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文檔簡介

1、- 苯丙氨酸變位酶基因工程菌的構建及其產酶條件優(yōu)化 - 苯丙氨酸變位酶屬于 MIO-依賴氨基變位酶 (MIO-dependent aminomutase), 可催化 - 苯丙氨酸轉化為 - 苯丙氨酸 , 是目前最有效的抗癌藥物紫杉醇的重要前體物質。 隨著癌癥在全球范圍內發(fā)病率的逐年提升 , - 苯丙氨酸需求量也日益增加。 目前 , 在生產中大量獲取 - 苯丙氨酸的方法主要是化學拆分法和 Mannich 反應法等 , 這些方法步驟復雜 , 產物難以純化 , 生產成本昂貴還會產生有毒有害的副產物。與這些方法相比 , 酶催化法有著高效、 快捷、安全的巨大優(yōu)勢。 - 苯丙氨酸變位酶作為可以高效催化生成

2、 - 苯丙氨酸的生物催化劑受到了越來越多的關注。本研究根據 - 苯丙氨酸變位酶 PAM基因序列設計合成上下游引物 , 利用 PCR技術擴增了目的基因 , 并將其和表達載體 pET-28a 連接 , 構成了表達質粒 pET-28a-pam。將表達質粒轉入大腸桿菌表達菌株 BL21 中, 篩選陽性菌株 , 并通過酶切檢測在菌株內是否成功轉入目的基因條帶 , 得到一株基因重組菌。 通過對 IPTG 誘導劑的單因素試驗確定了最佳誘導劑含量以及最佳誘導時間 , 并對重組菌進行誘導表達。以 SDS-PAGE手段檢測了重組菌的誘導表達并對重組酶進行了純化。對重組酶的基本酶學性質 pH、溫度以及熱穩(wěn)定性進行了

3、研究 , 確定了重組酶的最佳催化 pH為 9.0, 最佳催化溫度為 50 , 并對重組酶的熱穩(wěn)定性進行了驗證,發(fā)現其熱穩(wěn)定性較好。 利用單因素試驗和響應面法對重組菌的產酶條件進行了優(yōu)化 , 確定了最優(yōu)發(fā)酵條件為種齡 :12.8 h, 初始 pH:6.7, 發(fā)酵時間 :25.2 h 。在最優(yōu)發(fā)酵條件下 , 重組菌產 PAM最大酶活可達 11.15 U/mL, 較優(yōu)化前提高了 128.9% 。在 3 L 發(fā)酵罐中對重組菌進行擴大培養(yǎng)。 利用單因素試驗確定了最佳溶氧為30%。分別比較了未添加任何補料的發(fā)酵方式 , 培養(yǎng) 20 h 時流加 30 mL 補料培養(yǎng)基的發(fā)酵方式以及培養(yǎng)30 h 時流加 40 mL 補料培養(yǎng)基的發(fā)酵方式。確定了補料發(fā)酵方式優(yōu)于未進行補料的發(fā)酵方式, 并且對比得到在 20 h 時進行流加補料的發(fā)酵方式優(yōu)于在30 h 時進行補料發(fā)酵的方式。以此方式進行擴大培養(yǎng)發(fā)酵所得最高酶活

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