2022年細胞色素P450的特性

1、細胞色素P450的特性及其研究進展摘要：細胞色素P450是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上混合功能氧化酶系統(tǒng)的末端氧化酶，在生物體內(nèi)分布廣泛，主要催化機體內(nèi)源和外源性物質(zhì)在體內(nèi)的氧化反響。在臨床藥物的生物學(xué)轉(zhuǎn)化中，它參與大局部藥物的生物氧化，因此具有重要的生物學(xué)意義。關(guān)鍵詞：細胞色素P450 特性 機理 功能 Characteristics of cytochrome P450 and its research developmentABSTRACT: Being the terminal oxidase component of mixed function oxidase system in the membr

2、ane of endoplasmic reticulum,cytochrome P450 (CYP450) has been found in all living organisms and can catalyze the oxidation of a variety of endogenous and xenobiotic compounds. This article reviewed the mechanistic explorations on CYP450- catalyzed reactions , especially the recent investigations on

3、 the mechanism of ethanol oxidation catalyzed by CYP450, as well as those in CYP450 drug metabolism.Keywords cytochrome P450; structure; catalytic mechanism; function 前言細胞色素P450是一組構(gòu)造和功能相關(guān)的超家族基因編碼的含鐵血紅素同工酶，主要存在于肝細胞平滑肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，由血紅素蛋白、黃素蛋白及磷脂三局部組成，相對分子質(zhì)量在40 00060 000之間，因其具有血色素類似的構(gòu)造，且其復(fù)原態(tài)與一氧化碳作用后，在450nm處有一個

4、吸收頂峰，因此而被命名為細胞色素氧化酶P4501。CYP450家族成員之間的一級構(gòu)造差異很大，但空間構(gòu)造卻有著較大的相似性，含有由含鐵血紅素和半胱氨基酸組成的活性中心。 1 分布特點細胞色素P450酶系統(tǒng)廣泛分布于動物、植物和微生物體內(nèi)，是自然界中含量最豐富、分布最廣泛、底物譜最廣的相代謝酶系。其分布具有一定的選擇性，它分布于外源化合物進入人體內(nèi)的主要入口組織，這些組織是對經(jīng)皮膚和口腔進入生物體的外源化合物的第一道防線。微粒體細胞色素P450分布于全身各組織中，但以肝臟細胞含量最豐富，參與藥物、致癌物、類固醇激素和脂肪酸的代謝。人體內(nèi)細胞色素P450主要存在于肝臟和小腸中，此外腎、腦、肺、皮膚

5、、腎上腺、胃腸等臟器組織也有P450存在，不僅存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在線粒體或核膜內(nèi)均有P450的存在，腫瘤組織中也有細胞色素P450存在2-3。1李曉宇，劉皋林CYP450酶特性及其鹿用研究進展中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2021，13(8)：942-9462Sissung TM，Price DK，Sparreboom A，et a1Pharmacogenetics and regulation of human cytochromeP450 1 BI：implications in hormone mediated tumor metabolism and a novel target for the

6、rapeutic interventionMol Cancer Res。2006，4(3)：135-1503Oyanul T，Sngio K，lm T，et a1Expression of cytochromeP450 in nonsmall cell lung cancerFront Biosci，2021，13：5787-57932 性質(zhì)特點細胞色素有很多種，例如細胞色素a、b、c、d等。細胞色素P450屬b類細胞色素，是一種含亞鐵的卟啉蛋白，即血紅素蛋白，本身具有典型的可見光吸收光譜。在一定條件下，與其他化合物結(jié)合時，原有的吸收光譜將發(fā)生改變，形成的吸收光譜稱為“示差譜(differen

7、ce spectrum)。氧化型細胞色素P450可與多種藥物例如苯巴比妥、環(huán)境污染物和農(nóng)藥例如滴滴氧化型細胞色素涕等在CYP的疏水部位結(jié)合，形成的吸收光譜稱為型示差譜，最大吸收峰在390nm附近(385390nm)，最低吸收谷在420nm附近418427nm；所結(jié)合的化合物稱為型配體ligand，這些配體大的底物，有的對CYP還具有誘導(dǎo)作用。氧化型細胞色素P450，如與一些含氮的有機化氧化型細胞色素合物如煙鹼、烷基咪唑等相結(jié)合，那么形成型示差譜，其結(jié)合部位是細胞色素P450的血紅素鐵，最大吸收峰在430nm附近430435nm，最低吸收谷在395nm附近390410nm，所結(jié)合的化合物稱為型配

