調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)及其流式檢測(cè)

1、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg及其流式檢測(cè)方法1、Treg細(xì)胞概述高效免疫抑制劑的發(fā)現(xiàn)及其聯(lián)合應(yīng)用使臨床器官移植的急性排斥反應(yīng)大大降低,移植物的存活時(shí)間明顯延長(zhǎng);器官移植成為挽救終末期器官功能衰竭患者生命的重要有效途徑。但是免疫抑制劑具有明顯的毒副作用(如對(duì)重要臟器的損傷、降低抗腫瘤及抗感染免疫力等及對(duì)治療慢性排斥反應(yīng)效果較差等問(wèn)題,均限制了免疫抑制劑的長(zhǎng)期應(yīng)用。因此,相關(guān)生命科學(xué)工作者嘗試通過(guò)誘導(dǎo)移植免疫耐受途徑來(lái)避免免疫抑制劑的長(zhǎng)期應(yīng)用及克服移植免疫排斥反應(yīng)。在上個(gè)世紀(jì)九十年代中期,由Sakaguchi等首先證實(shí)了天然CD4 CD25 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell,Treg為一

2、類(lèi)具有免疫抑制作用的T細(xì)胞,約占外周CD4+T細(xì)胞的510%。該類(lèi)細(xì)胞以“主動(dòng)”的方式參與免疫應(yīng)答/免疫耐受的調(diào)控,不僅參與自身免疫耐受調(diào)節(jié),而且在腫瘤免疫和移植免疫中也具有重要的作用。2、Treg細(xì)胞的來(lái)源研究證實(shí),天然的CD4 +CD25+Treg細(xì)胞來(lái)源于胸腺,小鼠出生后第3天切除胸腺,外周缺乏CD4+ CD25+Treg細(xì)胞,產(chǎn)生抗自身抗體并出現(xiàn)自身免疫性胃炎等自身免疫性疾病。而在第0天和第7天切除胸腺,并不表現(xiàn)自身免疫性疾病。這說(shuō)明出生3d內(nèi)是胸腺產(chǎn)生CD4+CD25+Treg細(xì)胞的關(guān)鍵時(shí)期,這時(shí)切除胸腺引起自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞的過(guò)度增殖。但是,出生第0天胸腺產(chǎn)生的自身反應(yīng)性CD

3、4+T細(xì)胞不足,出生第7天胸腺已經(jīng)產(chǎn)生了足夠的CD4+CD25+Treg細(xì)胞,所以這時(shí)切除胸腺,小鼠不出現(xiàn)自身免疫性疾病。Papiernik等證實(shí),CD4+CD25+Treg 細(xì)胞產(chǎn)生于胸腺,然后遷移到外周發(fā)揮作用,CD4+CD25 胸腺細(xì)胞與外周的CD4+CD25+Treg細(xì)胞一樣,表現(xiàn)對(duì)經(jīng)由TCR的抗原刺激呈低反應(yīng)性,并且顯示抑制其他T 細(xì)胞增殖的能力。CD4+CD25+ Treg細(xì)胞的產(chǎn)生需要TCR與胸腺皮質(zhì)上皮細(xì)胞的MHC II類(lèi)分子間的高親和力作用,MHC II類(lèi)分子缺陷的小鼠缺乏CD4+CD25+Treg細(xì)胞。CD4+CD25+T細(xì)胞除了在胸腺產(chǎn)生以外,還可以在未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞、

4、IL-10、IFN-a、TGF-beta或者低劑量抗原誘導(dǎo)下由外周CD4+CD25-細(xì)胞轉(zhuǎn)變而來(lái),該類(lèi)細(xì)胞稱(chēng)為誘導(dǎo)的CD4+CD25+Treg細(xì)胞。3、Treg細(xì)胞的常用的分子標(biāo)記CD25:Treg細(xì)胞調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)平衡,增加免疫耐受。研究表明,多種T 細(xì)胞分子抗原參與Treg細(xì)胞的特異性功能效應(yīng)。傳統(tǒng)鑒定Treg細(xì)胞主要是通過(guò)CD4和CD25來(lái)標(biāo)記。但隨著研究的進(jìn)一步深入,發(fā)覺(jué)只通過(guò)CD4+CD25+雙陽(yáng)性來(lái)定義的Treg細(xì)胞并不完全準(zhǔn)確FOXP3: FOX(forkhead box是脊椎動(dòng)物叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子的總稱(chēng),是一個(gè)具有多種功能的轉(zhuǎn)錄因子大家族,通常和細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控有關(guān)。FOX 家

