酵素連結(jié)免疫吸附法

1、ELISA( enzyme-linked immunosorbent assay )酵素連結(jié)免疫吸附法自然界有許多專(zhuān)一性的配對(duì)分子，例如：兩股 DNA 分子間的鹼基配對(duì)、酵素與其基質(zhì)間的結(jié)合與催化、各種荷爾蒙與其受體、抗原與其抗體的結(jié)合等。其中，抗原與抗體的專(zhuān)一性配對(duì)，可用人為的設(shè)計(jì)與免疫操作，在實(shí)驗(yàn)室中取得專(zhuān)一性的抗體；這是目前極少數(shù)可用人工產(chǎn)生專(zhuān)一性分子探針的方法之一。抗體與抗原之間的高度專(zhuān)一性，一直吸引著研究學(xué)者的注意力；對(duì)於抗原抗體間的專(zhuān)一結(jié)合關(guān)係，免疫學(xué)家自百年前已從免疫沈澱法清楚觀察，後來(lái)又發(fā)展出 雙向免疫擴(kuò)散 (double diffusion)，以及 酵素免疫分析法 (enzy

2、me-linked immunosorbent assay, ELISA)，成為免疫化學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)工具。這些免疫工具與方法，到現(xiàn)在都還應(yīng)用在基礎(chǔ)研究，或產(chǎn)業(yè)界的各種檢驗(yàn)及醫(yī)療用途上。ELISA是在1971年首次由Engvall和Perlman所介紹。不論是測(cè)抗原或抗體都有很高的敏感性及專(zhuān)一性，且使用設(shè)備相較之下少了許多。固相吸附準(zhǔn)許unbound reagents快速且完全地清洗。是一種安全又穩(wěn)定的方法。酵素連結(jié)免疫分析法已日益普及，因?yàn)榉浅ｌ`敏且不必如免疫螢光術(shù)和放射免疫分析法需要特殊設(shè)備。此法的原理是以一種酵素連結(jié)到抗原或抗體上，用酵素活性來(lái)做為定量標(biāo)記。有許多方法已經(jīng)架構(gòu)完成，視使用的酵素性

3、質(zhì)及待測(cè)的抗原-抗體系統(tǒng)而定。其中廣泛使用的便是酵素連結(jié)免疫吸附分（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA），可以測(cè)定抗原或抗體。酵素連結(jié)免疫吸附法( enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA )的原理是依據(jù)螢光抗體方法發(fā)展出來(lái)的，它是將酵素連接到抗原或抗體分子上來(lái)偵測(cè)抗原抗體反應(yīng)，最後加上酵素的受質(zhì)，依其呈色強(qiáng)弱來(lái)表示。ELISA可以用來(lái)測(cè)抗原或抗體的量，例如要測(cè)定抗體，則將抗原連接到一固定物上，先加檢體後，再加酵素連接的免疫球蛋白，如此測(cè)得之酵素活性即代表抗體量之高低。脊椎動(dòng)物對(duì)外來(lái)的異物會(huì)產(chǎn)生抗體來(lái)清除之，

4、這些外來(lái)異物稱(chēng)為抗原，包括細(xì)菌或者各種巨大分子；尤其蛋白質(zhì)是相當(dāng)強(qiáng)的抗原，很容易誘生出專(zhuān)一性抗體。 但一個(gè)抗體分子只與蛋白質(zhì)分子上的一小段胺基酸鏈結(jié)合，大約在六到十來(lái)個(gè)胺基酸長(zhǎng)度，這一小段蛋白稱(chēng) 抗原決定基 (antigenic determinant 或 epitope)。因此，一個(gè)分子量較大的蛋白質(zhì)，可能有數(shù)個(gè)抗原決定基，可以誘生數(shù)種不同的抗體分子，稱(chēng)為多價(jià)抗原 (multivalent antigen)。而在生物體內(nèi)，是由一種稱(chēng)為 B 細(xì)胞的白血球負(fù)責(zé)抗體的合成；但是每一個(gè) B 細(xì)胞只能產(chǎn)生一種抗體，對(duì)抗一種抗原決定基。若有一個(gè)多價(jià)抗原分子，可被宿主生物辨認(rèn)出四個(gè)抗原決定基，則此宿主至少

