植物生理學(xué)中各項生理指標(biāo)的測定方法

1、植物生理學(xué)中各項生理指標(biāo)的測定方法.實驗內(nèi)容實驗1MDA（丙二醛）含量測定所需試劑：10%三氯乙酸（TCA（純）0.25%硫代巴妥酸（純）實驗2：可溶性蛋白含量測定所需試劑：考馬斯亮藍(lán)G-25095%乙醇85%磷酸實驗3:SOD®氧化物歧化酶）酶活性測定所需試劑：dl-甲硫氨酸（Met）NBTEDTA-Na2核實驗4:CAT過氧化氫酶）活性（過氧化氫酶）測定所需試劑：PBS（PH=7.0）30%H2O2實驗五：Apx（抗壞血酸過氧化物酶）活性（即ASA-POD舌性）測定所需試劑：ASA（分子量167.12）（乙=胺四乙酸二鈉）EDTANa2PBS（pH7.0）30%H2O實驗6:AS

2、A（維生素C）含量測定偏磷酸95%乙醇磷酸4%2,2-二聯(lián)吡啶FeCI3（或FeCI3?6H2O實驗7:GSH?胱甘肽,媚力肽GSHGS灌由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸結(jié)合而成的三肽化合物）含量測定所需試劑：NaH2PO42H2ODTNB二硫代硝基苯甲酸）PBS（PH6.8）實驗8：脯氨酸測定所需試劑：磺基水楊酸甲苯茚三酮冰乙酸85%磷酸試驗9：葉綠素含量測定。80%丙酮試驗9:GF活性測定試驗10：過氧化氫含量測定。三氯乙酸試驗11：超氧陰離子含量測定二酶液和母液提取1 .酶液提取所需試劑：50mmol/L磷酸緩沖液（PH=7.8）（內(nèi)含1%（m/v）聚乙烯吡哆烷酮PVP），O.lmmol/LE

3、DTAN戴EDTA也可為（內(nèi)含2%（m/v）PVP,0.2mmol/LEDTANa或EDTA（先配制后用緩沖液定容）2 .ASA.GSH母液提取所需試劑：5%偏磷酸1抗氧化酶酶液提取（SOD.POD.CA：T1g（根據(jù)樣品的量，少的可以適當(dāng)減少）葉片加入預(yù)冷5mL50mmol/L磷酸緩沖液（PH=7.8）C冷凍15000g離心20分鐘上清液即為酶液（5c下保存一兩天內(nèi)備用，中短期用-20C保存）2.ASA.GSH母液提?。?.1g葉片加入3ml預(yù)冷5%偏磷酸溶液4c冷凍14000g離心10分鐘上清液即為母液（5°C下保存?zhèn)溆茫ㄆ姿峥娠@著沉淀蛋白質(zhì)和保護(hù)AS酶液提取所需試劑：PVP

4、（聚乙烯叱哆烷酮）：1%（1g溶于100ml水），1000ml需稱取10g,此處用PBSEDTA-Na:0.1mmol/L（37.2mgEDTA-Na容于1000ml蒸餾水），此處用PBSPBS（緩沖液）配制方法：NaHPO412H2C©NaHPO4?2H2O取71.64g，蒸餾水定容至1L,取31.21g定容至1L,放置4C冰箱備用PH=7.8取91.5ml+8.5ml=100ml（濃度0.2mol/L）需要0.05mol/Lf將上述溶液烯釋至400ml（0.2mol/L*0.1=0.05mol/L*V）母液提取所需試劑：5%偏磷酸：稱5g純偏磷酸，定容至100ml蒸餾水（需加熱溶

5、解，溫度在50-60c）偏磷酸有劇毒（偏磷酸難溶解，先得用研缽提前研碎，后用磁力攪拌器溶解一到兩天后再定容）（現(xiàn)所用為38%HPQf以需稱65.7895g,定容至500ml）三實驗步驟實驗1:MD給量測定1.1 所需試劑：10%三氯乙酸（TCA（純）稱10g定容至100ml0.25%硫代巴妥酸（純）稱0.25g用10%TC能容至100ml（配制時，可一次完成，先配TC必要定容，再加入硫代巴比妥酸，然后定容，若難溶解，可以在磁力攪拌器上微熱）1.2 步驟：取0.3g葉片，加4ml磷酸緩沖液研磨，加入4ml0.25%的硫代巴比妥酸（溶于10%的三氯乙酸）溶液J搖勻95°C加熱15分鐘J快

