骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體內(nèi)示蹤及其修復(fù)椎間盤退變的實(shí)驗(yàn)研究

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體內(nèi)示蹤及其修復(fù)椎間盤退變的實(shí)驗(yàn)研究         11-03-25 15:51:00     編輯：studa20                      作者：曹燁，吳小濤，王運(yùn)濤，嚴(yán)慧深，邵建樹(shù) 【摘要】  目的：探討骨髓

2、間充質(zhì)干細(xì)胞(marrow mesenchymal stromal cells,MSCs)的標(biāo)記與體內(nèi)示蹤方法，及其治療椎間盤退變的可行性。方法：取兔MSCs行體外培養(yǎng)，并在體外純化擴(kuò)增，用超順磁性氧化鐵(superparamagnetic iron oxide,SPIO)磁粒子標(biāo)記后分別于1、3、5、7 d用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性。將標(biāo)記后的細(xì)胞植入退變的椎間盤內(nèi)。分別于2、4、6、8周用間苯三酚分光光度法測(cè)定蛋白多糖含量的變化，免疫組化法測(cè)定型膠原含量的變化，用MR掃描對(duì)標(biāo)記干細(xì)胞在椎間盤內(nèi)分布進(jìn)行示蹤。所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果：MTT法結(jié)果顯示，SPIO對(duì)MSCs的生物活性無(wú)影響，MS

3、Cs能被SPIO有效標(biāo)記。運(yùn)用MR掃描可觀察到其在體內(nèi)的分布，并發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞向周邊發(fā)生了遷徙。8周內(nèi)實(shí)驗(yàn)組髓核蛋白多糖和型膠原的含量高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：SPIO可有效地標(biāo)記MSCs并行體內(nèi)活體示蹤，且不影響細(xì)胞活性，是理想的示蹤劑。SPIO標(biāo)記后的MSCs移植能增加髓核中細(xì)胞外基質(zhì)的含量，從而延緩椎間盤退變。 【關(guān)鍵詞】  骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞; 超順磁性氧化鐵; 磁共振成像; 椎間盤退變; 兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(marrow mesenchymal stromal cells,MSCs)具有較強(qiáng)的自我更新和分化為多種成熟細(xì)胞的能力，由于它的這種特性，被廣泛地應(yīng)用于細(xì)胞組織工

4、程中作為種子細(xì)胞進(jìn)行研究。目前MSCs移植治療疾病已在動(dòng)物模型中取得初步成效，但MSCs移植后如何在活體內(nèi)監(jiān)測(cè)其存活、分布及遷徙情況仍需要做進(jìn)一步的研究。隨著分子成像技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用超順磁性氧化鐵(superparamagnetic iron oxide,SPIO)標(biāo)記干細(xì)胞，已成為體內(nèi)示蹤的重要手段12。目前已有研究顯示，移植MSCs可能成為治療椎間盤退變的一種新方法。本研究旨在探討SPIO對(duì)細(xì)胞生物活性的影響及體內(nèi)示蹤效果，標(biāo)記的干細(xì)胞移植是否能有效治療椎間盤退變。1 材料和方法1.1 主要材料和試劑LGDMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，100%胎牛血清(杭州四季青公司)，胰蛋白酶、M

5、TT(美國(guó)Sigma公司)，抗型膠原抗體(美國(guó)ADL公司)，DMSO(二甲基亞砜，西安化學(xué)試劑廠)，酶聯(lián)免疫酶標(biāo)儀(550型)(美國(guó)BIORAD公司)，1.5 T MR儀(荷蘭Philips公司);新西蘭大白兔由東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。1.2 實(shí)驗(yàn)方法取MSCs細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106 ml-1并行臺(tái)盼藍(lán)染色。鏡下觀察，在3 min內(nèi)用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板分別計(jì)活細(xì)胞和死細(xì)胞數(shù)，死細(xì)胞被染成淡藍(lán)色，而活細(xì)胞拒染?；罴?xì)胞率(%)=活細(xì)胞數(shù)/(活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))×100%。3、L34、L45椎間隙，用21號(hào)針頭針刺抽吸椎間盤，抽出組織濕質(zhì)量45 mg。造模成功后

6、，術(shù)后2周，把模型兔隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組及模型組，每組各12只，同上述手術(shù)方法，實(shí)驗(yàn)組在對(duì)應(yīng)的椎間盤內(nèi)注射SPIO標(biāo)記的干細(xì)胞懸液25 l，模型組在對(duì)應(yīng)的椎間盤內(nèi)注射磷酸緩沖液(PBS)25 l，在每個(gè)相應(yīng)椎間盤旁的腰大肌處以黑色縫合線作標(biāo)記,用于以后取樣觀察。然后沖洗、止血，依次逐層關(guān)閉切口。術(shù)后每日定期觀察切口情況，肌肉注射抗生素預(yù)防感染。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理運(yùn)用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果用x-±s表示。多組間比較運(yùn)用單因素方差分析F檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)=0.05。2 結(jié) 果2.1 兔MSCs原代培養(yǎng)生長(zhǎng)及形態(tài)觀察原代細(xì)胞接種后24 h即有細(xì)胞開(kāi)始貼

7、壁生長(zhǎng)，呈類圓形或細(xì)小梭形;57 d后細(xì)胞集落逐漸增多擴(kuò)大，并彼此融合，細(xì)胞呈現(xiàn)梭形外觀;1012 d細(xì)胞融合達(dá)90%以上，細(xì)胞呈柵欄狀、漩渦狀排列，細(xì)胞間的界限不清，可以傳代。MSCs的活率：傳代至P3的細(xì)胞，經(jīng)0.25%的胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活率達(dá)95%。2.2 SPIO標(biāo)記的干細(xì)胞SPIO標(biāo)記的MSCs經(jīng)普魯士藍(lán)染色后在光鏡下觀察，細(xì)胞胞漿內(nèi)分布有大量的藍(lán)黑色鐵顆粒，標(biāo)記率為100%(圖1)。2.3 MTT結(jié)果相同培養(yǎng)時(shí)間標(biāo)記細(xì)胞培養(yǎng)組與未標(biāo)記細(xì)胞培養(yǎng)組之間的A值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組的A值都逐漸增高(表1)。2.4

8、 MR掃描移植干細(xì)胞的髓核，不同時(shí)間MRI T2像對(duì)比，早期髓核T2像形成一個(gè)低信號(hào)區(qū)，周圍為高信號(hào)的髓核組織，而后期的髓核T2像即表現(xiàn)為均一的低信號(hào)，提示SPIO標(biāo)記的干細(xì)胞植入髓核內(nèi)后由移植中心區(qū)向周邊髓核發(fā)生遷徙(圖2)。表1 兩組不同培養(yǎng)時(shí)間的吸光度值2.5 蛋白多糖含量測(cè)定結(jié)果術(shù)后2、4、6、8周,將各組的蛋白多糖測(cè)定值經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組間再行兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組與模型組及模型組與對(duì)照組之間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。表2 不同時(shí)期各組髓核蛋白多糖含量2.6 病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組髓核組織型膠原染色呈陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性，模型組呈陰性或弱陽(yáng)性反應(yīng)(圖3)。術(shù)后2、4、6、8周,各組間測(cè)定值經(jīng)方差分析，差異