附子對(duì)慢性充血性心力衰竭模型大鼠NO、TNFα水平的影響

1、附子對(duì)慢性充血性心力衰竭模型大鼠NO、TNF水平的影響         【摘要】   目的探討附子抗心力衰竭的療效及作用機(jī)制。方法用SD大鼠50只，隨機(jī)分正常、空白對(duì)照組（簡(jiǎn)稱號(hào)組）、模型組(簡(jiǎn)稱號(hào)組）、地高辛組（簡(jiǎn)稱號(hào)組）、附子水煎劑低劑量組（簡(jiǎn)稱號(hào)組）、附子水煎劑高劑量組（簡(jiǎn)稱號(hào)組）。除正常對(duì)照組外均采用尾靜脈注射鹽酸阿霉素(ADR)損傷大鼠心肌致心力衰竭。各組分別用藥 治療 后，測(cè)定大鼠血清中TNF、NO水平，并光鏡觀察心肌的理變化。結(jié)果與正常對(duì)照組比較，心衰模型組大鼠血清中TNF、NO水平升高；與

2、心衰模型組比較，使用地高辛能顯著降低心衰模型大鼠血清中TNF、NO水平，差異顯著(P0.01)；而附子水煎劑高劑量、附子水煎劑低劑量則可輕度降低心衰模型大鼠血清中TNF、NO水平，兩組無(wú)明顯差異(P0.05),但這兩組跟地高辛組差異顯著(P0.01)。光鏡結(jié)果顯示附子水煎劑高劑量組、附子水煎劑低劑量組心肌細(xì)胞損傷度均輕于心衰模型組，而地高辛組心肌細(xì)胞損傷度明顯輕于心衰模型組。結(jié)論附子高、低劑量組能輕微改善心功能、減輕心衰癥狀，調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞因子水平，必要時(shí)應(yīng)復(fù)方使用，方能收到滿意的療效。 【關(guān)鍵詞】   附子 慢性充血性心力衰竭 NO TNF SD大鼠慢性充血性心力衰竭(CHF)

3、也稱慢性心力衰竭，是大多數(shù)心血管疾病的最終歸宿，也是最主要的死亡原因。近年來(lái)用附子單味藥治療多種原因引起的心力衰竭的研究較少，本實(shí)驗(yàn)旨在復(fù)制CHF動(dòng)物模型，從細(xì)胞因子水平探討附子水煎劑對(duì)實(shí)驗(yàn)性CHF大鼠的作用機(jī)制，為CHF的綜合治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1  實(shí)驗(yàn)材料 1.1  藥物  附子水煎劑高劑量組、附子水煎劑低劑量組。按傳統(tǒng)方法水煎，藥液濃縮成100，即每毫升含生藥0.1g，4 冰箱貯存?zhèn)溆?；鹽酸阿霉素(ADR)，山西普德藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20070603；地高辛，廣東邦民制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)060921，用蒸餾水稀釋成0.2mgml，滅菌后備用。1.

4、2  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物  WISTAR大鼠50只，雌雄各半，體重250300g，由重慶第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物所提供。1.3  主要試劑  一氧化氮(NO)試劑盒由上海貝西公司提供、(腫瘤壞死因子)TNF試劑盒由上海西唐生物科技有限公司提供。1.4  主要實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備  哺乳類動(dòng)物手術(shù)器械(手術(shù)刀、組織剪、有齒鑷、止血鉗、12號(hào)灌胃針、5ml注射器、4號(hào)頭皮針等)高速低溫冷凍離心儀( 中國(guó) 科技大學(xué)實(shí)業(yè)總公司中佳光學(xué)儀器公司)、低溫冰箱、 電子 秤(湖南儀器儀表總廠天平廠)。2  實(shí)驗(yàn)方法 2.1  動(dòng)物分組及造模 

