第39章 基因工程及蛋白質工程

1、第三十九章 基因工程及蛋白質工程第一節(jié) DNA 克隆的基本原理基因克隆的技術路線大致包括以下幾個程序：分離制備待克隆的DNA 片段（目的DNA）；在體外連接目的DNA 片段和載體；重組DNA 分子轉入宿主細胞；篩選、鑒定陽性重組子；重組子的擴增。一DNA 限制酶與連接酶類型限制酶為多亞基雙功能酶，S 亞基為識別亞基，識別位點為兩部分序列，中間有一定長度的任意堿基對，M 亞基有甲基化酶活性，R 亞基為切割亞基，可在識別位點1kb 以上處隨機切割。類型限制酶有兩個相同的亞基組成，識別位點為46bp 的回文序列，切割位點在識別位點內，或靠近識別位點，經切割可以生成平頭末端或粘性末端，可以產生相同粘性

2、末端的不同的限制酶稱作同尾酶。類型限制酶是分子生物學中最重要的工具酶。類型限制酶為兩個亞基的雙功能酶，M 亞基為識別亞基，R 亞基為切割亞基，切割位點在識別位點下游2426bp 處，特異性不強。EcoRI 與DNA 的復合體：外源DNA 可以被插入質粒載體：限制性內切酶切割DNA 形成對應的粘性末端：使用相同的粘性末端進行重組，會有較多的載體自身環(huán)化，或目的基因串聯(lián)，目的基因的定向連接常使用兩種限制酶，產生兩種不同的粘性末端?？梢栽谳d體和目的基因的兩端連接接頭（引入限制酶切點），或銜接物（含有粘性末端），再連接載體和目的基因。接頭用于建立克隆片斷的末端：大腸桿菌的連接酶只能連接粘性末端，T4

3、連接酶可以連接平頭末端，其條件是：提高T4 連接酶的濃度；提高DNA 片段的濃度；降低ATP 濃度；加入多胺類如亞精胺；加入濃縮劑如乙二醇。T4 連接酶催化的反應：二分子克隆的載體與宿主系統(tǒng)1分子克隆的載體的基本條件能自主復制；具有一種或多種限制性內切酶的單一切割位點，并在位點中插入外源基因后，不影響其復制功能；具有1-2 個篩選標記；克隆載體必須是安全的，不應含有對受體細胞有害的基因，并且不會任意轉入其他生物細胞；易于操作，轉化效率高?，F(xiàn)用的載體都是通過改造構建而成的。宿主細胞的基本條件是：易于接受外源DNA；自身無限制酶和重組能力；易于生長和篩選；符合安全標準。pBR322 是由幾個質粒D

4、NA 通過DNA 重組技術構建而成的克隆載體，分子的長度為4363bp。具有氨芐青霉素和四環(huán)素兩種抗藥性標記。pBR322 共有24 種限制性內切酶的單一識別位點，其中7 種酶(ecoRV,NheI,BamHI,sphI,salI,Xma,Nru I)的識別位點位于四環(huán)素抗性基因內部，2 種酶(ClaI,Hind)的識別位點存在于這個基因的啟動子內部。所以在這9 個限制性位點上插入外源DNA 通常都會導致抗四環(huán)素基因(tetr)的失活。3 種酶(scaI,PvuI,PstI)在氨芐青霉素抗性基因(ampr)內具單一的識別位點，在這3 個位點插入外源DNA 則會導致ampr 基因的失活。若將外源

5、基因插入tetr 基因，將構成的重組質粒轉入對四環(huán)素和氨芐青霉素均敏感的受體菌，則在含氨芐青霉素的平面培養(yǎng)基上生長，而在含四環(huán)素的平面培養(yǎng)基上不生長的菌落均含有外源基因。20 世紀70 年代早期主要利用天然質粒，1977 年Bolivar 等構建成功pBR322、1982 年Viera 和Messsing構建成功pUC 系列質粒，隨后有不少穿梭質粒，表達質粒等問世。2pUC 載體系列是由大腸桿菌pBR322 質粒與M13 噬菌體改建而成的雙鏈DNA 質粒載體，含有來自pBR322 質粒的復制起點(ori)，氨芐青霉素抗性基因(ampr)以及大腸桿菌â 半乳糖苷酶基因(lacZ)的啟動

