laballiance培訓(xùn)教材

1、液相色譜培訓(xùn)教材 天津蘭博實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司 2011.04主要內(nèi)容v液相色譜儀的基本原理v液相色譜儀的操作過程與一般規(guī)則vLabAlliance 液相色譜儀組成與使用方法v常見使用故障及維護(hù)vLabAlliance液相系統(tǒng)在三聚氰胺檢測中的應(yīng)用 液相色譜儀的基本原理v早在年，俄國的植物學(xué)家茨維特將含有植物色素的石油醚溶液倒入一根內(nèi)部填充著碳酸鈣粉末的玻璃管中，再不斷用石油醚淋洗，隨著石油醚的不斷下降，玻璃管中形成了不同顏色的譜帶，從而成功地將不同的色素分離開來?！吧V”也就由此而得名。v淋洗用的石油醚稱為流動相，玻璃管中的碳酸鈣稱為固定相，玻璃管稱為色譜柱，后來這種方法廣泛地應(yīng)用于多種混合

2、物的分離，并成為一種很重要的儀器分析方法。v色譜法(chromatography)是一種物理、化學(xué)的分離、分析方法。它利用混合物各組分在互相接觸的固定相和流動相中有不同的分配比（或吸附能力的差異），當(dāng)兩相作相對運(yùn)動時，這些組分在兩相中多次反復(fù)分配平衡，從而使各組分得到分離，然后按順序被檢測。液相色譜儀原理示意圖流動相進(jìn)樣器色譜柱工作站時間檢測器v組分從色譜柱流出時，檢測器響應(yīng)信號大小隨時間變化所形成的曲線叫色譜圖，它是定性、定量分析和評價色譜分離情況的基本依據(jù)液相色譜儀需要了解的幾個概念液相色譜儀需要了解的幾個概念v保留時間（tR）：自進(jìn)樣至出現(xiàn)色譜峰最高點(diǎn)所用的時間，稱為保留時間，以分鐘Mi

3、n為單位v峰高（h）： 色譜峰頂點(diǎn)與基線之間的垂直距離。以mv或mAu表示。v峰面積（）： 由峰和峰底之間圍成的面積。峰面積被用作定量分析的指標(biāo)。v理論塔板數(shù)(TP)：色譜的柱效參數(shù)之一,用于定量表示色譜柱的分離效率v液相色譜儀的操作過程與注意事項(xiàng)液相色譜分析流程-開機(jī)平衡1.開機(jī)：依次打開泵、檢測器、柱溫箱、自動進(jìn)樣器、工作站電源，在電腦上雙擊工作站圖標(biāo)進(jìn)入工作站主界面。2.用5%甲醇（或5%乙腈）沖洗色譜柱15分鐘3.換上流動相，設(shè)定好參數(shù)（波長，柱溫，流速，采樣時 間等）后開泵，平衡系統(tǒng)大約30分鐘到小時三聚氰胺1. 對于三聚氰胺的檢測，波長設(shè)為240nm,柱溫400C,流速1.0ml/

4、min，采樣時間設(shè)為20-30min（根據(jù)出峰時間而定）2. 平衡時間以基線走平為準(zhǔn)，只要基線平直就可以運(yùn)行進(jìn)樣程序。液相色譜分析流程-進(jìn)樣分析1.按國標(biāo)要求進(jìn)不同濃度標(biāo)樣，得到一系列譜圖，用濃度與峰面積的值導(dǎo)出線性方程。計算該線性方程的R2值2.進(jìn)處理好的樣品。得樣品峰譜圖。3.將樣品峰面積代入線性方程和國標(biāo)公式，計算含量。得到樣品中被測物的含量。液相色譜分析流程-沖洗系統(tǒng)1.進(jìn)完樣品后，將流動相換成5%甲醇水溶液沖柱1小時，目的是為了徹底洗去系統(tǒng)中殘留的緩沖鹽2.將5%甲醇水溶液換成100%甲醇沖洗30分鐘。3.停泵，關(guān)機(jī)，關(guān)電源。液相色譜分析流程-沖洗系統(tǒng)注意：1. 做完實(shí)驗(yàn)后系統(tǒng)中存在

