植物高光效育種

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上植物高光效育種光合作用是決定作物產(chǎn)量最重要的因素之一，作物中90以上的干重直接來源于光合作用。因此，光合作用效率的高低直接關(guān)系到作物的產(chǎn)量。根據(jù)光合作用碳同化途經(jīng)中CO2固定的最初光合產(chǎn)物的不同，可把高等植物分成C3、C4和景天酸植物。C4植物是從C3植物進(jìn)化而來的一種高光效種類。與C3植物相比，它具有在高光強(qiáng)、高溫及低CO2濃度下保持高光效的能力。而一些主要農(nóng)作物如水稻、小麥、馬鈴薯、甜菜等均為C3作物。通過提高農(nóng)作物的光合作用效率來提高產(chǎn)量水平，即高光效育種，一直是國際光合作用研究和作物育種等領(lǐng)域?qū)＜谊P(guān)注的熱點(diǎn)。 自20世紀(jì)60年代以來，人們一直試圖利用C4光合特

2、性來改進(jìn)C3植物的光合效率。傳統(tǒng)的雜交育種手段至今尚未取得令人滿意的結(jié)果，其雜種F1和F2 代的光合效率均比任何一個(gè)親本都低。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，為利用基因工程手段培育高光效作物提供了一條行之有效的途徑。本文就近年來該方面的研究進(jìn)展作一綜述。 1 高光效基因工程育種的理論基礎(chǔ) C3植物中，CO2的固定主要取決于1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase, Rubisco)的活化狀態(tài),它催化 1,5-二磷酸核酮糖(RuBP)羧化，將大氣中的CO2同化，產(chǎn)生兩分子磷酸甘油酸，可見Rubisco在C3植物中同化C

3、O2的重要性。C4植物固定CO2的酶為磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC),與C3作物中Rubisco相比，PEPC對(duì)CO2的親和力高。C4植物的細(xì)胞分化為葉肉細(xì)胞和鞘細(xì)胞，而光合酶在兩類細(xì)胞中的分布不同,如PEPC在葉肉細(xì)胞固定CO2，生成草酰乙酸(OAA),OAA進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為蘋果酸(Mal), Mal進(jìn)入鞘細(xì)胞脫羧,被位于鞘細(xì)胞內(nèi)的 Rubisco羧化,重新進(jìn)入卡爾文循環(huán)。這種CO2的濃縮機(jī)理導(dǎo)致了鞘細(xì)胞內(nèi)高濃度的CO2積累，一方面提高Rubisco的羧化能力，另一方面又大大抑制了Rubisco 的加氧活性,降低了光呼吸,從而使

4、C4植物保持高的光合效率。正是因?yàn)镃4途徑具有高光合能力，以及C3植物中C4途徑的客觀存在，啟示了通過基因工程將C4 途徑的關(guān)鍵酶編碼基因?qū)隒3植物的可能性，為利用基因工程手段培育高光效作物品種提供了理論依據(jù)。 2 高光效基因工程育種策略 2.1 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)的修飾與改造 植物光合作用過程中最大的限制酶是Rubisco，它的反應(yīng)速度每秒只有23次，與一般的酶促反應(yīng)速度 (每秒25000次左右)相比，效率極低；Rubisco是一個(gè)雙功能酶，它不僅催化RuBP的羧化反應(yīng)，而且還催化其加氧反應(yīng)。加氧反應(yīng)中除消耗能量外，還損失羧化反應(yīng)中固定的2050的有機(jī)碳。

5、為提高作物中Rubisco同化CO2的效率，許多研究者希望通過改變酶的結(jié)構(gòu)來改變其羧化/加氧的比值，從而提高作物的光合效率，但至今仍未獲得成功。自從Read和Tabita (1994)發(fā)現(xiàn)在硅藻和紅藻中存在的Rubisco具有比高等植物高得多的效率后，Uemura等又發(fā)現(xiàn)了一種嗜熱紅藻的Rubisco羧化效率約是高等植物的2.53 倍。更高效率的Rubisco在紅藻中的發(fā)現(xiàn)，給修飾改造 Rubisco的長期努力提供了新的動(dòng)力和希望。Whitney 等通過質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法將紅藻高效率Rubisco的小亞基編碼基因引入煙草的葉綠體中得到了高效表達(dá)，但是表達(dá)的小亞基卻不能與煙草本身的大亞基組裝成全酶。