6、子及其編碼肽鏈的基因，在lacZ 基因中有一個多克隆位點(MCS)區(qū)段。當外源的DNA 片段插入到這些克隆位點使á 互補鏈破壞時，形成的是無活性的â-半乳糖苷酶，被轉化的大腸桿菌細胞，在Xgal-IPTG 培養(yǎng)基上形成白色菌落，而沒有外源DNA 插入的質粒轉化大腸桿菌細胞后，在Xgal-IPTG 培養(yǎng)基上形成藍色菌落。pUC 質粒載體比pBR322 具有更小的相對分子質量，而且由于rop 基因的缺失(其基因產物ROP 蛋白，控制質粒復制)，使得其拷貝數(shù)大增，每個細胞可達500-700 個拷貝，因此由pUC 質粒重組體轉化的大腸桿菌細胞，可獲得高產量的克隆DNA 分子。pUC

7、18 和pUC19 的唯一差別是多克隆位點的方 向相反。Xgal(5 溴-4-氯-3-吲哚-â-D-半乳糖苷)可被â-半乳糖苷酶水解生成深蘭色的5-溴-4-靛蘭，IPTG(異丙基硫代â-D-半乳糖苷)可誘導â-半乳糖苷酶á-鏈的合成。適合于藍白選擇。3ë 噬菌體ë 噬菌體的基因組是長度約為50kb 的線性雙蓮DNA 分子。在其兩端，各有一條由12 個核苷酸組成的互補粘性末端。當ë 噬菌體DNA 進入寄主細胞后，線性DNA 分子通過粘性末端的堿基配對而結合，形成環(huán)狀DNA 分子。這種由粘性末端結合形成的雙鏈區(qū)段為co

8、s 位點?，F(xiàn)用的ë 噬菌體載體都是在野生型基礎上改造而成的。改建之后的常用載體有兩類：插入型載體，具有一個可供外源DNA 插入的克隆位點，如ëgt10、ëgt11；替換型載體，具有成對的克隆位點，在兩個位點之間的ëDNA 區(qū)段可被外源插入的DNA 片段取代，如charon4、charon10、charon35。插入型載體只能插入較小的外源DNA 片段，而替換型載體能插入較大的外源DNA 片段（20-24kb 左右）。當重組體DNA分子大于ë 噬菌體基因組105%或小于75%時，重組噬菌體的活力會大大下降，不能形成正常大小的噬菌斑，所以重組體DN

9、A 分子長度應控制在包裝限度范圍內。ë 噬菌體重組體分子不具有抗生素抗性選擇標記，主要是依據噬菌斑的形態(tài)學特征和Xgal-IPTG 顯色反應來篩選重組子。cI 基因的存在將使噬菌體進入溶源狀態(tài)，因此在培養(yǎng)基上形成的是混濁型的噬菌斑。cI 基因失活或缺失的噬菌體在培養(yǎng)基上形成清亮型噬菌斑。根據這個形態(tài)學特征可篩選重組體分子。許多ë 載體，如charon2、ëgt11 含有編碼â 半乳糖苷酶基因lacZ（其中引入多克隆位點）。由這種載體感染的大腸桿菌lac-菌，涂布在含有IPTG 和Xgal 的培養(yǎng)基平板上，會形成藍色噬菌斑。當外源DNA片段插入到這些克隆位

10、點時，寄主細胞就會在Xgal-IPTG 培養(yǎng)基上形成無色噬菌斑，如果在替換型載體的可替換區(qū)段含有l(wèi)acZ 基因序列，也會出現(xiàn)同樣結果。4Cosmid 質粒黏粒載體本身長4-6kb，具有質粒和ë 噬菌體兩種載體的性質，能像質粒一樣復制及轉化細菌，在細菌中其增殖與質粒復制一樣，產生的重組子是菌落而不是噬菌斑，同時也具有ë 噬菌體的cos 位點，能與ë 噬菌體一樣在體外被包裝成病毒顆粒并感染宿主菌，但是由于在黏粒中克隆基因組文庫要比在ë 噬菌體中困難得多，只有在靶基因過大，不能作為單個DNA 區(qū)段在ë 噬菌體載體中克隆增殖，或者要分離一系列跨過染色體

11、DNA 特大區(qū)段的重疊克隆時，才使用黏粒載體。用于克隆大片段DNA 的 Cosmid 質粒：5酵母人工染色體定向克?。簝蓚€粘性末端的序列不同，僅按照一個方向插入質粒。三外源基因導入宿主細胞外源基因導入原核細胞的常用方法有：轉染，即用冰冷的CaCl2 處理后瞬間加熱，將含有外源DNA的質粒導入感受態(tài)的宿主細胞；轉化，即用噬菌體將外源DNA 導入感受態(tài)的宿主細胞；電穿孔法，即用脈沖高壓電瞬間擊穿細胞膜，將含有外源DNA 的質粒導入宿主細胞；ë 噬菌體的體外包裝，將含有外源DNA 的ë 噬菌體DNA 與外殼蛋白在體外包裝成噬菌體，可以大幅度提高轉化率，包裝蛋白有商品出售。外源基因

