不同地區(qū)桔梗多糖含量的比較

1、不同地區(qū)桔梗多糖含量的比較張小斌（商洛學院生物醫(yī)藥工程系、中國中醫(yī)研究院商洛中藥材GAP科研工程中心 陜西商洛 726000） 摘要 選取陜西商洛、安徽太和和吉林延邊產(chǎn)桔梗，采用水提取法提取桔梗粗多糖，分別測定粗多糖含量，采用三氯乙酸正丁醇法脫蛋白脫去多糖中粗蛋白，測定精制多糖含量，比較三個地區(qū)桔梗粗多糖及精制多糖含量。結果顯示，安徽太和粗多糖含量最高，為26.36%，其次為吉林延邊桔梗，為18.27%，陜西商洛桔梗為17.08%。提取粗多糖經(jīng)精制后，安徽太和、陜西商洛、吉林延邊桔梗粗多糖蛋白去除率分別為：74.27%，68.08%和69.36%，差異不顯著。精制多糖含量分別為：12.61%，

2、15.42%和11.42%。結果表明安徽太和桔梗多糖含量最高，陜西商洛次之，最后為吉林延邊桔梗。關鍵詞：桔梗；粗多糖；精制多糖；含量中圖分類號： 文獻標識碼： 文章編號：Comparison the content of polysaccharide of platycodon in three areasAbstract: Select the platycodon,in shangluo, anhui tai and jilin in yanbian with water to extrac the crude polysaccharide of platycodon,ahd then c

3、rude polysaccharide is determined,Use the acid-n-buoh the different method to take off the protein in the polysaccharide crude, and then to determine the refined polysaccharide, compare the thick polysaccharides and refined polysaccharide of platycodon in these three areas.The result is showed that

4、the highest content of polysaccharide in anhui tai, thick for 26.36%, followed by jilin yanbian balloon flower18.27%, the minimum is shangluo balloonflower, for 17.08%.After the extraction of refined polysaccharide from crude polysaccharide,the balloonflower thick glycoprotein removal rate in anhui

5、tai, shangluo, jilin yanbian is more than respectively 74.27%,68.08% and 69.36%, the difference is not significant. Refined polysaccharide is 12.61%，15.42% and 11.42%, the results show that the contents of polysaccharide in anhui tai balloonflower highest, in shangluo is the second smallest, and fin

6、ally for jilin yanbian lisianthus. Key words: platycodon; crude polysaccharide; Refined polysaccharide; content1.1選題的目的桔梗1(Platycodon grandiflorum(Jacq)ADC)是桔?？平酃佟⒍嗄晟荼局参? 別名鈴鐺花、梗草、和尚頭花、土人參、包袱花等。藥用其根, 為桔?？浦参锝酃５母稍锔?。我國最早藥書 神農(nóng)本草經(jīng) 有記載, 桔梗系常用中藥桔?；ù竺利?，可供觀賞，種子可榨油，根是一種常見的中藥材。其味苦、辛，性微溫有宣肺、散寒、祛痰、排膿等功效，主治外感咳嗽

7、、喉痹咽痛、胸滿肋痛等癥?，F(xiàn)代醫(yī)學認為，桔梗富含桔梗皂甙、多糖、甾醇類、萜類、桔梗酸等成分，并含有十幾種氨基酸及銅、鐵、鋅、錳等22種微量元素，具有抗炎、止咳、化痰、抗?jié)?、擴張血管、降血壓、解熱鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、降血糖、促進膽酸分泌、抗過敏等許多藥理及保健功能2。除此以外，桔梗還可以作為蔬菜食用，在朝鮮、韓國、日本及我國東北地區(qū)，人們食用桔梗的習慣十分普遍。桔梗在我國分布較廣，產(chǎn)于皖南山區(qū)、沿江丘陵地區(qū)及皖西大別山區(qū)，生于海拔1 600米以下的山坡草地、灌叢中，蘇聯(lián)(西伯利亞)、日本也有。我省我市也有大規(guī)模種植：如商洛丹鳳縣等。桔梗是商洛產(chǎn)地道藥材 , 野生或栽培均有。目前已形成了商洛桔梗規(guī)范化生