5、含鹽流動相的情況下，萬萬不可直接將甲醇或乙腈導(dǎo)入系統(tǒng)中，因?yàn)榇蟛糠志彌_鹽在甲醇或乙腈中是不溶的，從而導(dǎo)致鹽析出，損壞儀器。2. 用5%甲醇而不用純水是為了保護(hù)色譜柱。 液相色譜分析流程-三聚氰胺平衡，沖洗方法 針對三聚氰胺的流動相中含有的離子對緩沖鹽的情況，我們建議在做完實(shí)驗(yàn)之后用同樣比例不含鹽的乙腈：水=15:85或是10:90沖洗系統(tǒng)1小時，然換成50：50的乙腈：水沖洗30分鐘后關(guān)機(jī)，再次做實(shí)驗(yàn)時，直接用流動相平衡系統(tǒng)即可。長時間不用時，再用純甲醇沖洗，保存。操作注意事項(xiàng)-流動相1. 流動相須現(xiàn)用現(xiàn)配。2. 使用HPLC級或相當(dāng)于該級別的流動相，并要先經(jīng)0.45m薄膜過濾。3. 如有仍有

6、氣泡產(chǎn)生，還需超聲15分鐘。4. 在使用儀器過程中，注意貯液瓶里的流動相是否夠用，在一次分析中，不要加注流動相，加注或更換后需重新平衡。操作注意事項(xiàng)-電源1. 電壓需保持穩(wěn)定，配3KW凈化穩(wěn)壓電源防止電壓不穩(wěn)對儀器造成傷害。2. 地線。必須確保獨(dú)立地線已連接好，否則會增加基線噪聲，造成靈敏度下降，甚至無法分析。3. 不能短時間內(nèi)反復(fù)開關(guān)機(jī)。尤其是紫外檢測器，兩次開關(guān)機(jī)時間間隔5分鐘以上。4. 由于液相色譜組件較多，請選用質(zhì)量較好的接線板，防止虛接造成瞬間電流過大，損壞儀器。操作注意事項(xiàng)- 色譜柱1、色譜柱的保存 （1）反相色譜柱每天實(shí)驗(yàn)后的保養(yǎng)：使用緩沖液或含鹽的流動相，實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)用5%的甲

7、醇/水沖洗60分鐘，洗掉色譜柱中的鹽，再用甲醇沖洗30分鐘。注意：不能用純水沖洗柱子，應(yīng)該在水中加入5%的甲醇。 （2）長期保存色譜柱：如色譜柱要長時間保存，必須存于合適的溶劑下。對于反相柱可以儲存于純甲醇或乙腈中，正相柱可以儲存于嚴(yán)格脫水后的純正己烷中，離子交換柱可以儲存于水（含防腐劑疊氮化鈉或柳硫汞）中，并將購買新色譜柱時附送的堵頭堵上。儲存的溫度最好是室溫。操作注意事項(xiàng)- 色譜柱2. 更換色譜柱時，需將管子完全插入開口端，直至其與開口端的末端相碰為止。否則將產(chǎn)生死體積，引起峰展寬，或是肩峰。 操作注意事項(xiàng)-自清洗液v在線自清洗。在線自清洗是SSI的專利設(shè)計 ，其的作用的是為了自動清潔泵頭

8、柱塞，延長其使用壽命，自清洗液為20%的甲醇溶液，在用含鹽流動相時，建議每三天更換一次，不含鹽時每周換一次，達(dá)到最好的清洗效果。小結(jié)：v必須嚴(yán)格按照上述操作規(guī)程進(jìn)行操作，才能避免損壞儀器。vLabAlliance 液相色譜儀組成與使用方法液相色譜儀原理示意圖 高效液相色譜系統(tǒng)v 泵泵 v 進(jìn)樣器v 色譜柱（柱溫箱）v 檢測器v 工作站v 柱后衍生裝置液相色譜泵外觀圖高壓自清洗泵調(diào)節(jié)流速開泵/關(guān)泵模式切換出口單向閥入口單向閥泵頭旁通閥出口過濾器泵面板上的操作按鍵泵的開啟和關(guān)閉增加流量減小流量最大流速沖洗泵，禁用。流速，壓力，高壓，低壓限制的設(shè)定切換泵頭演示圖泵頭剖面圖 泵 進(jìn)樣器進(jìn)樣器 色譜柱（

9、柱溫箱） 檢測器 工作站 柱后衍生裝置手動進(jìn)樣器 泵 進(jìn)樣器 色譜柱色譜柱 檢測器 工作站 柱后衍生裝置色譜柱固定相分子結(jié)構(gòu)色譜柱類型 泵 進(jìn)樣器 色譜柱（柱溫箱） 檢測器檢測器 工作站 柱后衍生裝置201+檢測器操作界面201+檢測器的菜單vSIGNAL 菜單v vsignal: 0.0000v:254 t:0.2 ONvv信號菜單或主菜單包涵信號強(qiáng)度signal:, 波長 :, 時間常數(shù)t: 和燈的狀態(tài)。v實(shí)際測量的信號值顯示為一個帶四位小數(shù)的數(shù)字。測量波長: 可以在 190 至 740 納米區(qū)間，變動精度為一個納米。v使用時間常數(shù)t: 您可以使信號更平滑。它的值可以被設(shè)置為0.1, 0.