12、導入酵母細胞的常用方法有：用蝸牛消化酶消化細胞壁，制成原生質體，再用CaCl2 和聚乙二醇處理，促進重組DNA 的吸收。外源基因導入動物細胞的常用方法有：磷酸鈣共沉淀法；DEAE-葡聚糖或聚陽離子促進吸收法；脂質體轉染法；電穿孔法；病毒轉染法；顯微注射法。外源基因導入植物細胞的常用方法有：用纖維素酶消化細胞壁，制成原生質體，再用CaCl2 和聚乙二醇處理，促進重組DNA 的吸收，也可使用電穿孔法和脂質體轉染法；將外源DNA 插入Ti 質粒的T-DNA，借助土壤農桿菌將外源DNA 導入植物細胞；基因槍微彈射擊法；顯微注射法。四陽性克隆的篩選1快速裂解菌落鑒定分子大小從平板中直接挑取菌落裂解后，不

13、需要內切酶消化，直接進行凝膠電泳，與載體DNA 比較遷移率，初步判斷是否有插入片段存在，本方法適用于插入片段較大的重組子初步篩選。2內切酶圖譜鑒定對于初步篩選鑒定具有重組子的菌落，應小量培養(yǎng)后，再分離出重組質?；蛑亟M噬菌體DNA，用相應的內切酶(1 種或2 種)切割重組子釋放出插入片段，對于可能存在雙向插入的重組子，還要用內切酶消化鑒定插入方向，然后凝膠電泳檢測插入片段和載體的大小。3Southern 印跡雜交為了進一步確定DNA 插入片段的正確性，在內切酶消化重組子，凝膠電泳分離后，通過Southern 印跡轉移將DNA 移至硝酸纖維膜上，再用放射性核素或非放射性標記的相應外源DNA 片段作

14、為探針，進行分子雜交，鑒定重組子中的插入片段是否是所需的靶基因片段。4PCR 篩選重組子一些載體的外源DNA 插入位點兩側，存在恒定的序列，用相應的引物對小量抽提的質粒DNA 進行PCR 分析，不但可迅速擴增插入片段，而且可以直接進行DNA 順序分析。對于原核或真核系統(tǒng)表達型重組子，其插入片段的序列正確性是非常關鍵的，故有必要對重組子進行序列測定，DNA 序列分析現(xiàn)多采用自動測序儀完成。5菌落（或噬菌斑）原位雜交菌落或噬菌斑原位雜交技術是先將轉化菌直接鋪在硝酸纖維素薄膜或瓊脂平板上，再轉移到另一硝酸纖維素薄膜上，用核素標記的特異DNA 或RNA 探針進行分子雜交，然后挑選陽性克隆菌落。本方法能

15、進行大規(guī)模操作，一次可篩選5×105-5×106 個菌落或噬菌斑，對于從基因文庫中挑選目的重組子，是一項首選的方法。典型的細菌轉化實驗：第二節(jié) 基因的分離、合成和測序一目的基因的來源1基因組DNA 的非特異性斷裂超聲波處理基因組DNA 可得到300bp 左右的隨機片段，高速組織搗碎器，控制一定的條件也能得到不同大小的DNA 片段，如將高分子量DNA1500r/m 搗碎30 分鐘，可得到大約8kb 的DNA 片段。由機械處理產生的DNA 片段末端不一，斷點隨機，條件難以掌握，所以目前較少使用這種方法。2染色體DNA 的限制性內切酶解型限制性內切酶可專一識別并切割特定的DNA

16、順序，產生不同類型的DNA 末端。若載體DNA 與插入片段用同一種內切酶消化，可以直接進行連接。內切酶識別的DNA 順序長短與降解后DNA 產生的片段大小有直接關系。若識別順序為4 個堿性對，則該順序在DNA 鏈上出現(xiàn)的機率為44，即在堿基隨機排列的前提下，每256 個堿基對就有一個切點。對于識別6 個核苷酸的限制性內切酶，其順序出現(xiàn)的頻率為46(4096)，可獲得較大的DNA 片段，也可用于DNA 文庫的建立。3通過mRNA 合成cDNA基因組DNA中重復順序和假基因占有很大比重，克隆完整的基因比較困難。用mRNA反轉錄成cDNA，得到相應的雙鏈cDNA，再進行克隆，獲得較完整的連續(xù)編碼順序