8、產(chǎn)技術標準操作規(guī)程3。為提取桔梗有效中藥成分，更好地利用這些植物資源，服務于地方經(jīng)濟建設，我們研究不同地區(qū)桔梗中多糖的提取及測定，為評價桔梗藥材及新選育品種的質(zhì)量提供方法，進一步用于生產(chǎn)實踐打下基礎。1.2選題的依據(jù)多糖廣泛存在于植物的根、莖、葉、花、果實、種子及動物細胞膜、微生物的細胞壁中，是由醛基和酮基通過苷鍵連接的高分子聚合物，也是構成生命的四大基本物質(zhì)之一。它在自然界中來源廣泛，特別是在高等植物、動物、微生物、地衣和海藻中含量豐富。多糖不但是生物體的主要結構成分，還具有復雜的多方面的生物活性與功能。大量研究巳表明：多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗過敏、抗氧化、抗衰老、抗病毒、降血糖等多種生

9、物活性，且多糖藥物毒副作用小、安全性高，在臨床上得到廣泛應用。近年來有關多糖的研究發(fā)展迅速，從動物、植物和微生物等各種生物材料中提取的多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血脂、降血糖、抗氧化、抗衰老、抗病毒等方面的生理活性，已成為熱點研究領域。桔梗多糖是一種菊糖型多聚糖，可開發(fā)為保健飲料和具有抑菌保健作用的食用包裝復合膜，是桔梗食用品質(zhì)的主要評價指標?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)桔梗多糖還具有多種生物活性，如免疫調(diào)節(jié)、祛痰、保肝、消炎、改善胰島素、增強機體免疫功能及抗腫瘤等，具有廣闊的開發(fā)前景。桔梗多糖的含量與很多因素有關，例如不同產(chǎn)地、不同部位、不同生長年限等，不同產(chǎn)地對桔梗多糖含量的影響關系到藥材及新選育品

10、種的質(zhì)量。桔梗藥用最早見于神農(nóng)本草經(jīng)，弓曉杰4等發(fā)現(xiàn)，桔梗提取物能促進腸促胰酶肽的分泌，可用于治療胰腺炎。國內(nèi)已經(jīng)報導了不少關于植物多糖的提取方法及其抗氧化性的研究，如黃茋多糖5靈芝、枸杞復合多糖6等。桔梗多糖含量的測定也屢見不鮮，如李妍7的苯酚一硫酸法測定多糖含量，吳彥8的桔梗中多糖含量的提取及測定，賈林9的桔梗多糖的提取與純化，張蓮姬10桔梗多糖的提取方法及其抗氧化性的研究等。桔梗做藥用常用根部，桔梗根可制成美味的菜肴, 在朝鮮、韓國、日本及我國東北地區(qū)將桔梗作為食用蔬菜的習慣十分普遍11。桔梗根含多種皂苷,混合皂苷完全水解產(chǎn)生桔梗皂苷 (platycodigenin)、遠志酸 (poly

11、galacic acid)以及少量桔梗酸A，并分離出桔梗皂苷A、C、D。此外還含甾醇類化合物。桔梗水提取物具有明顯的藥理作用。桔梗具有祛痰與鎮(zhèn)咳作用，桔梗煎劑1 g/kg給麻醉犬灌服后，能顯著增加呼吸道粘液分泌量，其強度與氯化銨相似。桔梗的根、根皮、莖、 葉、花、果均有顯著的祛痰作用12。桔梗水提取750 mg/kg 腹腔注射，在機械刺激豚鼠氣管粘膜實驗中，鎮(zhèn)咳效果達60 %13。桔梗具有抗炎作用，口服桔梗粗皂苷200 mg/kg,對角叉菜膠及醋酸所致的大鼠足腫脹均有明顯抑制作用。用做藥物開發(fā)是一般用水提物，主要是防止醇提取物對兒童用藥造成損害。桔梗水提取物具有抗腫瘤作用，桔梗菊粉給ICR系雌