6、酶的組裝是一個(gè)十分復(fù)雜的過程，還有待于進(jìn)行深入研究。 2.2 C3光合途徑關(guān)鍵酶基因的克隆與轉(zhuǎn)化 C4光合途徑主要涉及3種關(guān)鍵酶，即磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、磷酸丙酮酸二激酶(pyruvate orthophosphate dikinase，PPDK)和依賴于NAD(P)的蘋果酸酶NAD(P)-dependent malic enzyme，NAD(P)-ME。 目前，C4途徑的3種關(guān)鍵酶基因均已從不同的C4 植物中克隆出來并分別導(dǎo)入不同的C3植物中。C4型 PEPC基因的cDNA是首先從玉米和黃花菊屬植物 Flaveria trinervia中克隆出來的(Izui等，1986；Poe

7、tseh 等1991)。玉米C4型PEPC基因全長約6.8kb，結(jié)構(gòu)基因由10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子組成；其cDNA長度為2.91kb，編碼970個(gè)氨基酸殘基，其蛋白質(zhì)分子量為 109.4kDa。玉米PPDK基因全長約12kb，有19個(gè)外顯子，其中第一外顯子編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽，第一內(nèi)含子由于包含細(xì)胞質(zhì)型PPDK的啟動(dòng)子，長達(dá)5.9kb；其mRNA 編碼947個(gè)氨基酸殘基，前體蛋白質(zhì)分子量為 102.7kDa，其中N端71個(gè)氨基酸殘基是轉(zhuǎn)運(yùn)肽，成熟蛋白包含876個(gè)殘基。玉米NADP-ME的cDNA全長2184 bp，編碼636個(gè)氨基酸殘基，前體蛋白分子量為 69.8 kDa。 Hudspeth等將玉米PE

8、PC的cDNA與煙草Cab (chlorophyll la/b binding protein，編碼光系統(tǒng)I和光系統(tǒng)II的捕光葉綠素結(jié)合蛋白的基因家族)基因的啟動(dòng)子和終止子重組在一起并轉(zhuǎn)到煙草中，轉(zhuǎn)基因植株 PEPC的活性比對(duì)照高2倍。Gehlin等將由 CaMV35S (cauliflower mosaic virus 35S gene，煙草花葉病毒35S基因)啟動(dòng)子調(diào)控的Corynibacterium glutanicum、E.coli和Flaveria trinervia的PEPC基因?qū)腭R鈴薯，獲得了PEPC活性提高212倍的轉(zhuǎn)基因植株。Ishimaru等將擬南芥RbcS(rubisc

9、o small subunit，1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亞基基因)啟動(dòng)子和CaMV35S啟動(dòng)子調(diào)控的玉米PPDK基因?qū)霐M南芥中，轉(zhuǎn)基因植株的PPDK活性為對(duì)照的4 倍。他們還將玉米的PPDK基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯中，轉(zhuǎn)基因植株的PPDK活性比對(duì)照高5.4倍。Takeuehi 等將CaMV35S啟動(dòng)子調(diào)控的玉米NADP-ME基因 cDNA導(dǎo)入水稻，Tsuchida等將水稻Cab啟動(dòng)子調(diào)控的玉米NADP-ME基因cDNA導(dǎo)入水稻，雖然獲得了酶活顯著提高的轉(zhuǎn)化苗，但在自然光下，轉(zhuǎn)基因植株的葉片白化，生長受到明顯抑制。 將C4光合途徑關(guān)鍵酶基因的cDNA轉(zhuǎn)入C3作物中已有許多成功報(bào)道，但所獲得的

10、轉(zhuǎn)基因植株的相關(guān)酶活遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于C4植物，而全長基因的導(dǎo)入，顯著提高了轉(zhuǎn)基因植株的酶活。Ku等將玉米PEPC的全長基因(包括外顯子、內(nèi)含子及自身的啟動(dòng)子)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入水稻，獲得了高水平表達(dá)玉米PEPC的轉(zhuǎn)基因植株；在一些轉(zhuǎn)基因植株中，PEPC的活性甚至比玉米中的高23倍，達(dá)到葉片可溶性蛋白的12。同對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因植株顯著減少了氧氣對(duì)光合的抑制作用。繼Lepiniec等(1992)從高粱中克隆出PEPC全長基因后，張方等從不同的高粱品種中克隆出一種新型的PEPC基因，并將之導(dǎo)人水稻中，獲得了PEPC活性較對(duì)照高26倍的轉(zhuǎn)基因植株。陳緒清等采用 LA-PCR方法從玉米中克隆出全長PEPC基因，

