泛素-蛋白酶體途徑的組成和功能

1、泛素-蛋白酶體途徑的組成和功能*倪曉光趙平(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所,北京100021摘要泛素-蛋白酶體途徑是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)選擇性降解的重要途徑,泛素分子主要通過泛素活化酶、泛素結(jié)合酶和泛素-蛋白連接酶與靶蛋白結(jié)合形成一條多泛素鏈,最后被26S蛋白酶體識別和降解。泛素-蛋白酶體途徑參與細(xì)胞內(nèi)的多種活動過程,包括細(xì)胞凋亡、MHC I類抗原的遞呈、細(xì)胞周期以及細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo),與細(xì)胞的一些生理功能和病理狀態(tài)有著密切的聯(lián)系。本文主要對組成泛素-蛋白酶體途徑的各成分作一綜述。關(guān)鍵詞泛素;蛋白酶體;泛素化;蛋白降解中圖分類號Q519;R329.2泛素-蛋白酶體途徑由泛素(ubiqui

2、tin,Ub、泛素活化酶(ubiquitin-activating enzyme,E1、泛素結(jié)合酶(ubiquitin-conjugating enzymes,E2s、泛素-蛋白連接酶(ubiquitin-protein ligases,E3s、26S蛋白酶體和泛素解離酶(deubiquitinating enzymes, DUBs等組成,其對靶蛋白的降解是一種級聯(lián)反應(yīng)過程(圖1。泛素首先在E1催化下,其C-末端甘氨酸殘基與E1的半胱氨酸殘基間形成高能硫酯鍵而獲得活性。E1-泛素結(jié)合的中間體再將泛素轉(zhuǎn)移給E2,形成E2-泛素中間體。最后靶蛋白的泛素化還需要另一個特異的泛素蛋白連接酶E3s。E3

3、s可以直接或間接與底物結(jié)合,促使泛素從與E2s形成的硫酯中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到靶蛋白賴氨酸殘基的氨基基團上,形成異肽鍵(isopeptide bond。當(dāng)?shù)谝粋€泛素分子連接到靶蛋白上后,另外一些泛素分子在E3s的催化下相繼與底物相連的泛素分子的第48位賴氨酸殘基相連,形成一條多聚泛素鏈,作為底物被蛋白酶體識別和降解的靶向性信號。完成泛素化的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被展平進(jìn)入26S蛋白酶體,在20S催化中心中被降解,泛素分子可被DUBs從底物上水解下來,重復(fù)利用1。本文主要對組成泛素-蛋白酶體途徑的各成分作一綜述。圖1 蛋白質(zhì)經(jīng)泛素-蛋白酶體途徑降解示意圖一、泛素(Ub泛素是1975年由Goldstein首先發(fā)現(xiàn)的一

4、種在真核生物細(xì)胞內(nèi)高度保守的多肽,單個泛素分子由76個氨基酸組成,分子量約8.5kD。泛素分子緊密折疊成球形,5股混合的片層形成一個腔樣結(jié)構(gòu),內(nèi)部對角線位置有1個螺旋,這個結(jié)構(gòu)稱為泛素折疊。這個小蛋白含有一個明顯的疏水核心和大量的氫鍵,表現(xiàn)出特殊的穩(wěn)定性,能夠防止在結(jié)合和靶向性降解循環(huán)中變性失活,從而保證泛素循環(huán)的運行。從泛素折疊中突出來的是具有一定變形性的C 末端延伸部分,這個末端第76位含有一個必須的甘氨酸。泛素與其它蛋白都是通過C-末端第76位甘氨酸來連接的。二、泛素活化酶(E1E1是泛素與底物蛋白結(jié)合所需要的第一個酶,但是對靶蛋白的特異性卻幾乎沒有影響。E1是一種廣泛表達(dá)的多肽,大約1

5、100個氨基酸,含有位置固定的保守的半胱氨酸殘基。E1有2個亞型,是由同一個mRNA在不同的起始位點翻譯而成的,存在于細(xì)胞漿和細(xì)胞核中。酵母的E1基因失活后是致命的,說明這個蛋白對于細(xì)胞的生存是至關(guān)重要的(Stephen等.1996。E1可以水解ATP,與泛素的羧基末端形成高能硫酯鍵而激活泛素。在真核生物這個激活反應(yīng)由兩步構(gòu)成:起始形成泛素-腺苷酸中間物,接下來這個中間物與E1半胱氨酸殘基發(fā)生反應(yīng)形成E1-Ub硫酯鍵。通常一個泛素分子有一*國家自然科學(xué)基金(30500582和“十五”國家科技攻關(guān)計劃(2004BA703B11資助課題 個單獨的E1。E1具有高度的催化效能,在低濃度的情況下就能夠

