螺旋藻多糖對(duì)HSV

1、螺旋藻多糖對(duì)HSV                 【摘要】 目的 探討鈍頂螺旋藻多糖(PSP)對(duì)HSV-2糖蛋白gB mRNA表達(dá)的影響及其機(jī)制，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)該藥提供理論依據(jù)。方法 以不同劑量的PSP作用于HSV-2感染的Vero細(xì)胞，應(yīng)用地高辛標(biāo)記寡核苷酸探針，檢測(cè)HSV-2糖蛋白gB mRNA的表達(dá)。結(jié)果 PSP作用組HSV-2糖蛋白gB mRNA的表達(dá)顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組(P0.01)。結(jié)論 PSP抗HSV-2作用的機(jī)制之一為抑制

2、HSV-2糖蛋白gB基因的轉(zhuǎn)錄。【關(guān)鍵詞】螺旋藻多糖；單純皰疹病毒2型；原位雜交Inhibition of HSV-2 glycoprotein gB mRNA expression by polysaccharide from spirulina platensis(PSP)【Abstract】 Objective To explore the effects and mechanism of PSP on the expression of HSV-2 gB mRNA and to provide a theoretical support for developing new drugs

3、.Methods PSP was applied at various concentrations to Vero cells infected by HSV-2， In situ hybrization was adopted to explore the expression of HSV-2 gB mRNA with digoxigenin(DIG)-labeled HSV-2 oligoprobe. Results HSV-2 gB mRNA were less expressed in PSP treated group than that in the control (P0.0

4、1).Conclusion One of the mechanism of PSP against HSV-2 may be explained by the considerable inhibition of HSV-2 （螺旋藻多糖對(duì)HSV-2糖蛋白gB mRNA表達(dá)的抑制作用 gB gene trscription.【Key words】 polysaccharide from spirulina platensis; HSV-2; in situ hybrization單純皰疹病毒2型(herpes simplex virus-2， HSV-2)在人群中感染較為普遍。孕婦生殖器感染可

5、引起早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎、胎兒畸形以及智力低下等，并與子宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)1，2。近幾年研究表明：鈍頂螺旋藻多糖（polysaccharides from Spirulina platensis，PSP）是鈍頂螺旋藻中具有抗腫瘤、抗輻射、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)作用的重要生物活性物質(zhì)3，4。我們的前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PSP有抗HSV-1的作用，但PSP抗HSV-2的實(shí)驗(yàn)研究未見(jiàn)報(bào)道。本文研究了PSP對(duì)HSV-2糖蛋白gB mRNA表達(dá)的抑制作用，結(jié)果報(bào)告如下。1 材料與方法 1.1 藥品與試劑配制 螺旋藻多糖：參照文獻(xiàn)5，6，采用改良的三氯乙酸去蛋白法提取螺旋藻多糖，純度達(dá)92以上。以雙蒸水配成10mg/

6、ml母液，過(guò)濾除菌，分裝，4保存，臨用時(shí)以DMEM培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。 細(xì)胞培養(yǎng)所用的DMEM干粉培養(yǎng)基為美國(guó)GIBCO公司產(chǎn)品，胰酶為Amersco公司產(chǎn)品，新生牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品；地高辛DNA檢測(cè)試劑盒為Roche公司產(chǎn)品。1.2 細(xì)胞株與病毒 非洲綠猴腎細(xì)胞Vero細(xì)胞株為本室保存?zhèn)鞔?xì)胞系。于DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入10%的新生牛血清，100U/ml青霉素，100g/ml鏈霉素，置5CO2孵箱中37培養(yǎng)，3天傳代1次。標(biāo)準(zhǔn)單純皰疹病毒2型（HSV-2）333株來(lái)源于中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)，Vero細(xì)胞中傳代，毒種保存于-70。 1.3 病毒滴度的測(cè)定 以TCID50表示病毒毒力。取