12、性小鼠于1W中間日灌胃，然后接種艾氏腹水癌細胞，接種于腹股溝后30 d，每日口服或腹腔給予菊粉組分，測定當時腫瘤重量與對照組比較，其抑制效果達30 %40 %。對腹水型腫瘤小鼠也有相同作用。桔梗水提取物可導致體外培養(yǎng)的人肺癌細胞 A549生長抑制和凋亡，分子生物學的研究表明，桔梗水提取物引起的細胞凋亡機制與端粒酶活性的降低和Bc-2表達的下調(diào)有關14。國外近年對桔梗的研究主要集中在:韓國學者對多糖類成分進行了大量研究，發(fā)現(xiàn)桔梗多糖能激活促細胞分裂蛋白質(zhì)酶活性。多糖具有降血糖的功能，Ukai Shigeo等從一種銀耳(KINJI)的子實體或菌絲體中提取出抗高血糖的酸性多糖。FujiiMakoto

13、等從海藻類植物中提取出一種能夠降低血糖水平的藻類多糖，并制成了以巖藻依聚糖(Fucoidan)為主要成分的保健食品，它可以顯著提高人們的免疫功能。Honda Yasuki等從西洋櫻草屬(Polyanthus)植物中獲得一種具有良好的保濕、抗皺等作用的酸性雜多糖。Sawai Yasuko等從石菖蒲(Acorusgramneus)的根莖中分離得到的多糖可抑制黑色素的產(chǎn)生，具有抗炎、抗氧化作用，可用于黑變病的治療，且因其具有良好的保濕作用，故又可作為化妝品的有效成分。Shimomura等從甲殼類動物的肉類降解產(chǎn)物中得到一種具有美容功效的酸性多糖。實驗證明，此酸性多糖可抑制延緩衰老的透明質(zhì)酸的分解，減

14、少皮膚細紋和干裂，因而可作為美容食品和化妝品的有效成分。2 材料、儀器及試劑2.1供試材料陜西商洛、安徽太和和吉林延邊三個地區(qū)產(chǎn)的桔梗。商洛桔梗購自香菊大藥房，太和桔梗購自北京同仁堂（亳州）藥材基地，延邊桔梗購自吉林省長春市中藥市場。所有桔梗均為2011年當?shù)厣a(chǎn)，分三個批次進行采樣。2.2儀器及試劑主要儀器：紫外分光光度計（722型）; 恒溫水浴鍋（RE52-99型 ）上海亞榮生化儀器廠；真空泵(SHB-3型)鄭州杜甫儀器廠; 冷凍離心機(H-2050R型 )長沙湘儀離心機儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(HHS-11-2型)上海博迅實業(yè)有限醫(yī)療設備公司;多功能粉碎機（878-A型）常州國華電器有限

15、公司;電冰箱。試劑：牛血清蛋白和考馬斯亮藍購自西安西安國安生物科技有限公司；硫酸、苯酚、葡萄糖、正丁醇、三氯乙酸等試劑均為分析純，購自西安三浦化學試劑有限公司。3試驗方法3.1 桔梗粗多糖的提取不同地區(qū)桔梗根部-烘干、粉碎-熱水浸提-抽濾去除殘渣-蒸發(fā)濃縮-離心去雜質(zhì)-濃縮液醇析過夜-粗多糖粉碎：采用粉碎機粉碎，過60目篩。水浴浸提：將樣品按設計的料水比，浸提溫度，浸提時間，置于150m1的三角錐瓶中用保鮮膜密封進行恒溫水浴浸提。醇析：經(jīng)處理后的浸提液蒸發(fā)濃縮至原體積的15，4000rmin離心20分鐘，去除濃縮過程中出現(xiàn)的雜質(zhì)沉淀。取上清液加入4倍體積95乙醇，放置4條件下沉淀靜置過夜。3.

16、2桔梗粗多糖的精制桔梗粗多糖的精制主要進行脫蛋白處理，脫蛋白的方法采用三氯乙酸-正丁醇法脫蛋白法。將三氯乙酸和正丁醇按照體積比為110混合配制成三氯乙酸正丁醇混合試劑，將桔梗多糖提取液與三氯乙酸正丁醇試劑按照體積比為120置于錐形瓶中混合，在30下恒溫振蕩30min，4000r /min條件下離心20min，棄去沉淀，得澄清液并測定蛋白質(zhì)和多糖含量。3.3桔梗提取物含量的測定3.3.1桔梗多糖含量的測定桔梗多糖含量的測定采用苯酚-硫酸法18測定桔梗多糖含量，以葡萄糖為對照品。配制標準溶液：精密稱取105干燥到恒重的葡萄糖標準樣品20mg,并置于500ml容量瓶。配制苯酚溶液：取苯酚200g，加