6、速冷卻3000g離心15分鐘取上清測定OD532，OD600，OD450值按公式求MDA濃度=6.45X（OD2-OD。）-0.56OD45（Pmol/L）可溶性糖濃度=11.71X。由（mmol/L）最后計算MDA含量（Pmol/gFW）=4X（MDA濃度x）X103/0.1同時，可測得可溶性糖含量（mmol/gFW）=4X（可溶性糖濃度x）X10-3/0.1（用多波長測定，在測定之前一定要矯正基線，公式中的參數(shù)可以直接在分光光度計上輸入）注意：以0.25%的硫代巴妥酸溶液作空白調(diào)零MD給量測定的改進(jìn)1 .可以用做酶活性時提取的酶液來直接測定MD給量，用量可以定為1.0、1.5或2.0（較好

7、）ml。2 .硫代巴妥酸溶液改為0.5%的硫代巴比妥酸（溶于20%的三氯乙酸）溶液。實驗2:可溶性蛋白含量（參照Bradford方法測定），以BSA作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白（牛血清蛋白）2.1 所需試劑及配制：牛血清蛋白（BSA考馬斯亮藍(lán)G-250,95%噌享，85嫡酸考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白染色劑的配制：稱取100m烤馬斯亮藍(lán)G-250,溶于50ml95%L醇，加入100ml85%的磷酸，最后蒸偏水定容到1L,混勻，放置過夜，過濾后貯放在棕色瓶中，常溫下可放置一個月。?標(biāo)準(zhǔn)曲線制作： 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：稱取10mg牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，溶于蒸儲水，定容至100ml,制成100Pg/ml的標(biāo)準(zhǔn)液，4°C

8、下保存?zhèn)溆?。（必須是牛血清蛋白向水中溶解，不能顛倒?取6支具塞試管（10ml）,按下表配制含0-100Pg/ml的牛血清蛋白液各1ml（調(diào)零管）123456蛋白標(biāo)準(zhǔn) 液（ml）00.20.40.60.81.0蒸儲水（ml）1.00.80.60.40.2020406080100（g）各試管加入5mlG-250染色劑，翻轉(zhuǎn)混合，放置2分鐘595nm比色，繪制過原點標(biāo)準(zhǔn)曲線（方程式）。（相關(guān)系數(shù)要兩個9以上）2.2步驟： 標(biāo)準(zhǔn)曲線（參考鄒琦）（595nm比色）注意：制作通過原點的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以含0Pg蛋白質(zhì)液調(diào)零 取0.1g樣品，力口5ml蒸偏水提取，5000g離心10分鐘，取上清1ml測定1ml樣

9、液+5mlG-250液蓋塞翻轉(zhuǎn)混合數(shù)次，最后595nm比色，直接從標(biāo)準(zhǔn)曲線讀含量。（此方法反應(yīng)十分迅速，2分鐘即達(dá)到平衡，其結(jié)合物在室溫下1小時內(nèi)保持穩(wěn)定）實驗3:SODW舌性3.1步驟：1.取50口l酶液 加入2ml39mmol/L甲硫氨酸（Met） 2ml0.225mmol/LNBT,（氮藍(lán)四唾）1ml0.6mmol/LEDTA-Na?（可以配制在一個試齊ij瓶里）1ml0.012mmol/L核黃素，搖勻。（現(xiàn)配現(xiàn)用）2. （人工培養(yǎng)箱內(nèi)）4000Lx日光燈下放置30分鐘后，溫度控制在30°C，于暗處終止反應(yīng)。（用大燒杯套著小燒杯，將試管放在同心圓內(nèi)，每隔5min轉(zhuǎn)過90度，轉(zhuǎn)四

10、次。對照（不加酶液）每次至少對稱地放3支，調(diào)零的不照光和不加酶液）3. 560nm處測吸光值，酶活性以抑制NBT光反應(yīng)50渤一個酶活單位表示。（實驗中可將除酶液和核黃素外其它試劑按比例混合好后，一次加入5ml，然后依次加入核黃素和酶液，以不加酶液的照光管為對照。）_3.2所需試劑：dl-甲硫氨酸（Met）39mmol/L1.1638g/g00ml以NBT0.225mmol/L（0.01840均克）/100ml0.0368g/200mlEDTA-Na0.6mmol/L0.0223g/100ml核黃素0.012mmol/L0.0045g/L或0.0045g/100ml用時稀釋10倍各試劑溶液均在用