10、2, 0.5, 1, 2, 5, 或10 秒. 這個值設(shè)置得越大，信號就越平滑。時間常數(shù)為1秒時一般是作分析時的最佳值。v最后您可以在這個菜單開關(guān)燈，分別用ON和 OFF 按鈕。201+檢測器的菜單vUNITS菜單vvUNITS signal: auv :nm t:sv v這個菜單僅作信息顯示用，不能改變。顯示的是信號菜單中各個值的單位。201+檢測器的菜單vSCAN 菜單vvSCAN: 620-740 -Fvgo AZ speed:0Hz vv您可以在停止流通模式作掃描。有四種掃描速率供選擇。掃描范圍可以設(shè)置，此前可以先自動歸零。截止濾波器可以啟用(+F) 或無效 (-F). 201+檢測器

11、的菜單vPROG 菜單 vvPROG 000.00-254 vgo 000.00-vvPROG菜單可以輸入一個可以改變波長的時序程序。 如何輸入和執(zhí)行一個程序的方法將在“輸入一個程序”部分詳述。程序包括起始和結(jié)束行最多可以包括11行。201+檢測器的菜單vINT菜單 vv這個菜單僅作信息顯示用，不能改變。v vINT sig:0.6543 v1/8 ref:0.3848v vsig 和 ref的值分別記錄信號的強(qiáng)度和參比信道。sig 和 ref值的范圍在0和1之間。它們依賴于所選的波長，使用的溶劑、流通池和燈的使用年限。兩者值的比率應(yīng)該在1:1.5和1:1.8之間。 如出入較大則說明有可能流通

12、池臟了或者是溶劑在所選波長處吸收過強(qiáng)。201+檢測器的菜單vEXT. CONTROL菜單vvEXT. CONTROL:v keyboardv v此菜單可選擇控制模式，外部儀器(external control = analog)或單機(jī)模式（選擇鍵盤）。201+檢測器的菜單vANALOG OUT 菜單vvANALOG OUT: auvfull scale: 1e-0vvANALOG OUT菜單是用來標(biāo)定模擬輸出信號的。 一般說來最大輸出信號是1 V. 根據(jù)實(shí)際情況您可以決定對于這個信號的最大值用多大的單位和相應(yīng)的滿量程偏差?？梢赃x擇1e-4, 2e-4, 5e-4, 1e-3, 2e-3, 5e

13、-3, 1e-, 2e-2, 5e-2, 1e-1, 2e-1, 5e-1, 1e-0, 2e-0, 5e-0 或 1e+1 單位 (分別對應(yīng)于 0.0001, 0.0002, 0.0005, 0.001, 0,002 0.005, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 和 10)。201+檢測器的菜單vLAMP 菜單vvLAMP: v Deuteriumv這個菜單用于輸入適用于軟件的燈的類型。選項(xiàng)有氘燈（Deuterium）和鹵（Halogen）燈。 v如果確實(shí)更換了燈的類型，設(shè)置才可以改變。如果設(shè)置和實(shí)際裝備不符，儀器將無法正確地工作。201+

14、檢測器的菜單v-RANGE/FILTER菜單 vv-RANGE: 190-740 v ? FILTER:380 vv波長范圍可以被限制為標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置。然后在此范圍內(nèi)的選值。大于380納米時可用一邊緣濾波器來增大選擇性。在這種情況下要注意靈敏度的降低問題。201+檢測器的菜單vA-IN 菜單v vA-IN Set-Zero v actual 000nm v vA-IN-(Analog-IN) 菜單是用來調(diào)整模擬輸入的。使Set-Zero 有效意味著輸入端的電壓信號為000納米。例如當(dāng)在輸入施以一5V電壓時，actual欄將顯示500nm作為波長值。 假設(shè)1V = 100 nm, 500 nm. 生成

15、另一個校準(zhǔn)點(diǎn)，可用波長 或 鍵改變波長值。201+檢測器的菜單vGLP菜單vvGLP S/N:00047755 v01 00962.Oh 101vvGLP菜單包涵了下列信息： 序列號，所用燈的總數(shù)，當(dāng)前燈的總工作時間和啟動燈的數(shù)量。 泵 進(jìn)樣器 色譜柱（柱溫箱） 檢測器 工作站工作站 柱后衍生裝置工作站界面圖采集步驟設(shè)定方法打開工作站在主界面中設(shè)置 “譜圖采集參數(shù)”- “采集時間選項(xiàng)此選項(xiàng)設(shè)置要與自動自樣器保持一致。開啟自動進(jìn)樣程序數(shù)據(jù)處理-打開譜圖1. 打開標(biāo)樣譜圖點(diǎn)擊文件-打開命令在彈出的對話框中選擇標(biāo)樣的譜圖文件 數(shù)據(jù)處理-設(shè)定積分參數(shù)1. 在打開的譜圖最前端點(diǎn)擊右鍵 。在彈出的對話框中