6、激活泛素,滿足下游的級聯(lián)反應(yīng)過程(Pickart.2001。三、泛素結(jié)合酶(E2s級聯(lián)反應(yīng)的第二步是泛素分子經(jīng)過轉(zhuǎn)硫醇反應(yīng)從E1半胱氨酸殘基轉(zhuǎn)移給E2s活化的半胱氨酸位點。E2s在哺乳動物中至少有25個基因,所有的E2s都含有一個保守的大約150個氨基酸的核心結(jié)構(gòu)域,在結(jié)構(gòu)域的中央是決定E2s活性的半胱氨酸殘基,位于蛋白表面淺的裂隙內(nèi)(Hamilton等. 2001。E2s家族中的一小部分成員只含有這個核心結(jié)構(gòu),但是其它的大部分成員還有N-或C-末端的延伸,這種結(jié)構(gòu)可能與E3s的識別、E2s自身的活性以及底物識別有關(guān)。E1和E3s通過相同的基序與E2s連接,這說明在反應(yīng)循環(huán)過程中,E2s必須在

7、E1和E3s之間穿梭往返運行。因此為了保證在激活的泛素與數(shù)量巨大的E3s之間得到平衡的分布,需要多個E2s異構(gòu)體。E2s/Ub非共價結(jié)合的親和力非常低,說明其在轉(zhuǎn)移泛素分子到靶蛋白上起著重要的作用。四、泛素-蛋白連接酶(E3s泛素化途徑最重要的特征就是底物的多樣性和選擇性,這一功能由E3s直接決定。目前主要有3種類型的E3s,即含有HECT(homologous to E6-as-sociated protein carboxyl terminus結(jié)構(gòu)域的E3s、含有環(huán)指狀(RING finger結(jié)構(gòu)域的E3s和含有U-box 結(jié)構(gòu)域的E3s2。在高等生物E3的總數(shù)從幾百到一千以上,新的E3亞

8、家族仍不斷被發(fā)現(xiàn)。正是由于這些復(fù)雜多變的E3s家族成員可以對不同的底物進(jìn)行特異性的識別,才呈現(xiàn)出蛋白降解的高度選擇性。(一含有HECT結(jié)構(gòu)域的E3s HECT E3s的命名是因為其C-末端含有一段大約350個氨基酸的區(qū)域與E6-AP(E6-associated protein的C-末端同源。HECT E3s催化轉(zhuǎn)硫醇反應(yīng)將E2s中的泛素轉(zhuǎn)移給HECT結(jié)構(gòu)域內(nèi)的保守的半胱氨酸殘基。E6AP-HECT/UbcH7復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)顯示HECT 結(jié)構(gòu)域呈L形,活性位點位于L形的拐彎處(Huang 等.1999。游離的HECT結(jié)構(gòu)域與E2s有較強的相互作用,E2s結(jié)合位點位于L形基底部的末端。HECT結(jié)

9、構(gòu)域的缺失不影響底物的結(jié)合,高度可變的N末端結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)對特異底物的識別和結(jié)合。(二含有環(huán)指狀結(jié)構(gòu)域的E3s 其特征是含有一個保守的組氨酸和半胱氨酸殘基復(fù)合體,在其中心有2個Zn2+離子。RING E3s沒有直接催化蛋白泛素化的作用,其作為一個?？课稽c將靶蛋白和E2s聚集在一起,然后介導(dǎo)泛素的轉(zhuǎn)移而不是與泛素形成硫酯鍵。含有環(huán)指狀結(jié)構(gòu)域的E3s可被分成2種類型,一種是單個蛋白,其代表是作為P53的E3s的MDM2(mouse double minute2癌蛋白(Hon-da等.2000以及作為受體酪氨酸激酶如表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EG

10、FR和血小板衍生因子受體(platelet-derived growth factor receptorE3s的c-Cbl(Tsygankov等.2001。另一種是多蛋白組成的復(fù)合體,包括SCF(Skp1-Cullin/ Cdc53-F-box-Rbx1、有絲分裂后期促進(jìn)復(fù)合物(an-aphase promoting complex,APC和VBC-Cul2復(fù)合體(the von-Hippel-Lindau-elongins B and C-Cul2 complex。SCF E3s是至少有4種多肽組成的復(fù)合體。被命名為SCF是因為其中的三個核心亞基(Skp1、Cul-lin/CDC53和一個F

