低溫等離子體對銅綠假單胞桿菌的滅菌實(shí)驗(yàn)研究

1、低溫等離子體對銅綠假單胞桿菌的滅菌實(shí)驗(yàn)研究摘 要：目的 初步探討低溫等離子體對銅綠假單胞桿菌的滅殺作用及其滅菌機(jī)理。方法 采用 RF 形式的低溫等離子體，對遠(yuǎn)程等離子體反應(yīng)裝置中的銅綠假單胞桿菌(Pseudomonasaeruginosa )標(biāo)準(zhǔn)株 ATCC15442 進(jìn)行處理，研究其滅菌效果曲線,并利用掃描電鏡觀察其細(xì)胞壁、膜等外部結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果 低溫等離子體對銅綠假單胞桿菌有較強(qiáng)的殺滅作用，在反應(yīng)室的不同區(qū)域殺菌效果不同，且銅綠假單胞桿菌的細(xì)菌壁有明顯的破損。 結(jié)論 低溫等離子體可快速有效地殺滅銅綠假單胞桿菌,在消毒滅菌領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。且基于實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及實(shí)驗(yàn)所用等離子發(fā)生器的特殊結(jié)

2、構(gòu),可知其滅菌效果可能與等離子體反應(yīng)器中所產(chǎn)生的活性物種的分布特征和強(qiáng)度有關(guān)，其滅菌機(jī)制可能與微生物細(xì)胞壁、膜的破裂有關(guān)。關(guān)鍵字：低溫等離子體；滅菌；銅綠假單胞桿菌；機(jī)理中圖法分類號： R12； 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A銅綠假單胞桿菌又稱綠膿桿菌，為革蘭性陰性菌，是當(dāng)今條件致病菌的代表菌，當(dāng)機(jī)體免疫力低下時可引起多種感染。近年來銅綠假單胞桿菌對人的致病作用明顯增加,常常引發(fā)一系列嚴(yán)重的化膿性感染，是醫(yī)院內(nèi)感染的重要致病菌1。由于銅綠假單胞桿菌具有天然的和后天獲得的耐藥性, 對抗生素、消毒劑的耐性較強(qiáng)，因此國際上用傳統(tǒng)的滅菌消毒方法對其滅菌一直沒能取得良好的效果，因而本文嘗試采用低溫等離子體滅菌消毒技術(shù)

3、來對銅綠假單胞桿菌進(jìn)行滅菌效果及其機(jī)理的研究。等離子體消毒滅菌技術(shù)的出現(xiàn)被譽(yù)為消毒學(xué)領(lǐng)域的一大進(jìn)步，它克服了傳統(tǒng)消毒滅菌方法的一些局限和不足，具有傳統(tǒng)方法無法比擬的優(yōu)點(diǎn)。能夠同時具有安全、低溫、快速、無殘留毒性，廣泛適用的優(yōu)點(diǎn)，而且能在短時間、多種環(huán)境、持續(xù)有效、廣譜地滅菌 2-4，實(shí)現(xiàn)滅菌技術(shù)的“綠色化”，所以又被稱為 21 世紀(jì)世界環(huán)境科學(xué)的 4 大關(guān)鍵技術(shù)之一。等離子體( Plasma)是一種低密度的電離氣體云，是游離于固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)以外的一種新的物態(tài)體系，也就是物質(zhì)第 4 態(tài)。主要由電子、離子、原子、分子、活性自由基及射線等各種活性物種組成。因其中的正電荷總數(shù)和負(fù)電荷總數(shù)在數(shù)值上總是

4、相等的,故稱其為等離子體。等離子體的產(chǎn)生可以說是一個非常復(fù)雜的物理和電化學(xué)過程，其中包含了電子交換、電子能量轉(zhuǎn)換、分子碰撞、化學(xué)解離 和重組。本文通過低溫等離子體對銅綠假單胞桿菌的滅菌實(shí)驗(yàn)可知低溫等離子體對銅綠假單胞桿菌有較強(qiáng)的殺滅作用，其滅菌效果可達(dá)到 99.9%以上，成功地解決了如何能夠即有效又安全地殺滅銅綠假單胞桿菌這個一直困擾國際醫(yī)學(xué)界的難題。一直以來，低溫等離子體滅菌技術(shù)的機(jī)理研究處于零星、分散的階段，理論研究十分薄弱，主要原因是等離子體化學(xué)的基元反應(yīng)十分復(fù)雜, 氣相等離子體活性物種難以分離。殺菌機(jī)理的研究均是針對等離子體活性物種混存狀態(tài)下實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，未見有效分離活性物種的方法學(xué)