11、前配置，配置好后均應(yīng)避光保存，尤其是核黃素，必須隨用隨配，避光保存。試驗進(jìn)行時一次性加5ml的反應(yīng)混合液配置方法：Met+NBT+EDTA-Na2SOC酶測定時，酶液量50Pl偏少，改為100Pl為佳,200mll+200ml+100ml另外反應(yīng)時間30分鐘過長，改為20分鐘適合SO席性（酶單位u/gFW=（A0-A1）*V/A0*0.5*FW*aA0-對照照光管光吸收值；A1-樣品管光吸收值。V-樣液總體積（ml）5mlFW-鮮重（g）1ga-測定用樣品的量（ml）0.1ml實驗4:CAT活性（過氧化氫酶）4.1 所需試劑： PB（SPH=7.0）50mmol/L（61份50mmol/lNa

12、2HPO4,39份50mmol/lNaH2PO4） 15mmol/L"0（以30%HQ配）（取85.2PL30%HQ,以50mmol/LPBS（PH7.0）定容至100ml）4.2 步驟:1. 3ml50mmol/LPBS（PH7.0）力口入50Pl酶液（加比色杯的蓋子搖2-3下，讓酶液與緩沖液充分分散）再加入5l15mmol/LH2Q搖勻（加比色杯的蓋子搖2-3下，讓酶液與緩沖液充分分散）。2. 240nm處作時間才3描（每0.5分鐘測1次，共測3分鐘）3. CAT活性以每分鐘消耗1Pmol的HO為一個酶活單位?；钚杂嬎愀膭樱海ㄒ悦糠昼奜D®減少0.01為一個酶活單位u）

13、（2005和2006年均是按ODfi減少0.01算的）（以每分鐘ODS減少0.1為一個酶活單位u）注意：以PBS作空白調(diào)零50mmol/L實驗5:APX活性（抗壞血酸過氧化物酶）（即ASA-PO席性）5.1所需試劑：ASA（分子量167.12）0.3mmol=0.052836（g）（乙=胺四乙酸=鈉）EDTArNa2（以PBS配成0.1mmol/L=0.0372（g）/L）50mmol/LPBS（pH7.0）9mmol/LH2Q（以30%bD配制）（51Pl30%H2Q定容至100ml）計算為：K1=2.8,K2=3,K3=-1,K4=100可得至U總?cè)樱?ml酶液或1g樣）的最終活性。酶活

14、性單位為Imol/g（鮮重）?min以后APX活性測定可參考沈文巡：抗壞血酸過氧化物酶活性測定的探討3ml反應(yīng)液中含50mmol/LPBS,pH7.0,0.1mmol/LEDTA（或EDTA-Na2），0.1mmol/LH2O20.5（或0.3）mmol/LAsA最后加入適量酶液（20、50、100ul均可）啟動反應(yīng)，連續(xù)記錄測定室溫下290nm吸收值的變化。以不加H2O2乍為對照，H2O瘁身對AsA的氧化作用在測定時間內(nèi)由于吸收值變化太小可忽略不計。室溫下每分鐘氧化1umolAsA的酶量作為一個酶活性單位（U）（吸光系數(shù)為2.8mmol/Lcm）5.2步驟：1 .配反應(yīng)液（50mmol/LP

15、BS（pH7.0），內(nèi)含0.1mmol/LEDTA-Na2含0.3mmol/LASA）2 .樣品池加入3ml反應(yīng)液，加入50Pl酶液，最后加入5Pl9mmol/LH2O2（蓋上比色杯的蓋子搖勻，2-3次）在290nm處作時間才3描，每10秒測一次，共測30秒。（注意：在測定中消光值應(yīng)該是不斷減小的）3.根據(jù)OD值變化，計算單位時間內(nèi)AsA消耗量，（ASA氧化消耗量按消光系數(shù)2.8mmol/L?cni,酶活性以單位時間每消耗1itmol的ASA為一個酶活單位，最后計算樣品的APX活性（單位為：U/g（鮮重）?min）。（活性計算改動）根據(jù)OD29值變化，計算單位時間內(nèi)AsA減少量（ASAK化量按