11、-Box蛋白。后來第四個亞基Rbx1(RING box1protein被發(fā)現(xiàn),其含有一個RING H2-型結(jié)構(gòu)域。在SCF E3s中的Rbx1能夠集合E2,Cullins蛋白作為Rbx1與蛋白之間的支架參與底物的選擇性。底物的識別由底物特異性的F-box蛋白所介導(dǎo),F-box本身被SCF E3s復(fù)合體中的Skp1接頭因子所識別和聚集。Skp1與Cullins結(jié)合,因此將底物和泛素并列排開。F-box蛋白的特征是含有一個大約40個氨基酸的基序,最初在細(xì)胞周期蛋白F中鑒定出來。人類含有大量的F-box蛋白,可以分成不同的亞類,在多數(shù)情況下F-box蛋白結(jié)合磷酸化的蛋白質(zhì)。如SCF E3s通過引起p

12、27和cdc25的快速降解來調(diào)節(jié)細(xì)胞周期3。APC的核心顆粒至少含有13個亞基,最初發(fā)現(xiàn)在降解Cyclin的過程中起著重要作用。隨后研究發(fā)現(xiàn),其具有控制在有絲分裂進(jìn)展和結(jié)束過程中起著至關(guān)重要的一些因子的半衰期的功能4。APC中的2個亞基APC2和APC11分別與SCF E3s復(fù)合體中的Cullin1和Rbx1相關(guān),推測APC2可能具有連接其它亞基的作用,而APC11則具有結(jié)合Ub-E2s中間體的作用。von-Hippel Lindau(VHL腫瘤抑制因子蛋白E3復(fù)合體與SCF型復(fù)合體有所不同,其核心區(qū)有Rbx1和Cul2A結(jié)構(gòu),然而Skp1被轉(zhuǎn)錄延伸因子B/C所代替。轉(zhuǎn)錄延伸因子B/C復(fù)合體能

13、夠調(diào)節(jié)VHL與其它蛋白的相互作用,包括RNA聚合酶II延長因子A和細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制分子(suppressors ofcytokine signalling,SOCS盒裝蛋白。這種復(fù)合體與靶蛋白特異結(jié)合的方式雖然簡單,但是效率卻很高(Kim等.2003。(三含有U-box結(jié)構(gòu)域的E3s U-box E3s是一個相對較小的E3s家族,在結(jié)構(gòu)上與RING結(jié)構(gòu)域相似(Ohi等.2003,因此有的人將U-box E3s與環(huán)指狀結(jié)構(gòu)域的E3s歸為一類。在一些情況下多泛素鏈的形成還需要泛素鏈延長因子的輔助,人們將具有這類功能的酶命名為E4s。U-box家族成員具有E4s的特點。第一個被鑒定的E4s家族是

14、泛素融合降解蛋白(ubiquitin fusion degradation2,UFD2,其特征是C末端含有一個大約70個氨基酸的保守的U-box,在結(jié)構(gòu)上與RING-finger E3s相關(guān),能與含有13個泛素分子的底物結(jié)合,催化其它的泛素分子附加到底物上,形成含有多泛素鏈的底物。U-box 家族的另一個成員是與熱休克蛋白70碳末端相互作用蛋白(C terminus of Hsc70-interacting protein, CHIP,在降解途徑中作為泛素鏈延長因子與另外的E3s協(xié)同作用,能夠結(jié)合伴侶分子識別的異常或錯誤折疊的蛋白質(zhì),導(dǎo)致他們被26S蛋白酶體所降解,是另一個含有U-box的具有

15、E4功能的蛋白質(zhì)。目前還不清楚是否含有U-box結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)都具有E4s的活性5。(四E3s與靶蛋白多聚泛素鏈的形成靶蛋白的泛素鏈最少需要四個泛素分子的長度才能夠被蛋白酶體有效降解。關(guān)于靶蛋白的泛素鏈?zhǔn)侨绾涡纬傻倪€不清楚,推測可能存在以下4種模型6:(1有序增加模型(sequential addition model也稱為標(biāo)準(zhǔn)模型,即E3通過不同的結(jié)構(gòu)域(如RING E3s與E2和底物結(jié)合,形成E2-E3-底物復(fù)合體,E3促使與E2連接的泛素分子直接轉(zhuǎn)移到底物的賴氨酸殘基,然后E2-E3-底物復(fù)合體中的E2再接受來自E1分子傳遞的新的泛素分子,在E3的作用下將泛素分子直接轉(zhuǎn)移到與底物相連的第