17、，容易在宿主細胞中表達。除建立cDNA 文庫以外，對于一些高豐度表達、容易純化的蛋白質，可以直接通過該蛋白質的單克隆抗體純化該基因的核糖體，再分離該蛋白質的特異mRNA，直接反轉錄成cDNA，進行基因克隆，從而直接獲得該特定基因的克隆，這是用染色體DNA 難以達到的克隆效果。4人工體外合成DNA 片段隨著體外合成DNA 的技術日漸完善，合成DNA 的長度不斷加長。一些小分子生物活性多肽，可以通過人工合成編碼順序插入載體后，轉化細菌進行表達。分子較大的基因，可以通過分段合成，然后連接組裝成完整的基因。目前已經合成了人胰島素A、B 鏈基因和干擾素基因，并成功表達，制備成商業(yè)產品。5聚合酶鏈反應（P

18、CR）擴增特定基因片段對于有部分了解或完全清楚的基因，可以通過PCR 反應，直接從染色體DNA 或cDNA 上高效快速地擴增出目的基因片段，然后進行克隆操作。唯一的要求是，對基因片段兩側的序列了解清楚。二基因文庫的構建克隆數(shù)目的估算公式為：N=ln(1-p)/ln(1-f)。P：任意基因存在于文庫中的概率；f：克隆DNA(bp)占基因組(bp)的分數(shù)。三cDNA 文庫的構建真核mRNA 的分離：逆轉錄合成cDNA：四克隆基因的分離與鑒定用克隆雜交對基因組文庫進行篩選：用已知氨基酸序列設計的寡核苷酸探針篩選文庫克隆基因：差別雜交：若A 組細胞用生長因子處理，B 組細胞不作處理，將其中的一組mRN

19、A 逆轉錄成cDNA文庫，與另一組的mRNA 雜交，或將兩組的mRNA 均逆轉錄成cDNA 再進行分子雜交，不能形成雜交雙鏈的是二者差異表達的基因?？鄢s交：比差別雜交省時、省力、靈敏度高，基本原理如圖所示。用Southern 雜交法鑒定克隆基因：五聚合酶鏈式反應擴增基因六篩選目的基因的其他方法蛋白質組學：通過雙向電泳，聚焦層析-電泳等方法對比相關樣本，確定目標蛋白，經測序用遺傳密碼推測基因的部分序列，用PCR 等方法獲取目的基因；基因芯片：分析相關樣本的mRNA，確定目標基因；mRNA 差異顯示：提取欲對比的兩個樣本的mRNA，分別用5T11-MN 或5-T12MN(M 代表除T以外的任意核

20、苷酸，N 代表任意核苷酸)共12 種不同的下游引物合成cDNA 的第一鏈，所得24 種cDNA的第一鏈均用通用引物合成第二鏈，并引入放射性同位素標記，將相對應的12 對cDNA 分別用測序膠電泳分離，放射自顯影，對比二者的條帶，找出差異，回收特異性差別條帶，擴增，測序，或合成探針篩選基因。表達序列庫：將基因克隆到表達載體，表達后用免疫學方法、產物功能測定、產物的結構研究等方法鑒定特定的基因。七基因定位誘變八DNA 序列的測定第三節(jié) 克隆基因的表達一基因表達的控制元件在典型的表達載體中，真核編碼序列被插入啟動子和轉錄起始點的下游，插入位點的下游應當有轉錄終止信號，轉錄產生的mRNA 應包含核糖體

21、結合位點。二RNA 的表達表達載體攜帶能夠被噬菌體SP6 的RNA 聚合酶辨認的啟動子. SP6 RNA 聚合酶可以在體外高效率地轉錄,將任何目的DNA 插入SP6 啟動子下游的多接頭克隆位點，可以連續(xù)的轉錄產生RNA，轉錄起始前，環(huán)狀的表達載體會在插入位點或其附近被單一位點裂解而線性化，因此，轉錄會在固定的位點終止。三蛋白質的表達1表達非融合蛋白用原核生物對真核基因進行非融合表達，容易得到較大的表達量，但表達產物不易形成正確的折疊，不能被糖基化，容易被分解，或形成包含體，裂解包含體時，蛋白質會變性，需要復性，才能得到有活性的蛋白質。融合lac 和trp 的啟動子，可被IPTG 誘導，是最常用