5、研究，只是以混存活性物種的表觀反應(yīng)結(jié)果為依據(jù)作出的推測，各自活性物種對滅菌的作用和貢獻(xiàn)份額不清楚，所以迄今為止尚未能建立起具有普遍說服力的滅菌機(jī)理。本文通過本教研室自行設(shè)計的實(shí)驗(yàn)裝置遠(yuǎn)程等離子體反應(yīng)器，通過劃分放電區(qū)、邊緣區(qū)和遠(yuǎn)程區(qū)，實(shí)現(xiàn)了活性物種有效分離的氛圍，解決活性物種有效分離的關(guān)鍵問題，進(jìn)而也可以闡明了等離子體中各活性物種對微生物殺滅的作用和貢獻(xiàn)份額，揭示等離子體滅菌的機(jī)理。1. 滅菌實(shí)驗(yàn)1.1 實(shí)驗(yàn)裝置遠(yuǎn)程等離子體反應(yīng)器本實(shí)驗(yàn)所用的實(shí)驗(yàn)裝置（本教研室設(shè)計）是能使等離子體活性物種有效分離的遠(yuǎn)程等離子體反應(yīng)器。圖 1 為該遠(yuǎn)程等離子體反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)示意圖。等離子體中的電子、離子是具有電性的

6、高動能、瞬間存在的活性粒子，而自由基是電中性的長壽命氣態(tài)物質(zhì)，后者的存活期比前者長 1026 倍，依據(jù)壽命的差異，可以在下游一定距離處獲得電子、離子與自由基分離的狀態(tài)，因此獲得活性物種有效分離的空間位放電區(qū) 5、邊緣區(qū) 6 和遠(yuǎn)程區(qū) 8。在放電區(qū) 5，活性粒子（電子、離子、自由基）具有很高的濃度；隨距等離子體源距離的增加，電子、離子的濃度迅速衰減，在距等離子體發(fā)生源一定距離處即遠(yuǎn)程區(qū) 8 獲得了較純的相對高濃度自由基。遠(yuǎn)程等離子體反應(yīng)裝置的核心是放電系統(tǒng)、真空系統(tǒng)和反應(yīng)系統(tǒng)。放電系統(tǒng)選擇國際研究主用的射頻放電（RF）形式，放電參數(shù)在一定范圍均可調(diào)。真空系統(tǒng)的本底氣壓可達(dá) 10-4Pa，用于清腔

7、，消除干擾雜質(zhì)；滅菌氣壓在 10100Pa 即可，既可快速又有利于充分發(fā)揮等離子體介質(zhì)（滅菌劑）的殺滅作用。為獲得活性物種有效分離的空間位，反應(yīng)系統(tǒng)設(shè)置了具有放電區(qū) 5、邊緣區(qū) 6 和遠(yuǎn)程區(qū) 8 的“分區(qū)”管式反應(yīng)段，該管段接近理想管式反應(yīng)器，能形成穩(wěn)流無返混的流場，而反應(yīng)管段放電區(qū)使用折流擋板，利用慣性碰撞的原理，加速高能粒子（電子、離子）的湮滅，強(qiáng)化在遠(yuǎn)程區(qū) 8 獲得自由基反應(yīng)氛圍。也保證活性物種的分離效果。1.2 實(shí)驗(yàn)菌種和染菌樣片載體銅綠假單胞桿菌 ATCC15442，購于陜西省微生物研究所，于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面中培養(yǎng)。聚對苯二甲酸乙二醇酯（polyethylene terephtha