16、消光系2.8mmol/L?cmm，并計算樣品APX終活性。酶活性單位為tmol/g（鮮重）?min實驗6ASA含量測定6.1 步驟：1. 取樣品母液0.2ml,1.4ml，75mmol/lNaH2PO4溶液（pH值7.4）（2.34gNaH2PO4?2H2淀容至200ml,用NaOKpH調(diào)至7.4）混合；（75mmol/lNaH2P。4§液亦可用150mmol/lNaH2PO4溶液稀釋1倍得到）2. 依次加入（ 1） 10%偏磷酸（26.3158g38%偏磷酸定容至100ml）0.4ml;（ 2） 44%磷酸（26ml85%磷酸+41ml蒸餾水）0.4ml;（3）4%2,2'

17、-二聯(lián)吡啶（稱取4.0g2,2-二聯(lián)吡啶用70%酒精定容至100ml）0.4ml;70%酒精配制（95%乙醇70份重量+蒸餾水25份重量）3%FeCI30.2ml（稱取5.0gFeCI3?6H2O定容至100ml）,搖勻，于37°C保溫1.0h（5）測525nm波長下的光吸收值4.以標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算ASA含量6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：（1）稱取10mgAS汾析純，以5姍磷酸定容至100ml,成100微克/毫升的標(biāo)準(zhǔn)液；(2)按下表取8支試管，按照表中的程序加液j式管編勺12345678標(biāo)準(zhǔn)液(ml)00.020).040.060.08().100.120.145%?偏磷酸(ml)0.2

18、00).180.160.140.12().100.080.06AS給k(微02468101214按前面步驟1、2所述依次加入各反應(yīng)液，最后測525nm長下的光吸收值，作過原點標(biāo)準(zhǔn)曲線，求線性方程。實驗7:GSHW量測定7.1步驟：1 .取樣品母液0.2ml,加入150mmol/LNaH2PO希液(pH7.7)(11.70gNaH2PO42H2Cfe容至500ml用氫氧化鈉調(diào)pH至7.7)2.6ml2 .混勻再加入0.2mlDTNEB§«(二硫代硝基苯甲酸DTNB75.3mg溶于30ml0.1mol/L磷酸緩沖液pH6.8)搖勻。實際配置時，稱75.3X2=150.6mg,即

19、0.1506gDTNB§于60mlPBS中3 .在30°C保溫5分鐘，測定412nm波長下的光吸收值?！居行┪墨I(xiàn)(如龔吉蕊、於丙軍)方法同樣用DTNBS色，都是在常溫下顯色30分鐘因此可將反應(yīng)時間適當(dāng)延長至10分鐘】7.2根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（GSH程，計算GSH量。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：1.稱取100mgGSH析純，以5姍磷酸定容至100mL成1mg/ml即1000ug/ml的標(biāo)準(zhǔn)液。2.參照實驗6標(biāo)液方法。1式管編12345678，準(zhǔn)液1（ml）00.020).040.060.08().100.120.145%偏磷(ml)0.200).180.160.140.12().100.080.

20、06GSH版克）X02468101214正確GSI含量（微k）0H204060801001201403.以GSH量為0的溶液調(diào)零，制作過原點標(biāo)準(zhǔn)曲線（及方程所需試劑：NaH2PO4150mmol/L）人稱23.41gNaH2PO42H2O定容至1L（或稱5.85定容至250ml）DTNB（二硫代硝基苯甲酸）0.1mol/LPBS（PH6.8）（參照鄒琦的書實驗8脯氨酸測定8.1步驟：1.取0.5g葉片，用5ml3%磺基水揚酸溶液提取，勻漿液在沸水浴浸提10分鐘，冷卻后，以3000g離心10分鐘，上清液待測。2.取2ml待測液，加入2ml蒸儲水，再加入2ml冰乙酸和4ml2.5%功三酮溶液，置沸水溶顯色60min,冷卻后，加入4ml甲苯充分振蕩提取紅色物后，靜置后，取甲苯相（將移液槍的量程調(diào)至3.0ml吸取甲苯相，注意不要將槍伸到水相中。）測定520nm波長處的吸收值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算含量。8.2標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：1 .標(biāo)準(zhǔn)液配制；準(zhǔn)確稱取25mg脯氨酸，用蒸儲水溶解后定容至250ml,其濃度為100Pg/ml,再取10ml此液，蒸儲水定容至100ml,即為10口g?ml-1的脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。（脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液最好現(xiàn)用現(xiàn)配，放在冰箱也易變性）1標(biāo)準(zhǔn)脯氨酸 0（ml）H2O（ ml）2冰乙酸（ml） 2