22、的原核啟動子。2表達融合蛋白融合蛋白的N 末端由原核DNA 序列編碼，C 端由真核DNA 的完整序列編碼，含原核細胞多肽的融合蛋白可避免細菌蛋白酶的破壞。表達融合型蛋白時，為了得到正確的真核蛋白，在插入真核基因時，其閱讀框架與融合的DNA 片段的閱讀框架要一致，翻譯時，才不至于產生移碼突變。工程菌必須在有足夠量的繁殖以后，再表達目的基因，否則，沒有足夠的菌量，就得不到足夠的表達產物。通常在細菌達到對數(shù)生長期后，再加入誘導物，誘導目的基因的表達，X-gal 是常有的誘導物。5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷：3表達分泌蛋白表達分泌蛋白是防止宿主菌對表達產物的降解，減輕宿主細胞代謝負荷及恢復表

23、達產物天然構象的最有力措施。在原核表達系統(tǒng)中，人們研究比較多的主要是大腸桿菌。大腸桿菌主要由四部分組成：胞質、內膜、外膜及內外膜之間的周間質。一般情況下，所謂“分泌”是指蛋白質從胞質跨過內膜進入周間質這一過程。而蛋白質從胞質跨過內、外膜進入培養(yǎng)液的情況較為少見，被稱為“外排”以區(qū)別于“分泌”。4外源基因在酵母中的克隆和表達在酵母中表達真核基因，表達產物容易形成正確的折疊和糖基化，但不容易形成較大的表達量。通常將目的基因插入穿梭載體，在大腸桿菌中擴增后，再轉入酵母菌進行表達。用酵母菌表達的不少蛋白質已經作為基因工程產品，產生了很好的經濟效益和社會效益。典型的穿梭質粒，分別含有酵母和細菌的起始位點

24、。整合載體（yeast integrating plasmid）無酵母的復制起點，必須整合到染色體中才能穩(wěn)定存在。附加體質粒（yeast integrating plasmid）有酵母的復制起點，在酵母細胞中以高拷貝存在。復制質粒（yeast integrating plasmid)有酵母的自主復制序列（autonomous replicating sequence,ARS），在酵母細胞中以中等拷貝存在。含著絲粒（CEN）的質粒（yeast centromere- containing plasmid）含有ARS 和CEN，在酵母細胞中以單拷貝穩(wěn)定存在。酵母的表達載體必須含有可以被RNA 聚合

25、酶識別的強啟動子，如可誘導型的GAL（半乳糖激酶）、PHO5（堿性磷酸酯酶），組成型的ADH1（醇脫氫酶）、PGK（磷酸甘油激酶）、GPD（葡萄糖-6-磷酸脫氫酶）等的啟動子。酵母人工染色體（yeast artificial chromosome)含有ARS 和CEN 和TEL 端粒(telomere)，能以微型染色體存在，可以克隆超過100kb 的DNA 片斷。外源基因在植物細胞中的克隆和表達：植物細胞有全能性，轉基因的細胞或組織容易培養(yǎng)成植株，但將基因轉入植物細胞較困難，被轉入的基因有時不能表達，或表達量不足以引起性狀變化，有時會抑制內源基因的表達。轉基因作物已有大規(guī)模種植，以抗性基因為主

26、，也有耐貯藏和改善品質的成功范例。使用共整合載體時，常用三個菌株配合：具有輔助轉移質粒的大腸桿菌；具有攜帶目的基因質粒的大腸桿菌；具有onc-Ti 質粒衍生的受體載體的根瘤土壤桿菌菌株。胭脂堿合成酶-新霉素抗性基因：T-DNA 右端邊緣；T-DNA 左端邊緣。編碼多種轉移和整合作用相關的酶和蛋白質。外源基因在動物細胞中的克隆和表達：猿猴細胞為SV40 的受納細胞，嚙齒類細胞為非受納細胞，人體細胞為半受納細胞。T 抗原基因、外殼蛋白基因。構建逆轉錄病毒載體時，將原病毒DNA 插入大腸桿菌的質粒pBR322，然后用抗性基因如新霉素抗性基因(neo)、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶基因(gpt)、二氫葉酸還原酶基因(dhfr)等取代病毒的gag (group specific antigen，種群特異性抗原)、pol（polymerase，聚合酶）和env（envelope，被膜）基因的全部或大部。包裝位點：負鏈引物結合位點(negative strand primer binding site)。綠色熒光蛋白（