16、選”自動生成譜圖處理表項(xiàng)”-“開始禁止判峰（刪除起點(diǎn)）“數(shù)據(jù)處理-設(shè)定積分參數(shù)1. 在我們需要的峰的前面點(diǎn)擊自動生成譜圖處理表項(xiàng)-開始”峰分離處理（谷點(diǎn)改終點(diǎn)）“自動判峰積分?jǐn)?shù)據(jù)處理-設(shè)定積分參數(shù)v。完成時，我們所需要的峰已積分。譜圖處理表項(xiàng)中已自動填入?yún)?shù)。數(shù)據(jù)處理-設(shè)定組分表1. 在峰的內(nèi)部點(diǎn)面擊右鍵選擇“自動填寫定量組份表中時間-套峰時間2. 此時套峰時間中會自動填入峰的保留時間3. 填入組分名稱，濃度值數(shù)據(jù)處理-定量計算1. 點(diǎn)擊”定量方法“表項(xiàng)，選擇”計算校正因子“2.點(diǎn)擊定量計算按鈕數(shù)據(jù)處理-查看計算結(jié)果計算結(jié)果將顯示在上圖中。點(diǎn)擊”當(dāng)前表存檔。即保存了當(dāng)前的數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)處理-制作工

17、作曲線v不斷重復(fù)上述過程，將不同濃度的標(biāo)樣全部處理過后，進(jìn)入存檔。v點(diǎn)擊“定量方法”表項(xiàng),選擇“工作曲線”-計算按鈕v點(diǎn)擊顯示,即可顯示出工作曲線。數(shù)據(jù)處理-基于工作曲線的樣品含量計算打開樣品譜圖，積分，設(shè)定組分（按前述方法）選擇多點(diǎn)柆正乘數(shù)1：定容體積乘數(shù)2：稀釋倍數(shù)除數(shù)： 稱樣量輸入完畢后，點(diǎn)擊定量計算數(shù)據(jù)處理-結(jié)果顯示最終含量在此顯示報告打印點(diǎn)擊打印機(jī)圖標(biāo)，打印報告報告打印-通過word 或是寫字板 泵 進(jìn)樣器 色譜柱（柱溫箱） 檢測器 工作站 柱后衍生裝置柱后衍生裝置柱后衍生系統(tǒng)PCR 主要應(yīng)用領(lǐng)域主要應(yīng)用領(lǐng)域 氨基甲酸酯 草甘膦 黃曲霉毒素 氨基酸 （OPA） 氨基酸 （Ninhyd

18、rin）小結(jié)： 常用的液相色譜由以上幾部分組成。熟悉每個組件的功能與作用，能夠幫助我們對使用中出現(xiàn)的問題進(jìn)行正確的判斷與排查。v常見使用故障及維護(hù)檢查指標(biāo)v每日檢查，記錄：v1. 泵壓力，保留時間是否穩(wěn)定v2. 峰面積與濃度的比值v每周檢查：v1. 線性v2. 重復(fù)性v3. 標(biāo)準(zhǔn)品有效性壓力過大v1. 是否是剛剛換上流動相，未平衡，多等10分鐘看壓力是不是已經(jīng)下降。同時檢查流動相配比是否正確，是否已過濾，混勻。v2. 若壓力一直很穩(wěn)定，停泵，待壓力降下來后，拆下色譜柱與檢測器聯(lián)接，開泵，看是否有壓力下降，若降到正常范圍之內(nèi)，則可以判斷檢測池堵塞（給廠家致電）；若沒有下降，此時要完全拆下柱子，開泵，此時若沒有壓力，則柱子堵塞，需更換，或此時仍有200以上的壓力，說明泵出口過濾器堵塞，可以將出口過濾器拆下超聲清洗即可。壓力低，波動大v壓力比正常值低，且不穩(wěn)定時1.仔細(xì)檢查是否有漏液的現(xiàn)象。2. 檢查進(jìn)液管中是否進(jìn)氣泡。2. 單向閥被污染。超聲清洗處理3. 柱塞密封漏液，更換密封面積/濃度比異常檢查