8、體，其中多數(shù)對CYP具有抑制作用。復(fù)原型細胞色素P450可與胡椒基丁醚、SFK-525A、乙基胩等相結(jié)合，形成的吸收光譜稱為型示差譜，最大吸收峰在430nm，最低吸收谷在390nm；所結(jié)合的化合物稱為型配體，胡椒基丁醚和SFK-525A兩種配體是重要的CYP抑制劑。復(fù)原型細胞色素P450與CO相結(jié)合，形成一種特殊的吸收光譜，稱為CO示差譜，最大吸收峰為450nm448450nm。3 構(gòu)造特點細胞色素P450與一氧化氮合酶(NOS)一樣都是以硫醇鹽結(jié)合血紅素為活性中心催化氧原子轉(zhuǎn)移的氧化復(fù)原酶, 都需要亞鐵血紅素(HEM)活化氧. 活性中心HEM的鐵離子一側(cè)與半胱氨酸的硫絡(luò)合, 另一側(cè)可與水中的

9、氧分子絡(luò)合. 細胞色素P450中絕對保守的半胱氨酸與催化活性中心亞鐵血紅素中鐵元素形成硫醇鹽離子鍵, 成為鐵的一個配體2. 這正是細胞色素P450中的鐵能與一氧化碳絡(luò)合, 并在450 nm存在特征吸收的原因, 最初名稱也由此而來. 數(shù)十個細胞色素P450晶體構(gòu)造顯示不同種屬間的序列差異較大, 但其三維構(gòu)造高度保守. 所有細胞色素P450都基于序列維持整個構(gòu)造折疊彎曲的相似, 其二級構(gòu)造用典型細胞色素P450折疊命名法標(biāo)示, P450 StaP的折疊構(gòu)造和對應(yīng)折疊彎曲構(gòu)造的名稱3. 從鏈霉菌別離出的咔唑生物堿星孢菌素(Staurosporine)具有強抗癌作用, 其生物合成的關(guān)鍵步驟是由P450

10、 StaP催化底物色素吡咯(chromopyrrolicacid, CPA)氧化脫氫,形成分子內(nèi)CC鍵成咔唑環(huán), 經(jīng)氧化脫羧完成. 盡管P450 StaP催化反響不同于常見的細胞色素P450對碳氫鍵的羥基化, 但是其構(gòu)造具有細胞色素P450家族的酶特有的相似折疊構(gòu)造和一樣的氧化活性中心(HEM), 從N端到C端包含螺旋構(gòu)造為A, B, C, D, F, E, G, H, I, J, K, L以及相似的折疊構(gòu)造. 不盡一樣的過渡螺旋構(gòu)造, 那么通過標(biāo)注'區(qū)別, 如B', K'等. 晶體構(gòu)造顯示P450 StaP結(jié)合底物CPA的三種方式: 一種是位于由Hem, B'

11、2和I螺旋、連接F, G螺旋的回轉(zhuǎn)構(gòu)造(F/G loop)“縫制而成的活性中心口袋中, 其它兩種結(jié)合方式的意義尚不十分清楚, 但可能提醒了底物進入活性中心的可能通道3.從另一角度觀察一些細胞色素P450與底物結(jié)合的空間構(gòu)象, 可以明顯看到圍繞I 螺旋外表形成通向活性位點的開/關(guān)運動的通道. 在釕與光敏劑絡(luò)合后與底物結(jié)合, 再與P450 cam酶結(jié)合, X 光晶體衍射顯示出P450 cam的亞分子構(gòu)造和隱藏在深處活性位點的立體構(gòu)造和性質(zhì),其中釕到活性中心鐵的間距即具有催化活性的大溝的深度為21 Å. 綜合幾種細胞色素P450的構(gòu)造顯示, 亞鐵血紅素基團均被限制在末端的螺旋I和鄰近的螺旋

12、L之間.接近催化中心的半胱氨酸與鄰近主鏈的氨基形成兩個氫鍵; 長螺旋I形成了亞鐵血紅素口袋內(nèi)壁, 并且包含了特征氨基酸序列; 高度保守、具有酸性殘基的蘇氨酸位于活性位點, 參與催化作用35,8,9. 盡管細胞色素P450酶系的折疊構(gòu)造高度保守, 但還是有足夠的構(gòu)造差異, 以便大小不同的底物與不同種類細胞色素P450結(jié)合.2 Wang, B.; Su, X.-S.; Zhang, S.-H. Chin. J. Org. Chem. 2005, 25(3), 342 (in Chinese). (王斌, 蘇喜生, 張聲華, 有機化學(xué), 2005, 25(3), 342.)3 Masatomo, M

13、.; Hiroshi, S.; Yoshitsugu, S.; Shumpei, A.; Hiroyasu, O.; Shingo, N. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.2007, 104(28), 11591. 4 Ivan, J. D.; Brian, R. C.; Jonathan, J. W.; Jay, R. W.; Harry, B. G. Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999, 96(23), 12987. 5 Scott. E. E.; He, Y. A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.