17、鋁片0.2g和碳酸氫鈉0.2g,蒸餾收集182時的餾分，稱取此餾分10g,加水150ml，置棕色瓶中，即得。標準曲線的制作：精密吸取標準品溶液0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6、2.0ml，分別置于具塞試管中，各加蒸餾水使總體積為2.0ml,再分別加苯酚試液1ml,搖勻，迅速滴加濃硫酸5.0ml,搖勻后放置10min,置沸水浴中加熱15min,取出冷卻至室溫。在分光光度儀上于490nm處測定吸光度，以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。用葡萄糖標準品溶液作為對照樣測定不同濃度葡萄糖溶液的吸光度，作出回歸曲線，求出回歸方程。待測樣品液以同樣的方法測吸光度，對照求值。3.3.

18、2桔梗蛋白質(zhì)含量的測定桔梗蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍染色法19，以牛血清蛋白為標準品。3.3.2.1 試劑的配制0.9% NaCl溶液：取0.9g NaCl溶于1000ml水中。標準蛋白液：牛血清蛋白（0.1mg/ml）,準確稱取牛血清蛋白0.1g，用0.9% NaCl溶液溶解并稀釋至1000ml。染液：考馬斯亮藍G250(0.01%),稱取0.1g考馬斯亮藍G250溶于50ml 95%乙醇中，再加入100ml濃磷酸，然后加蒸餾水定容到1000ml。樣品液：取牛血清蛋白（0.1mg/ml）溶液，用0.9% NaCl稀釋至一定濃度。3.3.2.2 標準曲線的制備取7支干凈試管，按下表進行編號

19、并加入試劑?；靹?，室溫靜置3min,以第一管為空白，于波長595nm處比色，讀取吸光度，以吸光度為縱坐標，各標準液濃度（ug/ml）作為橫坐標作圖得標準曲線。 考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)濃度標準曲線的制備(A595nm)管號試劑1234567標準蛋白液/ml-0.10.20.30.40.60.80.9% NaCl/ml1.00.90.80.70.60.40.2考馬斯亮藍染液/ml4.04.04.04.04.04.04.0蛋白質(zhì)濃度/(ug/ml)01020304060803.3.2.3 樣液的測定另取一支干凈試管，加入樣品液1.0ml及考馬斯亮藍染液4.0ml,混勻，室溫靜置3min,于波長595

20、nm處比色，讀取吸光度，由樣品液的吸光度查標準曲線即可求出含量。3.4數(shù)據(jù)分析方法所有數(shù)據(jù)利用Excel軟件進行數(shù)據(jù)整理與繪圖，采用SPSS18.0 軟件的ONE- WAY方法進行組間的差異性顯著分析。4結果與分析4.1多糖含量測定標準曲線的建立以葡萄糖為標準對照品，采用硫酸苯酚法測定法，建立多糖含量測定標準曲線，以吸光度值為縱坐標，葡萄糖濃度為橫坐標。結果見圖1，有圖可知，該標準曲線的一次相關函數(shù)公式為：Y=14.642X+0.114，相關系數(shù)R2=0.9723，說明建立的該標準曲線能夠用于本試驗中多糖含量的檢測。圖1 多糖含量測定標準曲線圖4.2 蛋白質(zhì)含量測定標準曲線的建立以牛血清蛋白為

21、標準對照品，采用考馬斯亮藍染色測定，建立蛋白質(zhì)含量測定標準曲線，以吸光度值為縱坐標，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標。結果見圖2，有圖可知，該標準曲線的一次相關函數(shù)公式為：Y=0.0048X+0.0213，相關系數(shù)R2=0.9904，說明建立的該標準曲線能夠用于本試驗中蛋白質(zhì)含量的檢測。圖2 蛋白質(zhì)含量測定標準曲線圖4.3三個地區(qū)桔梗粗多糖含量的比較三個地區(qū)桔梗粗多糖含量見表1及圖3，由表可知，所提取的安徽太和桔梗粗多糖含量最高，為26.36%，其次為吉林延邊桔梗，為18.27%，最后為陜西商洛桔梗，為17.08%。安徽太和桔梗粗多糖顯著高于陜西商洛和吉林延邊（P<0.05）。表1 三個地區(qū)桔梗粗多糖