5、會(huì)產(chǎn)生四種 B 細(xì)胞，產(chǎn)生四種不同的抗體，分別對(duì)抗這四個(gè)抗原決定基。已知每一種 B 細(xì)胞都只能生產(chǎn)一種抗體，因此若能夠挑出所要的 B 細(xì)胞，大量培養(yǎng)後令其產(chǎn)生均質(zhì)的抗體，就能達(dá)成上述目的。 而這種抗體因?yàn)槭怯蓡我恢?B 細(xì)胞所生產(chǎn)，也只含有一種抗體，稱(chēng)之為 單株抗體 (monoclonal antibody, mAb)。此關(guān)鍵技術(shù)是 1980 年代，單株抗體與傳統(tǒng)抗血清在應(yīng)用上，有些不一樣的地方：(1) 單株抗體是由已經(jīng)建立的融合瘤細(xì)胞所生產(chǎn)，因此只要細(xì)胞株存在，就可以一直生產(chǎn)該抗體，可以視為一種固定的試劑，不像靠動(dòng)物生產(chǎn)的傳統(tǒng)抗血清，隨著動(dòng)物個(gè)體不同會(huì)有變化；(2) 單株抗體因?yàn)橹缓幸环N抗

6、體，無(wú)法像傳統(tǒng)血清一樣，與抗原產(chǎn)生免疫沈澱，因此雙向免疫擴(kuò)散也無(wú)法產(chǎn)生沈澱線；(3) 基於同樣的理由，加上單株抗體與抗原的結(jié)合部位通常只有一處，因此整體的結(jié)合力量可能不如傳統(tǒng)抗血清；(4) 但是單株抗體的專(zhuān)一性較好，且可控制所要對(duì)抗的抗原決定基位置。近年來(lái)也因此流行一種方法，先選擇目標(biāo)蛋白質(zhì)上具有較強(qiáng)抗原性的一個(gè)片段，大約有十到二十個(gè)胺基酸的長(zhǎng)度，再以人工方法合成出這條勝汰後，接到無(wú)關(guān)的巨分子蛋白質(zhì) carrier，然後免疫動(dòng)物產(chǎn)生傳統(tǒng)的抗血清。這種抗血清因?yàn)橹粫?huì)對(duì)抗一段很短的蛋白質(zhì)片段，有點(diǎn)類(lèi)似單株抗體對(duì)抗抗原決定基的高度專(zhuān)一性，特稱(chēng)之為 單專(zhuān)一性抗體 (monospecific Ab)。另

7、外，當(dāng)基因操作技術(shù)發(fā)達(dá)之後，發(fā)展出 噬菌體表現(xiàn) (phage display) 的方法，期以取代傳統(tǒng)的細(xì)胞融合方法，以便得到類(lèi)似單株抗體的專(zhuān)一性探針。這是利用噬菌體的外殼蛋白基因?yàn)榧軜?gòu)，插入抗體基因上與抗原結(jié)合區(qū)的部份 (variable regions 或 domains)，然後利用基因洗牌方式任意修改這段基因，建立一個(gè)噬菌體基因庫(kù)並由其中篩選，找出可以表現(xiàn)對(duì)抗原具有高專(zhuān)一性結(jié)合的噬菌體。這種方法相當(dāng)吸引人，因?yàn)榭捎萌藶榈姆椒ㄟ_(dá)成在細(xì)胞內(nèi)所進(jìn)行的免疫確認(rèn)反應(yīng)，同時(shí)若篩得此一噬菌體，可馬上取出這段具有高專(zhuān)一性結(jié)合的基因，經(jīng)修飾之後應(yīng)用為人體的免疫治療試劑。酵素連結(jié)免疫吸附法( enzyme-l

8、inked immunosorbent assay, ELISA )和放射線免疫分析法( radioimmunoassay, RIA )是依照相同的原理直接測(cè)定所結(jié)合的抗體(或抗原)的分析方法，唯如何偵測(cè)專(zhuān)一性結(jié)合所用的方法不同。放射線免疫分析法通常是用於測(cè)定血液或組織液中荷爾蒙濃度，而ELISA則常用於檢測(cè)病毒，例如測(cè)定愛(ài)滋病的感染。這兩種方法都必須先純化已知的抗原或抗體或兩者以標(biāo)準(zhǔn)化分析方法。以下我們將介紹較常用於純化抗體的方法，但若須使用純化的抗原，其原理也相同。用RIA偵測(cè)抗原，須將專(zhuān)一性的抗體先用放射線標(biāo)定，最常使用的放射線是碘125 ( 125 I )；用ELISA偵測(cè)抗原，則是須