11、并將其導(dǎo)入小麥。通過對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥葉片中PEPC酶活性的初步測(cè)定，發(fā)現(xiàn)部分轉(zhuǎn)基因植株葉片中PEPC酶活性提高了35倍，與玉米葉片中的PEPC酶活性相當(dāng)。 Fukayama等將玉米PPDK全長基因及不同啟動(dòng)子調(diào)控的cDNA分別導(dǎo)入水稻，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)全長基因的水稻PPDK活性比非轉(zhuǎn)基因水稻高40倍，而轉(zhuǎn)cDNA 的水稻PPDK的活性僅為對(duì)照的5倍。 3 高光效基因工程育種進(jìn)展中存在的問題 C4關(guān)鍵酶基因向C3作物的成功導(dǎo)入及其在C3作物中高效表達(dá)，說明利用基因工程手段培育高光效作物品種的可行性，但仍有許多問題需要進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究。 3.1 PEPC基因的轉(zhuǎn)化 雖然許多轉(zhuǎn)基因植株P(guān)EPC的酶活與未轉(zhuǎn)

12、基因植株相比顯著提高，但光合效率并未提高。如Ku等得到的轉(zhuǎn)基因水稻，其PEPC活力甚至是玉米的23 倍，但是除了其抗氧抑制的能力有所增強(qiáng)外，并未發(fā)現(xiàn)光合效率有所提高。轉(zhuǎn)基因植物中PEPC活力的提高，勢(shì)必使其作用的產(chǎn)物草酰乙酸(OAA)的濃度升高；如果生成的OAA不能迅速脫羧或被轉(zhuǎn)運(yùn)掉，其 PEPC活力就會(huì)被OAA強(qiáng)烈抑制，因而就難以實(shí)質(zhì)性地啟動(dòng)單細(xì)胞內(nèi)的四碳雙羧酸微循環(huán)而有效提高轉(zhuǎn)基因作物中四碳雙羧酸濃度，以致最終不能有效地提高光合效率。 3.2 脫羧酶基因的轉(zhuǎn)化 由于C3植物中PEPC基因的轉(zhuǎn)入未能有效地提高轉(zhuǎn)基因作物的光合效率，因此，人們又將C4循環(huán)中與脫羧相關(guān)的酶基因?qū)薈3作物中，如磷

13、酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenopyruvate carboxykinase，PEPCK) 和NADP-ME。由于PEPCK是細(xì)胞質(zhì)型的酶，若將其轉(zhuǎn)到細(xì)胞質(zhì)中，其脫羧反應(yīng)發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中，因而使得四碳雙羧酸僅在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行無效循環(huán)，并不能提高葉綠體內(nèi)的CO2濃度，從而也難以提高Rubisco的效率。因此，人們開始嘗試把脫羧相關(guān)酶基因轉(zhuǎn)到葉綠體中。 Hausler等將來自于F.pringlei的NADP-ME或S. meliloti的PEPCK基因連同來自C.glutamicum的 PEPC基因一同導(dǎo)人煙草中，結(jié)果對(duì)植物的光合表現(xiàn)并未產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性的影響。Lipka等報(bào)道，將PEPC基因和N

14、ADP-ME基因分別轉(zhuǎn)入細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中，結(jié)果除了能在高光強(qiáng)、高溫下對(duì)同化CO2的電子需求有所降低外，其光合作用效率依然沒有改善。 3.3 葉綠體內(nèi)磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的再生 將PEPC和NADP-ME基因引入C3植物，都未能有效地改善C3植物光合作用，因而人們又將注意力放在轉(zhuǎn)基因植物中葉綠體內(nèi)PEP再生問題上。PPDK催化葉綠體內(nèi)PEP的生成。Ku等報(bào)道，過量表達(dá) PEPC和PPDK的轉(zhuǎn)基因水稻的光合能力和產(chǎn)量分別增加35和22，這種結(jié)果有可能是由于PPDK基因的導(dǎo)入增加了葉綠體中PEP的含量所致，當(dāng)然，這只是一種猜想，還需進(jìn)一步的試驗(yàn)證明。 3.4 葉綠體中PEP的輸出 將葉綠體中由