14、 A. 2003, 100(23), 13196. 6 Zhao, Y.-H.; White, M. A.; Muralidharaet, B. K.; Sun, L.; Halpert, J. R.; Stout, D. C. J. Biol. Chem. 2006, 281(9), 5973. 7 Muralidhara, B. K.; Negi, S.; Chin, C. C.; Braun, W.; Halpert, J. R. J. Biol. Chem. 2006, 281(12), 8051. 8 Pylypenko, O.; Schlichting, I. Annu. Rev.

15、 Biochem. 2004, 73, 991. 9 Wade, R. C.; Winn, P. J.; Schlichting, I. J. Inorg. Biochem. 2004, 98(7), 1175.4 催化反響特點細胞色素P450酶系在自然界可能是最具有催化多樣性的酶系，已從動物、植物、真菌和細菌等研究說明有多種不同的催化反響歸功于細胞色素的作用Black et al.1987，Gonzalea 1989。的化學(xué) 結(jié) 構(gòu) 是 一 種 含 個 鐵 原 子 的葉琳 蛋白。其 參 與氧 化代 謝 的總 反響式如下:RH+O2+NADPH+H+ P450 ROH+H2O+NADPH+4.

16、1 底物識別與結(jié)合的誘導(dǎo)-契合機制細胞色素P450催化的反響在以水為溶劑的環(huán)境中進展, 而底物是反響惰性的多種構(gòu)造不同的脂溶性有機物, 難溶于水. 細胞色素P450在維持其折疊方式的同時, 需要適應(yīng)和容納不同構(gòu)造的底物、兼顧水與有機相, 讓底物進入深埋著的活性中心. 細胞色素P450通過誘導(dǎo)-契合機制識別底物是由六個“底物識別位點(substrate recognition sites, SRS)來執(zhí)行的: B'螺旋區(qū)(SRS1), 螺旋F和G的一局部(SRS2和SRS3), 螺旋I的一局部(SRS4), 螺旋K的2連接區(qū)(SRS6), 以及發(fā)夾區(qū)(SRS5). SRS是柔性蛋白質(zhì)區(qū)域

17、, 能夠移動到底物, 并結(jié)合在一起, 在“誘導(dǎo)-契合機制作用下, 促成與底物的結(jié)合, 以及隨后的催化反響. SRS的點突變很大地影響酶識別與結(jié)合底物的特性. P450 2B4的晶體構(gòu)造顯示了從蛋白質(zhì)外表穿過周圍細胞色素P450特有的螺旋和折疊構(gòu)造延伸到活性中心HEM所敞開的裂縫57,10. 裂縫開口與閉合的構(gòu)象變化主要限于F到G, B'和C螺旋, N端的I和區(qū)域形成的“蓋帽構(gòu)造域. 將P450-2B4與抑制劑4-(4-氯苯)咪唑(CPI)結(jié)合前后的構(gòu)象比照, 可以明顯看到構(gòu)象的重排變化6. 顯示了大規(guī)模的構(gòu)象變化主要由構(gòu)造保守的局部之間再布局, 伴隨顯著的少許二級構(gòu)造的重塑。4.2 催

18、化氧化反響過程細胞色素P450催化反響過程典型的反響是通過電子傳遞系統(tǒng)，將分子氧復(fù)原，并將其中的一個氧原子加到底物中，反響需要細胞色素p450復(fù)原酶 NADPH。后者通過2個輔基FAD和FMN，從NADPH轉(zhuǎn)移2個電子給不同的P450酶系。由細胞色素P450與NADPH組成的單加氧酶系能夠催化多種內(nèi)源外源物在體內(nèi)的氧化反響，使化學(xué)物質(zhì)的活性或毒性、藥物的藥效發(fā)生變化。然后釋放氧化的底物，P450酶回到初始狀態(tài)。P450BM-3由含HEM構(gòu)造域和FMN/FAD復(fù)原酶構(gòu)造域兩局部通過一個單肽鏈連接而成19.細胞色素P450活性中心的鐵被復(fù)原形成亞鐵血紅素后, 容易結(jié)合到分子氧, 形成亞鐵P450-