5、取60只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后，隨機(jī)取10只(雌雄各半)作為號(hào)組(空白對(duì)照組)。尾靜脈注射等體積生理鹽水，給藥容積同鹽酸阿霉素。余50只大鼠用阿霉素造模，每kg次大鼠用4mg，每5天注射1次，共3次。末次ADR給藥24h后，隨機(jī)選取模型鼠2只，斷頭處死，取出心臟，用預(yù)冷0.9生理鹽水沖洗，取左室心肌部分，以10甲醛固定，HE染色，光鏡下觀察確認(rèn)造模成功后，再將所余大鼠隨機(jī)分為號(hào)組(心衰模型對(duì)照組)、號(hào)組(地高辛治療組)、號(hào)組(附子水煎劑低劑量組)、號(hào)組(附子水煎劑高劑量組)。各組均精飼料喂養(yǎng)，自由飲水。2.2  給藥方法  、組造模后次日開始灌胃給藥，連續(xù)給藥21d，附子

6、水煎劑低劑量組12 mlkg，、附子水煎劑高劑量組46mlkg，地高辛按1.6mgkg進(jìn)行，、組則以710mlkg的生理鹽水灌胃。2.3  觀察項(xiàng)目及檢測(cè)方法         3  實(shí)驗(yàn)結(jié)果 3.1  一般情況  整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，正常對(duì)照組(號(hào)組)大鼠毛色有光澤，雙眼靈活有神，行動(dòng)敏捷，對(duì)周圍變化靈敏。余50只大鼠在第1、2次尾靜脈注射ADR后先后出現(xiàn)癥狀，如活動(dòng)減少、蜷縮、納食減少、皮毛松軟、體重減輕等，此后癥狀呈逐漸加重趨勢(shì)，從第3次注射后出現(xiàn)程度不一的腹水，尿少便溏，唇周

7、青紫，雙耳蒼白，呼吸減弱，毛色枯槁、散亂豎起，脫毛，嚴(yán)重者行走不穩(wěn)，消瘦，口唇及雙耳發(fā)紺，個(gè)別開始死亡，至第3次ADR注射時(shí)，50只大鼠中死亡6只，取2只大鼠作造模測(cè)試，余42只大鼠隨機(jī)選分4組，組12只、組10只、組10只、組10只，雌雄各半。在用藥階段組又死亡4只，組死亡2只，組死亡3只，組死亡3只，故完整觀察到40只，其中組10只，組8只，組8只，組7只，組7只。隨后實(shí)驗(yàn)期間，用藥組大鼠不再死亡，存活大鼠癥狀有明顯改善，組癥狀改善比和組明顯，而心衰模型組癥狀無(wú)明顯改善。3.2  大鼠TNF、NO含量變化的測(cè)定  模型組血清TNF、NO水平明顯高于正常對(duì)照組及各 治療

8、組，與兩用藥組比較有學(xué)意義(P0.01)；附子水煎劑高劑量組與附子水煎劑低劑量組之間無(wú)明顯差異(P0.05)，但兩組與地高辛組之間差異顯著(P0.01)，見表1。表1  各組大鼠NO、TNF含量變化（略）與正常組比較，P0.01、P0.05；與心衰模型組比較P0.01；與地高辛組比較，P0.013.3  病理改變  光鏡下可見正常組心肌細(xì)胞形態(tài)、胞質(zhì)、間質(zhì)及橫(縱)紋均為正常，但心衰模型組存在心肌細(xì)胞橫(縱)紋不清，部分區(qū)域肌質(zhì)纖維溶解，胞漿空泡變性，不同程度的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和問(wèn)質(zhì)水腫病變表現(xiàn)。附子水煎劑低劑量組、附子水煎劑高劑量組、地高辛組以上病變較心衰模型有明顯

9、減輕，心肌細(xì)胞橫(縱)紋存在。4  討論 本實(shí)驗(yàn)利用鹽酸阿霉素的心肌毒性作用制備CHF模型。阿霉素是常用的廣譜抗腫瘤藥，具有引起心臟損害的嚴(yán)重毒性作用，主要損傷心肌細(xì)胞，引起類似擴(kuò)張性心肌病樣病理、生理改變和在此基礎(chǔ)上的心力衰竭。使用阿霉素建立CHF模型成功率高，技術(shù)難度不大，適合研究衰竭心臟心超微結(jié)構(gòu)改變、神經(jīng)內(nèi)分泌異常等1。附子的功效是回陽(yáng)補(bǔ)火、散寒除濕、溫中止痛2。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看附子單用治療CHF，效果沒有地高辛組明顯，有報(bào)道3：四逆湯能顯著降低阿霉素致心力衰竭大鼠血清BNP和IL6水平，及CHF心肌細(xì)胞損傷程度，從而改善心功能、減輕心衰癥狀、降低死亡率。提示四逆湯不僅能直接加強(qiáng)