15、PPDK或PEPCK催化形成的PEP 有效地轉(zhuǎn)運(yùn)出去是在C3植物中運(yùn)行C4循環(huán)的一個(gè)前提條件。C3植物中計(jì)綠體型的PEP轉(zhuǎn)運(yùn)器 (phosphoenolpyruvate/phosphate translocator，PPT)僅有很低的活性，勢(shì)必成為四碳雙羧酸循環(huán)的一個(gè)限制因素。據(jù)Hiiusler等引自UI Fliigge實(shí)驗(yàn)室未發(fā)表資料表明，來自花椰菜芽的PFF基因在CaMV35S啟動(dòng)子調(diào)控下導(dǎo)入煙草，轉(zhuǎn)化體中PEP轉(zhuǎn)運(yùn)速度同野生型相比提高了10倍。但目前對(duì)PPT活性的調(diào)節(jié)因素、 PPT基因的表達(dá)、調(diào)控方式以及它在植物代謝中的作用等了解得還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。今后還需在轉(zhuǎn)運(yùn)器基因的克隆和功能分析上作更深

16、入的研究，從而為提高植物光合效率提供新的思路。 3.5 碳酸酐酶(carbonic anhydrase，CA) CA在C4光合中是一種很關(guān)鍵的酶，它在光合作用的初始階段，催化CO2到HCO-3的快速轉(zhuǎn)化，而 HCO-3是PEPC作用的底物。據(jù)李衛(wèi)華等援引Hatch 等(1990)的研究結(jié)果，CA有兩種，即細(xì)胞質(zhì)CA和葉綠體CA。C4植物體內(nèi)的CA主要是細(xì)胞質(zhì)CA，而C3 植物的CA主要是葉綠體CA，這兩種CA動(dòng)力學(xué)性質(zhì)及對(duì)CO2的親和力和對(duì)抑制劑的敏感性相似。C3植物的CA存在于葉綠體中，所以當(dāng)將C4植物的PEPC基因?qū)隒3作物的同時(shí)，是否需要考慮將C4型的CA基因一同導(dǎo)入，目前還未見這方面

17、的報(bào)道。 3.6 轉(zhuǎn)化受體對(duì)C4循環(huán)酶代謝反應(yīng)具有種間差別 Hausler等的研究結(jié)果表明，即使是親緣關(guān)系比較近的物種如馬鈴薯和煙草，對(duì)于C4循環(huán)中基因的過量表達(dá)反應(yīng)也有很大差別。例如，過量表達(dá)PEPC的轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)于細(xì)胞質(zhì)型NADP-ME的誘導(dǎo)與轉(zhuǎn)PEPC 馬鈴薯相比極不明顯。而且，在表達(dá)PEPC/NADP-ME 馬鈴薯的雙轉(zhuǎn)化體中，觀察到了光呼吸減弱的現(xiàn)象，而該現(xiàn)象只在轉(zhuǎn)單一PEPC基因的煙草中觀察到。C4循環(huán)酶在C3作物中代謝的種間差異將會(huì)在一定程度上阻礙高光效基因工程育種的發(fā)展。 3.7 多基因轉(zhuǎn)化 C4循環(huán)系統(tǒng)是多種酶相互作用的復(fù)雜的生化反應(yīng)途徑。在高光效基因工程育種的初級(jí)階段，大多

18、研究集中于將單一C4循環(huán)酶導(dǎo)入C3作物中。從已有的研究結(jié)果來看，單單轉(zhuǎn)一種C4循環(huán)酶到C3作物中，其光合作用效率并沒有得到明顯的改善。目前，國外的研究已將注意力轉(zhuǎn)移到多基因的轉(zhuǎn)化上。據(jù)Hausler 等引自未發(fā)表資料表明，通過逐步轉(zhuǎn)化，已獲得了轉(zhuǎn)PEPC(或突變的內(nèi)源PEPC)，NADP-ME，PPDK及 PPT基因的馬鈴薯，正等待著進(jìn)行全面分析。各種轉(zhuǎn)單 C4循環(huán)基因的煙草通過雜交，已獲得了攜帶有多種C4 循環(huán)基因PEPC，NADP-ME，PPDK，PEPS (phosphoenolpyruvate synthetase)，PEPCK，PPT的各種組合的煙草。 4 前景展望 當(dāng)C3植物和C4植物分別處于各自適宜的生長條件下，C4植物比C3植物高產(chǎn)。同C3植物相比，C4植物具有較高的水分和氮素利用率，這樣可增加其干物質(zhì)產(chǎn)量。大約90的陸生植物包括主要的糧食作物如水稻、小麥、馬鈴薯等及主要的經(jīng)濟(jì)作物如大豆、甜菜等都