9、以化學(xué)的方法將酵素連結(jié)到抗體上，而未經(jīng)標(biāo)記的成份(抗原)則附著在固體支撐物如多孔塑膠平盤(pán)的孔內(nèi)，它可吸附一定量的任何蛋白質(zhì)。在非專(zhuān)一性吸附被阻斷的情形下，經(jīng)標(biāo)記的抗體會(huì)與未經(jīng)標(biāo)記的抗原結(jié)合，而未結(jié)合的抗體及其他蛋白質(zhì)則被洗掉。在RIA中所結(jié)合的抗體可直接由反應(yīng)盤(pán)讀取，數(shù)據(jù)的收集非常容易而且可以避免放射性的傷害，因此使ELISA成為最常使用的直接結(jié)合分析法( direct-binding assay )。經(jīng)標(biāo)記的抗免疫球蛋白的抗體也可以用於ELISA，以測(cè)定結(jié)合未標(biāo)記抗原盤(pán)上的未標(biāo)記抗體。在這裡，標(biāo)記過(guò)的抗免疫球蛋白抗體做為第二層( second layer )，應(yīng)用第二層抗體可以加強(qiáng)訊號(hào)，因?yàn)?/p>

10、每一個(gè)未標(biāo)記的第一層抗體至少可以結(jié)合兩分子的標(biāo)記抗體。ELISA也可將未標(biāo)記的抗體插於平盤(pán)內(nèi)再加入標(biāo)記的抗原來(lái)完成。ELISA另一修正後的方法稱(chēng)為補(bǔ)捉法( capture )或三明治酵素連結(jié)免疫吸附法( sandwich ELISA )【或較常用的為抗原補(bǔ)捉法( antigen-capture assay ) 】，可用於偵測(cè)分泌性的產(chǎn)物如細(xì)胞激素( cytokines )。此種方法是將專(zhuān)一性的抗體而非抗原結(jié)合在平盤(pán)內(nèi)，這些專(zhuān)一性抗體對(duì)抗原具有極高的親和性，因此即使最初的混合物中抗原的濃度很低，也能將其集中於平盤(pán)表面，再加入另一組能辨認(rèn)異於固定相的抗體辨認(rèn)表位( epitope )的標(biāo)記抗體來(lái)偵

11、測(cè)所結(jié)合的抗原。這些試驗(yàn)可說(shuō)明所有血清學(xué)檢驗(yàn)中的兩大重點(diǎn)，首先是至少要有一樣試劑是可以純化並定量偵測(cè)的，其次必須將結(jié)合標(biāo)記的試劑使其自未結(jié)合的部分中分離出來(lái)，如此才可以識(shí)別專(zhuān)一性的結(jié)合比例。在正常的情況下，分離的方法是將無(wú)標(biāo)記的結(jié)合物附著在固體容器上，如此便可將未結(jié)合的標(biāo)記分子洗掉，而只留下標(biāo)記的結(jié)合物。如圖一所示，將無(wú)標(biāo)記的抗原附著在孔的底部，而使標(biāo)記的抗體與之結(jié)合，自結(jié)合物中分離出未結(jié)合物是抗體檢查法的基本步驟。 (圖一) 酵素連結(jié)免疫吸附測(cè)定法的原理。為檢測(cè)抗原A，將純化的抗原A專(zhuān)一性抗體連接在酵素上，將待測(cè)的樣品吸附在塑膠孔盤(pán)的底部，而其餘的結(jié)合位則用非相關(guān)的蛋白質(zhì)抑制(未顯示在圖中)

12、，在去除非專(zhuān)一性的結(jié)合之後加入已標(biāo)記的抗原A專(zhuān)一性抗體，將未結(jié)合的抗體清洗掉，而已結(jié)合的抗體則用酵素使之改變顏色進(jìn)行檢測(cè)，此檢測(cè)法可利用多孔的塑膠盤(pán)進(jìn)行而用光譜儀判讀。此種方法稍加改變後可進(jìn)行未知抗原或抗體的檢測(cè)。 利用ELISA無(wú)法自未知組成的樣品中直接測(cè)出抗原或抗體的量，因?yàn)轫氁蕾?lài)與純化的標(biāo)記抗原或抗體結(jié)合之故。有許多方法可以解這些問(wèn)題，其中一種是利用如圖二所示之競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)法( competitive inhibition assay )。這種檢查法是利用標(biāo)記的參考抗原和未知樣品內(nèi)的特定抗原互相競(jìng)爭(zhēng)與吸附在塑膠孔內(nèi)的抗體發(fā)生結(jié)合。藉由加入不同量未標(biāo)記的已知抗原來(lái)畫(huà)出標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用此標(biāo)準(zhǔn)曲

