基因工程的主要技術(shù)原理

1、第一章 基因工程的主要技術(shù)原理第一節(jié) DNA的提取與純化由于提取DNA的目的、種類、所用的生物、組織材料、實(shí)驗(yàn)條件等不同，DNA的提純有很多方法。其中最常用的是堿抽提法。 一、質(zhì)粒DNA的提取 1 .堿抽提法提取質(zhì)粒DNA （1）原理 閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA，在變性后不會(huì)分離，復(fù)性快； 染色體線性DNA和或有缺口的質(zhì)粒DNA變性后雙鏈分離，難以復(fù)性而形成纏繞的結(jié)構(gòu)，與蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物結(jié)合在一起，在離心的時(shí)候沉淀下去。 （2） 所用的試劑作用 溶菌酶 能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的b-1，4糖苷鍵。 在堿性條件（pH>8）下有活性。 葡萄糖 增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA

2、受機(jī)械力（震蕩）的作用而降解。 EDTA Mg2+、Ca 2+的螯合劑，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。 NaOH-SDS NaOH：強(qiáng)堿，提供pH>12的堿性條件，使DNA雙鏈變性。 SDS: 溶解細(xì)胞膜蛋白和細(xì)胞內(nèi)蛋白，并結(jié)合成“蛋白SDS”復(fù)合物，使蛋白質(zhì)（包括DNA酶）變性沉淀。 NaAc-HAc緩沖液 冰醋酸把醋酸鈉溶液的pH調(diào)到4.8。 用來中和NaOH變性液，使DNA復(fù)性。 高濃度的NaAc有利于變性的大分子（蛋白質(zhì)、DNA、RNA等）沉淀。 乙醇 用于沉淀DNA。 DNA分子以水合狀態(tài)“溶于”水里，乙醇能奪去DNA分子的水環(huán)境。 RNase A 降解RNA渣滓。

3、 以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。 TE緩沖液 DNA保存液。 由Tris-HCl和EDTA配制。 Tris-HCl不含金屬離子（不同于磷酸緩沖液或硼酸緩沖液），有利于以后操作； EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。 酚-氯仿 選用蛋白變性劑，進(jìn)一步抽提DNA溶液中的蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)沉淀。 但苯酚會(huì)殘留在DNA溶液中。 （現(xiàn)多用各種商品化的層析柱純化DNA)。 （3）堿抽提法提取質(zhì)粒DNA的步驟 第一步：溶菌 使用“溶液”溶解細(xì)菌細(xì)胞壁。 Solution I 的配制： 50mM葡萄糖， 25mM Tris-HCl(pH8.0)， 10mM EDTA， 4-5mg/ml溶菌酶，

4、RNase A 第二步：破膜，蛋白質(zhì)和DNA變性 溶液II 破壞細(xì)胞膜，蛋白質(zhì)和DNA變性。 Solution II 的配制： 0.2N NaOH，1.0%SDS 第三步：中和 溶液III使DNA復(fù)性、并促使蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物和染色體DNA、RNA沉淀。 Solution III的配制： 3M 醋酸鈉（用冰醋酸調(diào)pH至4.8） 二、基因組或其他DNA的提取 1.細(xì)菌基因組DNA的制備 一般過程及原理： （1）細(xì)胞裂解 10%SDS和蛋白酶K。37 oC溫育。 不用NaOH ! （2）DNA純化 CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)除去多糖，酚-氯仿-異戊醇除去蛋白質(zhì)。 （3）沉淀DNA 0.6倍

5、體積的異丙醇。 2. 哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA的抽提 一般過程及原理：（1）組織粉碎 動(dòng)物組織剪成小塊，置液氮中凍結(jié)后研磨成細(xì)粉末。組織培養(yǎng)的細(xì)胞用胰酶消化松散后直接使用。 （2）細(xì)胞裂解 0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50 oC溫育。 SDS是離子型去垢劑（detergent），可以使細(xì)胞膜崩解。 （3）純化DNA 用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白質(zhì)污染。 （4）沉淀DNA 用2倍體積的無水乙醇。 （可以加入1/10體積的3M醋酸氨輔助沉淀） （5）除去RNA污染 3. 從植物組織中制備 DNA 一般過程及原理： （1）組織粉碎 用液氮冷凍后研磨成細(xì)粉末。 （2）細(xì)胞裂解 用2%CT