16、一個泛素分子,接下來循環(huán)此過程,完成靶蛋白泛素鏈的組裝;(2指數(shù)模型(indexation model是指在形成E2-E3-底物復(fù)合體后,E2上的第一個泛素分子首先與E3s的HECT結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸活化位點結(jié)合,然后依次在此位置形成一條泛素鏈,最后泛素鏈從E3上轉(zhuǎn)移到底物的賴氨酸殘基;(3秋千模型(seesaw model是指E3與2個E2和底物形成復(fù)合體后,泛素鏈的組裝發(fā)生在2個E2的活化位點上,即一個E2上的泛素分子轉(zhuǎn)移到另一個E2上后,新轉(zhuǎn)移過來的泛素位于最底層直接與E2連接的位置,而原來與E2直接連接的泛素則與新轉(zhuǎn)移過來的泛素相連,依此從后向前的方式形成一條泛素鏈,最后泛素鏈直接從E2

17、轉(zhuǎn)移到底物上;(4雜和模型(hybrid model是指E2-E3-底物復(fù)合體形成后,E2上的泛素分子首先轉(zhuǎn)移到E3上,在E3上形成一條泛素鏈,然后泛素鏈按照E3&E1&E2&底物的傳遞順序連接到靶蛋白上。不同的E3s可能通過不同的機制組裝靶蛋白的多泛素鏈。五、泛素解離酶(DUBs雖然泛素與細(xì)胞內(nèi)快速降解的蛋白連接在一起,但是其本身卻是長壽命蛋白,這是由于泛素蛋白偶連物在水解之前DUBs將泛素從底物上解離下來。DUBs屬于蛋白酶超家族,根據(jù)其催化機制,可以分為5類(天門冬氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、蘇氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶,生物信息學(xué)研究顯示大約有79個有

18、功能的DUBs7,其中大部分為半胱氨酸蛋白酶。DUBs能夠識別最接近的泛素基序,特異性地在泛素和與其C末端最后一個殘基(Gly76相連的分子之間斷開(Amerik等. 2004。半胱氨酸蛋白酶型DUBs根據(jù)泛素-蛋白酶結(jié)構(gòu)域又可分為4個亞類:泛素特異性蛋白酶(USP、碳末端水解酶(UCH、卵巢腫瘤蛋白酶(OTU和MJD蛋白酶。金屬蛋白酶型DUBs的泛素-蛋白酶結(jié)構(gòu)域稱為JAMM(JAB1/MPN/Mov34 metalloenzyme(Amerik等.2004。半胱氨酸蛋白酶的活性信賴于活性位點中的一個半胱氨酸的硫醇基團。這個半胱氨酸在鄰近組蛋白的輔助下去質(zhì)子化,在一個天門冬氨酸殘基的作用下產(chǎn)

19、生極性,這三個氨基酸殘基構(gòu)成催化三聯(lián)體。在催化過程中,半胱氨酸表現(xiàn)出親質(zhì)子作用,攻擊靶蛋白與泛素之間易斷裂肽鍵的羰基端,結(jié)果將靶蛋白釋放出來,泛素與UDBs形成一個共價連接的中間體。中間體與水分子反應(yīng)釋放出游離的酶和泛素。六、26S蛋白酶體26S蛋白酶體是降解泛素化底物的一個ATP依賴型蛋白水解復(fù)合體,由20S核心蛋白酶(core pro-tease,CP和19S調(diào)節(jié)顆粒(regulatory particle,RP構(gòu)成。CP是由4個七聚體蛋白組成的環(huán)層疊在一起形成的一個空心圓柱體樣結(jié)構(gòu)(1-71-71-71-7,是26S蛋白酶體的水解核心?；钚晕稽c位于20S圓柱體空心結(jié)構(gòu)中心的2個環(huán)上,含有