22、含量表陜西商洛安徽太和吉林延邊粗多糖含量%17.08±1.56a26.36±5.24b18.27±3.35a圖3 三個地區(qū)桔梗粗多糖含量4.4三個地區(qū)桔梗蛋白質(zhì)去除率的比較到目前為止，采用硫酸苯酚法將所提取的粗多糖進行除蛋白處理，結果如表2及圖4所示，陜西商洛桔梗的蛋白質(zhì)去除率為68.08%，安徽太和的蛋白質(zhì)去除率為74.27%，吉林延邊的蛋白質(zhì)去除率為69.36%。安徽太和桔梗蛋白去除率顯著高于陜西商洛和吉林延邊的桔梗（P<0.05）。表2 三個地區(qū)桔梗蛋白質(zhì)去除率比較表陜西商洛安徽太和吉林延邊粗多糖含量%68.08±1.87a74.27

23、7;2.15b69.36±2.24a 圖4 三個地區(qū)桔梗蛋白質(zhì)去除率4.5三個地區(qū)桔梗精制多糖含量的比較采用硫酸苯酚法除去蛋白后，精多糖含量如表3及圖5所示，由表可知安徽太和最高為15.42%，陜西商洛精多糖含量為12.61%，吉林延邊為11.42%。安徽太和精多糖含量顯著高于陜西商洛和吉林延邊的桔梗（P<0.05）。表3 三個地區(qū)桔梗精制多糖含量比較表陜西商洛安徽太和吉林延邊粗多糖含量%12.61±0.64a15.42±1.85b11.42±1.12a 圖5 三個地區(qū)桔梗精制多糖含量5結論與討論通過試驗，苯酚-硫酸法測總糖含量是目前被廣泛使用的一

24、種經(jīng)典方法, 它適用于對單糖、寡糖以及均一多糖的含量測定。但不能排除還原性雜質(zhì)( 包括還原糖性的單糖) 的干擾，然而用之于總糖的測定具有重復性好，靈敏度高的特點，而且該法省去了過柱子的繁瑣，節(jié)約了時間。因此本文中采用該方法進行多糖的測定是十分可行的。桔梗多糖大多與蛋白質(zhì)共存于某一部位，蛋白質(zhì)或游離蛋白質(zhì)的酸堿性氨基酸常與多糖上的堿性或酸性基團產(chǎn)生靜電結合使游離的蛋白質(zhì)脫去產(chǎn)生難度。為了提高桔梗多糖的生物活性，得到較高純度的桔梗多糖，必須去除蛋白質(zhì)。目前，國內(nèi)已有對于桔梗多糖的提取方面的報道，但尚未有標準方法。脫蛋白常用的方法有傳統(tǒng)的Sevag 法、三氯醋酸法等，本研究使用實驗室前期確定的最佳的

25、脫蛋白方法進行脫蛋白處理。采用三氯乙酸-正丁醇法脫蛋白能夠有效的去除雜多糖中的蛋白質(zhì)，并且能更好的降低多糖損失率。本試驗選取的三個地區(qū)的桔梗，粗多糖的含量以安徽太和為最高，陜西商洛和吉林延邊的次之。脫蛋白處理能夠降低極大程度的去除粗多糖中的蛋白，使多糖得到精制。由本試驗的脫蛋白處理可以看出，安徽太和桔梗粗多糖中蛋白含量較高，脫蛋白處理脫去了74.27%的蛋白，陜西商洛的桔梗粗多糖中蛋白含量較低，脫蛋白處理脫去了68.08%的蛋白。經(jīng)過脫蛋白處理后，精多糖含量以安徽太和最高為15.42%，陜西商洛精多糖含量為12.61%，吉林延邊為11.42%。6 參考文獻 1國家藥典委員會中華人民共和國藥典(2010版) M北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：259-2602王超，康立源中藥多糖的藥理學研究進展J世界科學技術中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2008，10(3)：82863 薛小玲. 商洛桔梗規(guī)范化生產(chǎn)技術標準操作規(guī)程J. 中國現(xiàn)代中藥, 2008,10 (12):18-19,254弓曉杰，陳麗容，孫印石，等，桔梗中抑制酪氨酸酶活性成分的研究J.中藥材，2004