7、上述制備好的毒株，做10倍系列稀釋，10-1至10-10。將各稀釋度的毒株接種于Vero細(xì)胞，各6復(fù)孔，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照。37培養(yǎng)3天后，觀察細(xì)胞病變，以出現(xiàn)細(xì)胞病變的最高稀釋倍數(shù)的倒數(shù)作為TCID50。1.4 原位雜交檢測(cè)HSV-2糖蛋白gB mRNA的表達(dá) 探針的設(shè)計(jì)7，8 根據(jù)Gen Bank中HSV-2 全基因序列，設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)于HSV-2糖蛋白gB基因序列的寡核苷酸探針序列為5-ggcgactttgtgtacatgtccccgttttacggctaccgg -3，由上海生工公司合成，并于5末端標(biāo)記地高辛。 原位雜交9 Vero細(xì)胞制成2×105/ml細(xì)胞懸液，接種在放有蓋玻片（飛

8、片）的培養(yǎng)板中，每孔加入1.8ml細(xì)胞，于5CO2孵箱中37培養(yǎng)2448h，棄生長(zhǎng)液，加約100 TCID50病毒液50l，37吸附2h，吸出病毒液，加200l不同濃度的PSP（100g/ml、50g/ml和10g/ml）， 置5CO2孵箱中37培養(yǎng)。24h后，取出細(xì)胞飛片經(jīng)4%多聚甲醛室溫下固定20min，PBS漂洗2次，梯度乙醇脫水，蛋白酶K（1g/ml）37消化30min，PBS漂洗2次，2×SSC洗2次，梯度乙醇脫水，空氣干燥。每張飛片滴加50l 雜交液，預(yù)雜交2h；加入含探針的雜交液，置于密閉濕盒中，60過(guò)夜。雜交結(jié)束后，飛片在室溫下依次經(jīng)2×SSC、1×

9、;SSC、0.5×SSC漂洗各2次，于Buffer洗液中10min，封閉液Buffer中37孵育30min，加入抗體液37孵育3060min，Buffer洗液中10min，置Buffer平衡10min，新鮮配制的顯色液中避光孵育10min至數(shù)小時(shí)，終止提 （，。）反應(yīng)。中性樹(shù)膠封片。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)3個(gè)陰性對(duì)照：(1) 雜交前用Rnase A 100g/ml預(yù)處理細(xì)胞飛片，37，1h；(2) 加未標(biāo)記的探針進(jìn)行反應(yīng)；(3) 正常的Vero細(xì)胞。陽(yáng)性對(duì)照為未加PSP作用的HSV-2感染Vero細(xì)胞組。所有操作步驟與其他樣本相同。結(jié)果判定：400×光鏡下隨機(jī)選擇視野，觀察200個(gè)細(xì)胞

10、，計(jì)數(shù)雜交陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)。陽(yáng)性信號(hào)呈明亮的藍(lán)紫色。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 核酸雜交結(jié)果以(x±s)表示，多組數(shù)據(jù)比較采用方差分析。2 結(jié)果光鏡下觀察原位雜交結(jié)果，可見(jiàn)表達(dá)HSV-2糖蛋白gB基因的Vero細(xì)胞被染成藍(lán)紫色，染色部位位于細(xì)胞漿，而正常Vero細(xì)胞未見(jiàn)陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)（圖1）。不同劑量PSP作用的HSV-2感染組，其糖蛋白gB mRNA的表達(dá)顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組（P0.01），10g/ml、50g/ml、100g/ml PSP可使gB mRNA的表達(dá)由86.61%分別降至62.29%、46.12%和31.56%（表1）。 1 聞?dòng)衩? 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)微生物學(xué).上海: 上海醫(yī)科大學(xué)出版? （

11、螺旋藻多糖對(duì)HSV-2糖蛋白gB mRNA表達(dá)的抑制作用(3) 紓?1999，1227-1244.2 Whitely RJ， Roizman B. Herpes simplex virus infections. Lancet，2001， 357:1513-1518.3 涂芳， 楊芳， 鄭文杰，等. 螺旋藻多糖的研究進(jìn)展. 天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)， 2005， 17（1）: 115-119. 4 于紅，張學(xué)成. 螺旋藻多糖抗HSV-1作用的體外實(shí)驗(yàn)研究. 高技術(shù)通訊，2002，12(9):65-69. 5 Lee JB， Hayashi T， Hayashi K， et al. Further p

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