13、線與含有未知樣品者比較以測(cè)定抗原的含量，只要將適當(dāng)?shù)目乖街谒苣z孔中，而後測(cè)定樣品抑制標(biāo)記專(zhuān)一性抗體的結(jié)合能力。(圖二) 利用競(jìng)爭(zhēng)抑制檢測(cè)法檢測(cè)未知樣品中的抗原。將一定量無(wú)標(biāo)記的抗原附著在盤(pán)孔底部，而後加入經(jīng)過(guò)標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)抗原與之結(jié)合，之後再加入不同劑量無(wú)標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)抗原或待測(cè)樣品，觀察其取代已標(biāo)記抗原的情形，劃出抑制曲線。利用等量的無(wú)標(biāo)記抗原與經(jīng)過(guò)標(biāo)記的已知抗原混合，劃出標(biāo)準(zhǔn)曲線，再與所劃出的曲線做比較。圖中的綠線代表缺乏受質(zhì)的樣品與抗原A抗體反應(yīng)的區(qū)線圖。酵素連結(jié)免疫吸附法( enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA )所使用的酵素包括horserad

14、ish peroxidase、 alkaline phosphatase、 lysozyme、 and glucose 6-phosphate dehydrogenase等。這些酵素常利用glutaldehyde或dimaleimide等物質(zhì)將其連接到抗原或抗體分子上，其特性是化性穩(wěn)定，可溶於水，組織中含量低，如此方不致於干擾結(jié)果。ELISA常被用來(lái)偵測(cè)CEA (carcinoembryonic antigen)、 steroid hormones、 immunoglobulin、 DNA、 bacteria和virus的抗體等，其靈敏度高( ng / ml range )，操作簡(jiǎn)便、試劑穩(wěn)定

15、、儀器價(jià)廉及不須要使用危險(xiǎn)性高的放射線物質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，使其未來(lái)應(yīng)用範(fàn)圍日益增加。在ELISA的實(shí)驗(yàn)中，常用的substrate的敏感性由低到高，分別為Colorimetric < Fluorescent < Chemiluminescent。而選擇substrate需要依據(jù)enzyme reporter system；以Alkaline phosphatase (AP) 和 horseradish peroxidase (HRP)為例， 為常用於免疫反應(yīng)的物質(zhì)；而兩者酵素具有多種的substrate；且本身分子量小以及可以快速反應(yīng)出訊號(hào)的產(chǎn)生，且所需的價(jià)格低系統(tǒng)穩(wěn)定。目前常用於ELIS

16、A的substrate有QuantaBlu 、Fluorogenic、Luminol，其所需的酵素分別為HRP、PNPP、Alkaline phosphatase (AP)。如圖三所示。(圖三)ELISA在臨床診斷學(xué)上的應(yīng)用包括：德國(guó)麻疹抗體之測(cè)定；CMV、 HSV、 measles、 mumps、 VZV等病毒抗體測(cè)定。HIV抗體測(cè)定（Rapid ELAVIA，SERODIA-HIV）及C型肝炎病毒抗體測(cè)定（C型肝炎病毒亦可用PCR來(lái)測(cè)定）。運(yùn)用酵素連結(jié)免疫吸附分析法（ELISA）進(jìn)行檢測(cè)之產(chǎn)品，將疑似感染之食物或是食物中毒病人之糞便檢體加以培養(yǎng)，再使用酵素免疫吸收法（ELISA）對(duì)菌種進(jìn)行

17、定性定量檢測(cè)，此產(chǎn)品適合衛(wèi)生單位於檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)或是確認(rèn)中毒菌種時(shí)使用。食品微生物測(cè)試系列，李斯特菌免疫檢驗(yàn)試劑(Listeria monocytogenes ELISA)、腸炎弧菌免疫檢驗(yàn)試劑(Vibrio parahaemolyticus ELISA)、仙人掌桿菌免疫檢驗(yàn)試劑(Bacillus cereus ELISA)。植物病毒診斷試劑；黃化嵌紋、蕪菁嵌紋及胡瓜嵌紋等三種病毒診斷試劑，利用兔子製造出病毒抗血清，分離出來(lái)後製成病毒診斷試劑，由診斷試劑顏色顯現(xiàn)的深淺，斷定瓜果病毒強(qiáng)弱。另外細(xì)菌的檢驗(yàn)，萊姆病、鉤端螺旋體感染癥也可運(yùn)用ELISA原理偵測(cè)；羊乳中牛乳摻假之快速檢測(cè)，自牛乳中分離純化酪蛋白作為抗原，用以免疫兔子及山羊免疫兔子經(jīng)大量抽血並收集其血清後，以硫酸銨沈澱血清白質(zhì)，並先後經(jīng)DEAE-Sephacel陰離子交換管柱純化及連結(jié)有山羊酪蛋白之CNBr-activated Sepharose 4B親合性管柱純化出對(duì)牛乳酪蛋白具高專(zhuān)一性之抗體。此純化抗體經(jīng)由間接型酵素連