5、族成員都有一個(gè)叉頭樣結(jié)構(gòu)域,能與DNA結(jié)合。FOXP3是叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子家族中的成員,2001年由Brunkow等首次報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn),它的表達(dá)及功能與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,TR細(xì)胞密切相關(guān)。如果FOXP3基因發(fā)生突變,將影響TR細(xì)胞的發(fā)育成熟,導(dǎo)致IPEX綜合征(immune dysregulation,polyendocrinop -athy,enteropathy,X linked syndrome。 FOXP3主要表達(dá)于胸腺、脾臟和淋巴結(jié)等淋巴器官和組織。在小鼠特異性表達(dá)于CD4+CD25+T細(xì)胞,而不表達(dá)于CD8+T細(xì)胞。在人類(lèi)FOXP3不僅可表達(dá)于CD4+

6、CD25+T細(xì)胞,還可表達(dá)于CD8+CD28-T細(xì)胞。但在CD4+T細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于CD8+T細(xì)胞。目前,Foxp3(forkhead box P3,Scurfin是目前公認(rèn)的Treg 細(xì)胞的最敏感的標(biāo)志。CD127:最近發(fā)現(xiàn)通過(guò)表達(dá)CD4, CD25和傳導(dǎo)信號(hào)FoxP3來(lái)定義調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞時(shí),在一類(lèi)特殊的細(xì)胞群體時(shí)會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題。我們發(fā)現(xiàn)IL-7受體(CD127在外周血CD4+T的一個(gè)亞群中會(huì)下調(diào)表達(dá)。我們證實(shí)這些細(xì)胞FoxP3陽(yáng)性,且這群細(xì)胞包括那些CD25弱陽(yáng)性或陰性群體。聯(lián)合使用CD4,CD25和CD127可得到高純度的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,比以前的通過(guò)其他標(biāo)志物來(lái)區(qū)分方法顯著提高。這些細(xì)胞在

7、功能抑制實(shí)驗(yàn)中可發(fā)揮高度抑制功能。實(shí)際上,通過(guò)CD4和CD127表達(dá)來(lái)區(qū)分的細(xì)胞數(shù)量(包括CD25+CD4+和CD25-CD4+三倍于通過(guò)CD4+CD25hi區(qū)分的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群。最后,我們使用CD127定量檢測(cè)I型糖尿病病人調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)CD127可作為人調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的標(biāo)志物。4、FOXP3流式檢測(cè)方法美國(guó)eBioscience公司是最早擁有FOXP3流式檢測(cè)抗體的公司之一,公司通過(guò)不斷改進(jìn)和優(yōu)化,建立了一套完美的針對(duì)FOXP3流式檢測(cè)特殊的試劑和方案。(1實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)設(shè)備1流式上樣管2混勻振蕩器3離心機(jī)4移液器、Tips5流式細(xì)胞儀所需試劑1細(xì)胞表面染色的熒光標(biāo)記的單抗試劑(CD4、

8、CD25或CD8等2FOXP3熒光標(biāo)記抗體3溶血素:(eBioscience目錄號(hào)00-4333用于裂解紅細(xì)胞淋巴細(xì)胞分離液:若樣品為人的全血,建議先用分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞后再做后續(xù)檢測(cè)5固定劑和破膜劑:(eBioscience FOXP3檢測(cè)專(zhuān)用試劑,目錄號(hào)為00-5521或00-5523;在FOXP3染色前,將其中的Fixation/Perme -abilization Concentrate和Fixation/Permeabilization Diluent以1:3的比例混合,配制好的溶液保存時(shí)間不要超過(guò)一天6其他試劑:Flow Cytometry Staining Buffer(00

9、-4222或PBS,Permeabil -ization Buffer(Cat.No 00-8333等(2實(shí)驗(yàn)操作步驟注:對(duì)于不同的FOXP3克隆號(hào)抗體,在操作上可能存在著一些細(xì)微的差別。具體實(shí)驗(yàn)時(shí),請(qǐng)參考相應(yīng)的抗體說(shuō)明書(shū)上的操作步驟。此操作以人Foxp3 (clone PCH101, cat. XX-4776.為例。1在每個(gè)流式上樣管中加入100ul準(zhǔn)備好的細(xì)胞懸液,細(xì)胞數(shù)約為1x106個(gè)。2按照細(xì)胞表面抗原染色方法標(biāo)記表面抗原(如CD4、CD8、CD25等。3用預(yù)冷的Flow Cytometry Staining Buffer或預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞。4旋渦震蕩重懸細(xì)胞后加入1ml的固定/破

10、膜工作液(Fixation/Permeabilization,并再次旋渦混勻。5避光4孵育30-60分鐘。6加入2ml Permeabilization Buffer(Cat.No 00-8333工作液離心洗滌細(xì)胞并棄去上清液。7重復(fù)第5步操作洗滌細(xì)胞。8可選加入稀釋好的2%(2ul的正常大鼠血清(用Permeabilization Buffer工作液進(jìn)行稀釋100ul,在避光4孵育15分鐘9封閉液無(wú)需洗去,直接加入稀釋好的熒光標(biāo)記FOXP3抗體(用Permeabilization Buffer工作液進(jìn)行稀釋20ul,避光4孵育至少30分鐘。建議進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索出抗體的最適濃度。10加入2ml Permeabilization Bu