19、二氧復(fù)合物. 三價鐵復(fù)原和結(jié)合氧氣分子的反響方程如下21: P-Fe(III)O2e- P-Fe(II)-O2過氧化氫可取代氧氣分子氧化底物, 使細胞色素P450催化氧化過程產(chǎn)生捷徑22. P-Fe(III)H2O2 P-Fe(III)-O-OHHP-Fe(II)-O2 經(jīng)第二個單電子復(fù)原和質(zhì)子化, 形成Fe(III)-氫過氧化復(fù)合物P-Fe(III)-O-OH. P-Fe(II)-O2eHP-Fe(III)-O-OHH2O卟啉環(huán)的體系富含電子, 容易被Fe(III)-氫過氧化復(fù)合物中的氧氧化, 即氧的電負(fù)性較大, 電子流向氧, 形成陽離子自由基, 得到體系局部的穩(wěn)定作用. 過氧鍵不穩(wěn)定, 經(jīng)

20、結(jié)合質(zhì)子和異裂產(chǎn)生一分子水和高活性的氧合鐵中間體. 鐵表觀化合價升為5價, 得到卟啉環(huán)體系的絡(luò)合穩(wěn)定. PFe(III)-O-OH H PFe(IV)OH2O 高價鐵氧中間體PFe(IV)O的形成是整個催化循環(huán)過程中的限制性步驟, 正是該氧鐵卟啉陽離子自由基, 即能提供單電子, 又含正電荷, 提供活性氧原子, 在水溶液中能夠?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)移氧原子, 插入到惰性的CH鍵中, 實現(xiàn)溫和條件下烴的羥基化2326。氧合鐵中間體PFe(V)O中的鐵為高價五價, 具有較高的氧化能力, 而細胞色素P450底物上的碳氫鍵正好接近高價鐵原子. 氧原子從氧合鐵中間體遷移到底物上, 形成氧化產(chǎn)物. 最后, 產(chǎn)物被水或新的底

21、物取代, 從復(fù)合狀態(tài)解脫離去, 完成循環(huán). 至此, 細胞色素P450完成了羥基化作用.21 Han JH, Yoo SK, Seo JS, et al. Biomimetic alcohol oxidations by aniron(III) porphyrin complex: relevance to cytochrome P-450 catalyticoxidation and involvement of the two-state radical rebound mechanism J. Dalton Trans, 2005, 2: 402 - 40622 Machman R, Gu

22、o Z, Guengerich FP, et al. The mechanism of oxidation of allylic alcohols to unsaturated ketones by cytochrome P450 J.Chem Res Toxicol, 1996, 9: 223 - 22623 Wang Y, Yang C, Wang H. et al. A new mechanism for ethanol oxidation mediated by cytochrome P450 2E1: Bulk polarity of the activesite makes a d

23、ifference J. Chem Bio Chem, 2007. 8: 277-28124 Wang Y, Kumar D,Yang CL, et al. Theoretical study of N-demethylation of substituted N,N-dimethylanilines by cytochrome P450: Themechanistic significance of kinetic isotope effect profiles J. J Phys Chem B, 2007, 111: 7700-771025 Wang Y, Wang HM, Wang YH

24、, et al. Theoretical study of the mechanism of acetaldehyde hydroxylation by compound I of CYP2E1 J. J Phys Chem B, 2006, 110: 6154-615926 Li DM, Wang Y, Yang CL, et al. Theoretical study of N-dealkylation of N-cyclopropyl-N-methylaniline catalyzed by cytochrome P450: insight into the origin of the

25、regioselectivity J. Dalton Transactions,2021, 2: 291-2975 影響P450活性的因素某種化合物在體內(nèi)的新陳代謝受多種因素的影響,包括基因差異,環(huán)境的物理、化學(xué)特性和生物體的生理狀態(tài)等。5.1 誘導(dǎo)作用生物體中的酶可分為構(gòu)造酶和誘導(dǎo)酶。就P450同工酶來說,其基 因超過200種。在一般條件下,只有一小局部基因在細胞中被持續(xù)地 轉(zhuǎn)錄、翻譯,其數(shù)量恒定,為構(gòu)造酶而很大一局部基因的表達那么在一定程度上受激素和化學(xué)物質(zhì)刺激的影響。這些在細胞中數(shù)量不恒定的酶 被稱為“誘導(dǎo)酶。酶的誘導(dǎo)通常伴隨著一定的單氧氧化酶活力的提 高但酶數(shù)量的增加并不意味著酶活力一

