěn)定可行，吸附