6、AB/2-ME (十六烷基三甲基溴化銨/2巰基乙醇）。 或1% SDS和蛋白酶K。 用RNase。 （3）純化DNA 用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白質(zhì)污染。 （4）沉淀DNA 用0.6倍體積的異丙醇（-20 oC）（可以加入1/10體積的3M醋酸氨輔助沉淀） （5）除去RNA污染 用RNase A三、DNA的定量和純度測定 1. 紫外光譜法 原理： Ø DNA（或 RNA）在260nm波長處有特異的紫外吸收峰，1 OD的光密度相當(dāng)于雙鏈DNA濃度為50g/mL。Ø 蛋白質(zhì)在280nm處有吸收峰Ø 取3ml去離子水，加入比色皿，再加10ul的質(zhì)粒，用1ml的移液槍充分

7、混勻。用比色杯在紫外分光光度計(jì)直接測定。 1、根據(jù)OD值計(jì)算DNA濃度（g/mL ）dSDNA=50×（OD260-OD310）×稀釋倍數(shù) 其中260nm讀數(shù)用來估算樣品中核酸濃度，310nm為背景吸收值。 2、根據(jù)OD值計(jì)算DNA純度 純DNA樣品的OD260/OD280 大約為1.8，若OD260/OD280介于 1.7 1.9 之間，說明質(zhì)粒質(zhì)量較好， 1.8 為最佳；低于 1.8 說明有蛋白質(zhì)污染，大于 1.8 說明有 RNA 污染。2. 瓊脂糖凝膠電泳估計(jì) 原理： 溴化乙錠（EB）能插入DNA分子中，紫外光照射下能發(fā) 紅色熒光與已知濃度的DNA電泳帶熒光強(qiáng)度對(duì)比，

8、就可以估計(jì)出DNA含量四、DNA分子量的估計(jì) 一般使用瓊脂糖凝膠電泳，與已知分子量的DNA標(biāo)準(zhǔn)混合液對(duì)比得知DNA分子量Marker有許多公司的商品，使用非常方便。如lDNA的Hind酶切物等第二節(jié) DNA的凝膠電泳一、電泳的基本原理 1. 帶電荷的分子在電場中會(huì)以一定的速率向與其電荷性質(zhì)相反的電極移動(dòng)，速度稱為電泳遷移率。 2. 電泳遷移率同電場的強(qiáng)度和分子本身所帶的凈電荷數(shù)目成正比。 3. 電泳遷移率同分子與介質(zhì)的摩擦系數(shù)成反比。 4. 摩擦系數(shù)主要與分子的大小、形狀以及介質(zhì)的粘度有關(guān)。 5. 如果電場強(qiáng)度一定（電壓和電極距離）、電泳介質(zhì)相同（電泳液和凝膠）： 分子在電場中遷移的速度主要取

9、決于分子本身的大小和形狀。 形狀相似的分子的遷移速度主要與分子量相關(guān): 分子量越大，移動(dòng)越慢。 相同分子量的DNA: 二 、瓊脂糖凝膠電泳 1. 瓊脂糖 是一種線性多糖聚合物，從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取而來。 2. 瓊脂糖凝膠 瓊脂糖在水里（或電泳液）中加熱到沸點(diǎn)后溶解，冷卻后又凝固成均勻的的膠體“胨”瓊脂糖的濃度決定凝膠的空隙（密度）。 濃度高>空隙小 3.瓊脂糖凝膠的分辨力 空隙大小決定其分辨分子大小的能力 空隙小，分辨率高： 小分子較易通過，而大分子難通過； 空隙大，分辨率低： 大小分子幾乎以同等速率通過。 瓊脂糖的濃度（%） 分離DNA的片斷大小（bp） 0.3 0.7 1.4 500001000 200001000 6000300 三 、聚丙烯酰胺凝膠電泳 優(yōu)點(diǎn)是比瓊脂糖凝膠的分辨率高的多瓊脂糖凝膠電泳：100050000bp 聚丙烯酰胺凝膠電泳：11000bp 四、凝膠染色 1. 染料 溴化乙錠 Ethidium bromide （EB） 2. 原理 EB是扁平分子，能插入DNA堿基之間，但不與瓊脂糖結(jié)合。 EB在300nm紫外光照射下能發(fā)紅色熒光，即可顯示DNA泳帶在凝膠中所處的位置。 熒光強(qiáng)度與DNA含量及大小成正比。 第三節(jié) 核酸的分子雜交DNA-DNA或DNA-RNA鏈雜交。用放射性同位素（32P或125I）標(biāo)記的DNA或RNA探針。 一