26、定有相應(yīng)的提高。能誘導(dǎo)P450基因的外來物至少可分為3類2-3:3-MC(3-甲基膽蕙)型、PB(苯巴比妥)型和混合型(介于前兩者之間)。不同動物對同一誘導(dǎo)劑的敏感性不同; 而且,即使是在的同一亞族中,誘導(dǎo)劑對不同同工酶的調(diào)節(jié)也是不同的。這說明誘導(dǎo)作用可能涉及到不同的受體。對于芳烴及其類似化合物二嗯瑛類,來說,細胞中有一種溶質(zhì)受體 蛋白受體與它們有很高的親和力。在某些嚙齒類動物中,與 受體結(jié)合 的能力約為苯并花或3-MC的10000倍4,5。此類化合物在小鼠體內(nèi)的誘導(dǎo)途徑如下誘導(dǎo)劑和受體結(jié)合后,此復(fù)合物轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi),啟動核 內(nèi)的構(gòu)造基因開場轉(zhuǎn)錄。而受體本身也是此種位點的調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物。對甾族

27、化合物誘導(dǎo)基因的研究說明,它可能涉及到糖皮質(zhì)激素受體,該受體控制著肝臟中許多酶。而在對降脂類藥物基因的誘導(dǎo)作用研究 中,用親和層析純化了一種安妥明(clofibrate)受體6-8。5.2 抑制作用外來化合物通 常對P450酶表現(xiàn)為復(fù)合作用,即低濃度時誘導(dǎo),而 高濃度時抑制。抑制劑對P450的抑制方式是多樣的:主要作用于P450的輔酶(減少或破壞NAPDH/NADH)。其次是作為競爭電子的物質(zhì)或抑制性抗體作用于復(fù)原酶。還可直接作用于P450本身,如CO等可與P450中的血紅素不可逆地結(jié)合。此外,與酶作用底物構(gòu)造相似的化合物及 抑制性抗體的競爭作用,或缺氧也可抑制。某些抑制劑如烷基化試劑可與蛋白

28、共價結(jié)合,導(dǎo)致酶功能不可逆的破壞10.參考文獻見手機照片6 功能特性細胞色素P450吸引人們的注意不僅在于它參與了許多生物過程，也因為它催化作用的獨特的化學(xué)原理，即將分子氧斷裂并將其中一個氧原子插入到底物內(nèi)。雖然P450催化反響的化學(xué)機理已經(jīng)受到了廣泛的研究，但是很多呈現(xiàn)出迷人的挑戰(zhàn)性的難題和爭議仍然擺在人們的面前。對細胞色素P450催化反響機理的研究可以使我們更深刻的認(rèn)識這些生理過程，從而可以進一步對生理活動進展調(diào)控，使其的有利于我們的一面得到開展和應(yīng)用，不利的一面得到抑制甚至排除。P450的功能不僅降解化合物以獲得碳源，而且還解毒外源化合物以及合成具生物學(xué)活性的化合物如甾醇、前列腺素pro

29、taglandins和花生四烯酸酯arachidonate代謝物。由于底物構(gòu)造通常是疏水化合物，而產(chǎn)物的水溶性更高，因此P450可用于處理環(huán)境有毒物質(zhì)，如多環(huán)芳烴和碳氟化合物fluorocarbons。P450也被用于基因治療以補償重要代謝途徑缺損，如補償CYP21或CYP17這些在甾醇發(fā)生中起重要作用的蛋白。另外，P450可被用于使立體和位置選擇性的化合物加單氧化作用以產(chǎn)生重要的生物活性，如將花生四烯酸轉(zhuǎn)化為14,15-EET，這一活性在調(diào)節(jié)K+Ca2+注入腎中起重要作用細胞色素P450酶系催化的藥物的生物轉(zhuǎn)化是藥物代謝中最重要的一個系統(tǒng)，因此，細胞色素P450催化反響的機理的研究對制藥行業(yè)有著重大的意義。相對于人體來說，絕大局部藥物都是異源體，最終都不能存在于人體內(nèi)，必于通過降解和排泄從人體內(nèi)消失 研究藥物經(jīng)CYP450介導(dǎo)的生物轉(zhuǎn)化，明確其代謝途徑，對制定合理的臨床用藥方案劑型設(shè)計及新藥開發(fā)工作都具有重要的指導(dǎo)意義。外源物質(zhì)可調(diào)節(jié)誘導(dǎo)和減少P450 的基因表達。如氯仿和四氯化碳可減少 CYP3A1 基因