腫瘤分子標記物檢測的進展

1、腫瘤分子標記物檢測的進展 【關鍵詞】 腫瘤標志物；分子標記物檢測；檢測方法 在腫瘤的發(fā)生過程中，血清中某些腫瘤標志物的升高與腫瘤密切相關。因此，檢測腫瘤標記物在對腫瘤的篩選、診斷和判斷預后中扮演著重要的角色。腫瘤標志物的研究進行了許多年，并且有大量的文獻報道，但是真正能夠用于臨床的腫瘤標志物的數(shù)量還相當有限1。目前已經(jīng)確定與腫瘤相關的腫瘤標志物有癌胚抗原(CEA)、糖抗原(CA199)、癌抗原(CA125)、甲胎蛋白(AFP)、前列腺特異抗原(PSA)、CA153、人絨毛膜促性腺激素(hCG)等，被分別用于對結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢上皮腫瘤、干細胞癌等的診斷23。同時腫瘤標志物檢測作為一種

2、無創(chuàng)的檢查方法，也適用于對腫瘤進行療效監(jiān)控、活動性和并發(fā)癥評估以及隨訪。因此，血清中腫瘤標志物的檢測是臨床檢測中非常重要的檢查方法4。 通常用于量化檢測腫瘤標記物的方法是免疫測定法，其在臨床實驗室檢查上已經(jīng)得以了廣泛的運用。但是，傳統(tǒng)的免疫測定法存在著許多的缺限，比如耗時較長，精確度較低及實現(xiàn)自動化較為困難4。為了提高免疫測定法檢測的準確率，從早期單個的腫瘤標志物測試發(fā)展到了后來的腫瘤標志物聯(lián)合測定。這樣雖然在一定程度上提高了腫瘤標志物測定的精確度，但是并沒有從根本上改善免疫測定法的不足。隨著一些新技術的發(fā)展和在腫瘤標志物測定方面的運用，腫瘤標志物測定必將在腫瘤的防治中發(fā)揮更加重要的作用。 1

3、 發(fā)光免疫測定 發(fā)光免疫測定(Chemiluminescent Immunoassay，CLIA)是Halman于1977年建立。其基于放射免疫分析的基本原理，將發(fā)光物質(zhì)或酶標記在抗原或抗體上，免疫反應結(jié)束后，加入氧化劑或酶底物而發(fā)光，通過測量發(fā)射光的強度，根據(jù)標準趨向測定待測物的濃度。文獻報道，從酶免疫測定、熒光免疫測定發(fā)展到發(fā)光免疫測定，使最低檢出值的靈敏度提高了10 000倍5。Wesseling S等用CLIA儀檢測總前列腺特異性抗原(tPSA)和游離前列腺特異性抗原(fPDA)，認為其可區(qū)分前列腺癌和良性前列腺增生6。Deng YF等也用電化學發(fā)光免疫分析檢測了人頭部和頸部鱗細胞癌的

4、CYFRE211，并探討了其臨床意義，發(fā)現(xiàn)其不但對診斷有意義，而且對患者的病情追蹤有意義7。CLIA具有兩種類型：間接式（有標記）和直接式（無標記）。前者一般是用酶或熒光標記物來提供檢測信號，但因為受檢測的光水平較低，所以需要復雜的監(jiān)測儀器；后者目前使用較為廣泛，包括了衰減式全內(nèi)反射、橢圓率測量法、表面等離子體共振、單模雙電波導、光纖波導、干擾儀和光柵藕合器等多種形式。雖然CLIA可能遇到諸如外界光線的干擾、遲鈍的反應時間和試劑相遺漏等問題，但其能對抗原抗體的相互作用進行實時檢測，儀器價格低廉，可實現(xiàn)自動化，使用簡便、安全、無放射性污染，成為了標記免疫分析的一個重要方向。目前在國外CLIA已經(jīng)

5、被廣泛的用于研究腫瘤標志物，并逐步被運用于臨床。其以高的靈敏度和簡便的儀器操作而在腫瘤標志物的檢測中展現(xiàn)出了巨大的優(yōu)勢。 2 免疫傳感器 臨床使用的腫瘤標志物的檢測方法雖然具有一定的靈敏度、準確度及特異性，但其在環(huán)保、操作速度和定量檢測等方面存在著許多不足之處，同時由于所需專用儀器和試劑昂貴，其并不適宜于對腫瘤進行大規(guī)模的篩選和普查。基于對腫瘤標志物進行快速測試的目的，許多小型，半自動且便攜的免疫傳感器(Immunosensors)被發(fā)展了起來。免疫傳感器是一種重要的分析工具，它可以實時檢測結(jié)合著的抗體和抗原而不需要對它們進行分離和洗滌，有利于對免疫反應進行動力學分析8。免疫傳感器的發(fā)展可促使

6、免疫診斷方法向定量化、操作自動化方向發(fā)展。免疫傳感器檢測裝置通常有四種：電化學免疫傳感器、光學免疫傳感器、質(zhì)量檢測免疫傳感器的和熱量檢測免疫傳感器9。但是，常用于臨床的腫瘤標志物免疫傳感器為電化學免疫傳感器。電化學免疫傳感器是通過檢測免疫反應所引起的電勢、電流、電容、電導及電阻的變化來進行檢測分析的，其簡化了腫瘤標志物的檢測過程，具有較高的靈敏度。近年來，隨著電化學免疫傳感器與流體注射分析技術及毛細血管電泳分析技術的結(jié)合，更加提高了其腫瘤標志物的檢測靈敏度，并且這些檢測方法經(jīng)濟、高效，使得其具有很好的臨床使用前景10。比如2004年Guan等建立的用普魯士藍改良的電流流體注射分析生物傳感器就能