8、late ，PET），別名滌綸樹脂，線型聚酯。外國商品名是 Dacron, Tetoron, Terylene, Lavsan。醫(yī)用高分子材料。1.3 放電氣體氧氣，氬氣，空氣（78%氮?dú)猓?2%氧氣混合氣體），純度均為 99.9%。1.4 細(xì)菌懸液的制備將銅綠假單胞桿菌 ATCC15442 作增菌培養(yǎng)6-8，再用接種環(huán)取增菌培養(yǎng)物劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板。挑取典型單菌落,接種斜面 37 培養(yǎng)過夜。然后用 5 ml 無菌移液槍吸取 5ml PBS（已滅菌）加入到斜面試管內(nèi)，反復(fù)吹吸，洗下菌苔。將菌懸液移至另一無菌試管中，保存在 4 冰箱內(nèi)備用，當(dāng)天制備當(dāng)天使用。1.5 菌涂片的制備將大小為

9、 25 mm 50 mmPET 薄膜，依次放入丙酮和乙醇及二次蒸餾水中分別超聲洗滌 10 min 以除去表面的油污及雜質(zhì)，然后自然晾干，用牛皮紙包裝好后經(jīng)壓力蒸汽滅菌（0.1Mpa，20 min）后備用。吸取 10 l 上述菌懸液均勻涂布于處理過的 PET 薄膜上，于 37 恒溫箱內(nèi)干燥。1.6 等離子體處理在遠(yuǎn)程等離子體場中，為了獲得活性物種有效分離的空間位，將反應(yīng)室分為三個不同的區(qū)域即放電區(qū)(040 cm)、邊緣區(qū)(4060 cm)和遠(yuǎn)程區(qū)(6080cm)，并將菌涂片分別置于 0cm，15 cm，30 cm，45 cm，55 cm，60 cm 和 75cm 七個不同的位置，進(jìn)行不同時間 1

10、0 s，15 s，30 s，60 s，90 s 和 120 s下的處理。具體技術(shù)參數(shù):氧氣（O2），作用功率（P）35 W，氣體流量（Q）20cm3/min；氬氣(Ar)，作用功率（P）15 W，氣體流量（Q）20 cm3/min；空氣，作用功率（P）60 W，氣體流量（Q）30 cm3/min。1.7 活菌培養(yǎng)計數(shù)將等離子體處理后的涂有銅綠假單胞桿菌的 PET 薄膜放入含有 10 ml PBS溶液的試管中，超聲波振蕩 10 min 后將菌洗下成為菌懸液，將該菌懸液進(jìn)行系列稀釋,選擇適宜稀釋度吸取 0.1 ml 加于無菌平皿內(nèi)。每一稀釋度接種 3 個平皿。采用涂布法，于 37 恒溫培養(yǎng) 24

11、h，進(jìn)行活菌計數(shù)。1.8 滅菌效果測試等離子體各處理參數(shù)對銅綠假單胞桿菌的殺菌作用指標(biāo)采用殺菌效果（GermicidalEffect，簡稱 GE）來表征，按下式計算 GE = log N0 ?log Nt 式中，N0 為實(shí)驗(yàn)前或陽性對照組樣品生長菌落數(shù)(cfu)；Nt 為實(shí)驗(yàn)組生長菌落數(shù)(cfu)。在前面的滅菌效果實(shí)驗(yàn)中，記錄的平皿菌落數(shù)需乘以稀釋倍數(shù)，換算成每毫升活菌數(shù)，按菌落數(shù)適宜（30300 個/板）的同一稀釋度求取 23 個平板間的菌落平均值，并對平行實(shí)驗(yàn)中的兩組數(shù)據(jù)取平均值方能帶入上式。此外，要求陰性對照組無菌生長，用此來證明所用試液和培養(yǎng)基無污染，否則實(shí)驗(yàn)結(jié)論需重新驗(yàn)證。2. 結(jié)果

12、與討論2.1 等離子體對銅綠假單胞桿菌的滅菌效果等離子體對銅綠假單胞桿菌有較強(qiáng)的殺滅作用。從圖 24 可看出不同的氣體等離子體對銅綠假單胞桿菌有著不同的殺滅作用，其中氧氣的效果最好，空氣次之，氬氣較差。但它們有著相似的變化趨勢，都是隨著時間的增長，銅綠假單胞桿菌的去除效果越好。在放電區(qū)處，氣體等離子體對銅綠假單胞桿菌的滅菌率最好，可達(dá)到99.9%以上。這主要是因?yàn)樵诜烹妳^(qū)的各種活性粒子濃度都很高，因此對銅綠假單胞桿菌的刻蝕作用也很大。通過刻蝕，這些高能粒子的擊穿作用及高能自由基團(tuán)的氧化作用使得銅綠假單胞桿菌被逐個原子地侵蝕，導(dǎo)致銅綠假單胞桿菌結(jié)構(gòu)破損以及生命物質(zhì)的變性凝固而達(dá)到滅菌效果。同時此