10、心肌收縮力、擴(kuò)張外周血管、減輕前后負(fù)荷、改善心臟舒縮功能，而且具有調(diào)節(jié)改善心衰大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌功能的作用。因而可治寒邪深入少陰所致的陽(yáng)虛寒厥證。附子有抗休克、強(qiáng)心，抗心肌缺血缺氧，能興奮垂體腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)、抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)及提高免疫功能等作用。但其組方四逆湯效更顯。NO在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮作用的可能機(jī)制是通過(guò)提高細(xì)胞中鳥苷酸環(huán)化酶（guanylate cyclase, GC）的活性，促進(jìn)磷酸鳥苷環(huán)化產(chǎn)生環(huán)一磷酸鳥苷（guanosine 3, 5-cyclic monophosphate cGMP），使細(xì)胞內(nèi)cGMP水平增高，繼而激活依賴cGMP的蛋白激酶對(duì)心肌肌鈣蛋白的磷酸化作用加強(qiáng)，肌鈣蛋白c對(duì)

11、Ca2+的親合性下降，肌細(xì)胞膜上K+通道活性也下降，從而導(dǎo)致血管舒張。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常對(duì)照組、地高辛組大鼠NO含量均顯著低于附子水煎劑低、高劑量組和心衰模型組，說(shuō)明地高辛能有效地降低血清NO水平，增強(qiáng)心肌收縮力、保護(hù)血管、心肌細(xì)胞，而單味附子效不顯。地高辛組和附子水煎劑低、高劑量組差異明顯(P0.01)。TNF的局部升高可直接影響心功能，與心衰的發(fā)生有關(guān)。它導(dǎo)致的心肌機(jī)能障礙包括鈣平衡的改變，直接的細(xì)胞毒作用，氧化張力、興奮-收縮耦聯(lián)的破壞，心肌細(xì)胞凋亡和壞死，心肌細(xì)胞丟失及被非心肌細(xì)胞取代，心室腔擴(kuò)大,纖維結(jié)締增生等構(gòu)，心肌重塑的特征性改變。CHF時(shí)心臟本身合成釋放TNF是其重要來(lái)源之一

12、。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示正常對(duì)照組、地高辛組大鼠TNF含量均顯著低于心衰模型組和附子水煎劑低、高劑量組(P0.01)，說(shuō)明地高辛能有效地降低血清TNF水平，保護(hù)血管、心肌細(xì)胞，而單味附子效不顯。地高辛組和附子水煎劑低、高劑量組差異顯著(P0.01)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)照組用藥地高辛屬洋地黃類強(qiáng)心劑，是目前治療CHF的常用藥物。強(qiáng)心苷對(duì)主要由紊亂導(dǎo)致的心衰療效欠佳，如縮窄性心包炎、主動(dòng)脈瓣狹窄、竇性心律的二尖瓣狹窄、肥厚型心肌病等。而對(duì)收縮功能抑制狀態(tài)的療效較好。在竇性心律的心衰患者，停用地高辛，仍用利尿劑者未見心衰惡化；停用地高辛，繼續(xù)使用擴(kuò)血管藥及利尿劑者在臨床及左心射血分?jǐn)?shù)、每分鐘搏出量等與使用地高辛?xí)r無(wú)顯著變化。若地高辛通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度而產(chǎn)生正性肌力作用，則在長(zhǎng)期用藥后，細(xì)胞內(nèi)Ca2+和Na+將恢復(fù)到正常水平，地高辛的正性肌力作用將減弱或消失，因此竇性心律的心衰患者維持量地高辛2個(gè)月以上時(shí)，停用地高辛不會(huì)引起病情惡化。經(jīng)血流動(dòng)力學(xué)研究證實(shí)長(zhǎng)期服用維持量地高辛治療慢性心衰有效。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，附子水煎劑組降低阿霉素致心力衰竭大鼠血清TNF、NO水平及CHF心肌細(xì)胞損傷程度不顯著，提示附子單味附子不能直接加強(qiáng)心肌收縮