7、只通過一步檢測腫瘤標志物甲胎蛋白11。盡管電免疫傳感器給臨床腫瘤標志物檢測提供了高效、簡捷的途徑，但是由于它在靈敏度上的缺陷，目前還很難取代傳統(tǒng)的腫瘤標志物免疫測定方法。 3 微陣列系統(tǒng) 隨著技術的發(fā)展，要求同時測定血液或其它組織中多種分析物的要求在醫(yī)學研究中日益明顯。因此，在發(fā)展高通量分析方法的努力下，能夠研究功能和表達蛋白組學的蛋白微陣列系統(tǒng)(Microarray System)發(fā)展了起來12。微陣列系統(tǒng)不僅可以允許對小型樣本中多種標志物進行高通量的測定，而且還可以顯著地減少測定所需的時間13，為提高腫瘤標志物的輔助診斷價值，進行腫瘤標志物的聯(lián)合檢測提供了可能。目前，對腫瘤標志物的聯(lián)合檢測

8、有兩種不同的意見，一種是通過嚴格篩選、科學分析后進行腫瘤標志物的組合，以有針對性地進行檢測，避免衛(wèi)生資源的浪費和加重病人的經(jīng)濟負擔；另一種是利用生物芯片技術，將目前能用于診斷的腫瘤標志物盡可能地點在一張芯片上進行檢測，以充分獲得信息，提高診斷的靈敏度。但無論是哪一種意見，快速、準確地檢測出腫瘤標志物都是其存在的前提。微陣列系統(tǒng)在一定程度上，檢測目標蛋白需要選擇合適的捕獲分子。因此，新的快速生產(chǎn)許多特異抗體和不同類型捕獲分子的方法孕育而生。Song等建立的抗體片斷微陣列系統(tǒng)便能同時快速的檢測AFP、CEA、HCG、CA125、CA199、CA153等腫瘤標志物14。其與傳統(tǒng)的腫瘤標志物免疫測定相

9、比較，在對腫瘤的系列標志物檢測時具有更好的實用性。 4 蛋白指紋技術 蛋白指紋技術(Protein fingerprinting)也稱表面增強激光解吸離子化飛行時間質(zhì)譜技術(SELDITOFMS)。血清蛋白組學模式診斷技術是一種新型的蛋白組學平臺，在此平臺上通過高維質(zhì)譜所獲得的蛋白指紋圖譜可用做疾病的診斷標準，此技術在早期腫瘤的檢測中具有巨大應用前景。目前發(fā)現(xiàn)通過SELDI蛋白指紋技術所獲得的生物標記物，大多數(shù)是在特異性腫瘤微環(huán)境中所產(chǎn)生的低分子質(zhì)量蛋白碎片，通過多種腫瘤的檢測表明，其敏感性和特異性均優(yōu)于傳統(tǒng)的腫瘤標記物，對某些腫瘤的敏感性已達100，特異性也超過95，因而在腫瘤早期診斷和早期

10、預警中具有重要臨床應用價值。Petricoin等報道，用表面增強激光解吸離子化飛行時間質(zhì)譜技術發(fā)現(xiàn)了卵巢癌的特異性低分子肽，其靈敏度為100，特異性為95，陽性預測值為94，對卵巢癌的診斷有重要意義15。近期的研究也表明，表面增強激光解吸離子化飛行時間質(zhì)譜技術對卵巢癌的檢測具有較高的敏感性和特異性16。雖然表面增強激光解吸離子化飛行時間質(zhì)譜技術被用于組織和細胞株的細胞溶解產(chǎn)物分析，但是臨床上希望將其運用于更加容易獲得的體液檢測，因此我們需要建立各種重要類型癌癥的血清蛋白質(zhì)譜，以利于臨床上更好的使用該方法檢測腫瘤標志物。然而，考慮到蛋白質(zhì)譜的重復性和生物標志物的有效性，必須重視來自于不同實驗室和

11、多重樣本組合的不同結(jié)果。只有科學的分析并合理的采納這些試驗結(jié)果，才能使蛋白指紋技術能夠真正的適用于臨床腫瘤標志物的檢測。 腫瘤標志物的篩選和鑒定對腫瘤的診斷和治療具有重要意義，傳統(tǒng)的方法是通過在系列生化、生理和分子生物學研究中比較不同腫瘤中不同基因及其產(chǎn)物的表達水平，以此鑒定出各種腫瘤的特異性標志物。隨著蛋白質(zhì)組學技術、高通量技術以及生物信息學技術的發(fā)展，必將對篩選和鑒定新的腫瘤特異性標志物產(chǎn)生革命性的影響，并為臨床腫瘤的防治及預后判斷提供可靠的科學支持?！緟⒖嘉墨I】 1 McShane LM, Altman DG, Sauerbrei W, et al. REporting recommen

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