13、處紫外線強(qiáng)度也較大，刻蝕機(jī)理因紫外光子作用而增強(qiáng)從而加速了銅綠假單胞桿菌的殺滅，造成銅綠假單胞桿菌的大部分死亡。而在遠(yuǎn)程區(qū)，雖然它的滅菌效果比之其它區(qū)域較差，但是也直接反映了活性自由基通過原子反應(yīng)對銅綠假單胞桿菌的侵蝕作用，說明了活性自由基對殺滅銅綠假單胞桿菌的貢獻(xiàn)份額。在處理時間為 90 s 時，氧氣等離子體對銅綠假單胞桿菌的滅菌效果可達(dá)3.02，空氣和氬氣對銅綠假單胞桿菌的滅菌效果也可分別達(dá)到 2.82 和 2.56。從 90 s 之后，滅菌效果趨于穩(wěn)定，主要是因?yàn)樵?90 s 時間內(nèi)幾乎所有的物理化學(xué)反應(yīng)已完成，大部分的銅綠假單胞桿菌已被殺滅。2.2 掃描電鏡分析圖 5 為空氣等離子體處

14、理前后銅綠假單胞桿菌的掃描電鏡圖。通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞桿菌細(xì)胞壁在等離子體作用下結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，銅綠假單胞桿菌的細(xì)胞壁、膜在等離子體的處理下明顯破裂。（a）為銅綠假單胞桿菌的完整形態(tài)圖，（b）、（c）、（d）分別為空氣等離子體在放電區(qū)、邊緣區(qū)和遠(yuǎn)程區(qū)處理 90 s 的菌體形態(tài)圖。從圖中我們可以看出，在放電區(qū)的銅綠假單胞桿菌細(xì)胞壁破裂最厲害，邊緣區(qū)次之，遠(yuǎn)程區(qū)的細(xì)胞破裂程度比較差。主要原因是在放電區(qū)來自于等離子體中的各種活性粒子（電子、離子、自由基）濃度比較高，對銅綠假單胞桿菌細(xì)胞的刻蝕作用比較大，進(jìn)而造成的細(xì)胞壁破裂最厲害；而在遠(yuǎn)程區(qū)只有自由基作用于細(xì)胞，所以對細(xì)胞壁的破裂作用相對也比

15、較微弱。3. 結(jié)論通過銅綠假單胞桿菌的滅菌效果實(shí)驗(yàn)可知，低溫等離子體可快速有效地殺滅銅綠假單胞桿菌。且基于實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及實(shí)驗(yàn)所用等離子發(fā)生器的特殊結(jié)構(gòu),可知其滅菌效果可能與等離子體反應(yīng)器中所產(chǎn)生的活性物種的分布特征和強(qiáng)度有關(guān)， 在各種活性粒子（電子、離子、自由基）存在且濃度較高的放電區(qū)，殺滅效果較好，這將在消毒滅菌領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景通過掃描電鏡結(jié)果可知，銅綠假單胞桿菌細(xì)胞壁的破滅驗(yàn)證了前人所說的革蘭氏陰性菌的胞膜破裂說，微生物細(xì)胞壁、膜的破裂可能為其滅菌機(jī)制。而且本文發(fā)現(xiàn)由于放電區(qū)、邊緣區(qū)和遠(yuǎn)程區(qū)這三個區(qū)域活性物種的分布特征和強(qiáng)度不同，對細(xì)胞膜的破壞程度也不同，所以我們從掃描電鏡圖可看出在這三個區(qū)域銅綠假單胞桿菌細(xì)胞壁、膜的破裂程度也不一樣。銅綠假單胞桿菌廣泛分布于自然界,尤其是醫(yī)院內(nèi)環(huán)境之中。是醫(yī)院感染中最常分離的細(xì)菌繁殖體的代表,也是預(yù)防醫(yī)院內(nèi)感染的重點(diǎn)監(jiān)控菌種。等離子體快速、安全