20、胰蛋白酶、糜蛋白酶和谷氨酰樣肽水解活性,具有能夠使大多數(shù)肽鍵斷裂的能力(Voges等.1999。2個亞基的氨基末端封住蛋白水解腔隙的入口,對蛋白酶體CP的活性具有自身抑制作用,這樣只有進(jìn)入蛋白酶體圓柱體內(nèi)部的蛋白才能夠被水解。RP由基底(Base和蓋子(Lid兩個亞單位組成,分別與CP兩端的環(huán)相結(jié)合。基底亞單位是由6個相關(guān)的AAA-ATPases RPT1-6(regulatory particle triple-A protein和3個non-ATPase RPN(regulatory particle non-ATPase1、2和10組成的環(huán)狀結(jié)構(gòu),能夠活化20S核心顆粒(Glickman

21、等.1998。蓋子亞單位含有其余的non-ATPase(RPN3、5-9、11和12,是泛素依賴性蛋白降解所必須的(Fu等.2001。靶蛋白進(jìn)入蛋白酶體需要底物傳送蛋白的輔助,這些蛋白含有UBL或UBX(ubiquitin-like pro-tein和UBA(ubiquitin-associated結(jié)構(gòu)域,包括Rad23(radiation gene23、Dsk2(dominant suppressor of Kar2、Ddi1(DNA damage molecule-1和Shp1/ p47。Rad23、Dsk2和Ddi1的UBL結(jié)構(gòu)域能夠直接與26S蛋白酶體相互作用,然而Shp1/p47的U

22、BX 結(jié)構(gòu)域能夠與Cdc48/p97相互作用,通過Cdc48/ p97與蛋白酶體聯(lián)系在一起。目前多數(shù)的泛素化底物通過與RPN1/S2結(jié)合進(jìn)入蛋白酶體。另外,泛素化的靶蛋白能夠直接與RPN10/S5a和ATPase5 (RPT5/S6'/S6a結(jié)合。RPT5/S6'/S6a ATPase也能夠與VHL E3s中的VHL結(jié)合,因此底物與蛋白酶體的結(jié)合有許多直接和間接的機制。這些不同的機制為多種蛋白在蛋白酶體中提供了選擇性降解過程8。綜上所述,RP輔助識別和伸展適當(dāng)?shù)牡孜?裂解與Ub連接的共價鍵,開放-環(huán),然后伸展開的多肽直接進(jìn)入CP的腔內(nèi)被斷裂成6-10個氨基酸長度的片斷,最后在胞

23、漿中被水解成單個氨基酸。七、結(jié)語泛素-蛋白酶體途徑是細(xì)胞內(nèi)ATP依賴的蛋白質(zhì)選擇性降解的主要途徑,是真核細(xì)胞內(nèi)重要的蛋白質(zhì)質(zhì)控系統(tǒng),參與細(xì)胞凋亡、MHC I類抗原的遞呈、細(xì)胞周期以及細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生理過程,對維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)具有十分重要的意義9。該途徑在20世紀(jì)80年代初期首先被Avram Hershko、Aaron Ciechanover和Irwin Rose等幾位科學(xué)家所認(rèn)識,三人以此項成果共享2004年諾貝爾化學(xué)獎。經(jīng)過30年的研究,人們對泛素-蛋白酶體途徑的組成和在生物體內(nèi)的功能有了深刻的認(rèn)識,但是這遠(yuǎn)遠(yuǎn)還不夠,還有許多問題未被闡明,如E3s的組成及是如何被調(diào)節(jié)的?多聚泛素鏈?zhǔn)侨绾?/p>

24、聚集的?細(xì)胞是如何操作讓不同長度的泛素鏈修飾不同的蛋白質(zhì)? 26S蛋白酶體RP各個亞基的功能是什么?泛素-蛋白酶體途徑功能失常已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與多種疾病有重要的關(guān)系,已有研究顯示針對失常的關(guān)鍵環(huán)節(jié)設(shè)計藥物或基因的靶標(biāo),對疾病的治療起到了良好的效果10。相信隨著技術(shù)手段的進(jìn)步,泛素-蛋白酶體途徑會逐漸被揭示,從而豐富人們對人體生理狀態(tài)的了解和對疾病的認(rèn)識。參考文獻(xiàn)1 Smalle J,Vierstra RD.The ubiquitin26S proteasome prote-olytic pathway.Annu Rev Plant Biol,2004,55"555 590.2 Robinson PA,Ardley HC.Ubiquitin-protein ligases.J CellSci,2004,117"51915194.3 Zheng N,Schulman BA,Song L,et al.Structure of theCul1-Rbx1-Skp1-F boxSkp2SCF ubiquitin ligase complex.Nature,2002,416"703709.4 Passmore LA,Booth CR,Venien-Bryan C,et al.Structuralanaly