漆酶基因在大腸桿菌中的克隆及誘導(dǎo)條件優(yōu)化-應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報

1、漆酶基因Iac1338在大腸桿菌中的表達(dá)條 件優(yōu)化及染料降解初步研究 國家自然科學(xué)基金工程 30970107 Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 30970107)馮娟覃炎鋒李荷廣東藥學(xué)院根底學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系廣東廣州510006摘要：在搖瓶水平上，采用單因素試驗方法，對已構(gòu)建好的表達(dá)漆酶蛋白HIS-Lac1338的工程菌BL21(DE3) /pET32a(+)-lac1338的誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，以期提高蛋白產(chǎn)量降低生產(chǎn)本錢。研究了培養(yǎng) 溫度、誘導(dǎo)時間、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)濃

2、度、銅離子(Cu2+)濃度等不同條件對 HIS-Lac1338表達(dá)量和活性的影響。通過聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)分析確定最正確表達(dá)條件，用酶標(biāo)儀測其酶活性。結(jié)果顯示，溫度為30 °C,初始菌體濃度 OD600為1.6，加終濃度為0.2 mmol/L的IPTG及終濃度0.5 mmol/L 的Cu2+，培養(yǎng)16 h，融合蛋白表達(dá)量提高了約2.5倍，為450 mg/L，是已報道的最高表達(dá)量；以2, 2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)為底物測純酶的比酶活為22.8 U/mg。染料降解作用顯示其對剛果紅和靛紅有95%以上的降解能力。研究說明，該工程菌產(chǎn)漆

3、酶量高且大局部為可溶性蛋白，可以快速 生產(chǎn)，具有較好的應(yīng)用價值。關(guān)鍵詞 漆酶；大腸桿菌；表達(dá)；條件優(yōu)化；染料降解CLC Q936 : Q78Optimization of the expression of the genlac1338 encoding laccase in Escherichia Coliand degradation to different dyesFENG Juan QIN Yan Feng LI He 通訊作者 Corresponding author (E-mail: lihe32163 )Department of Biochemistr y&Molec

4、ular Biology,Guangdong Pharmaceutial University, Guangzhou 510006, ChinaAbstractObjectives In order to improve the expression level of lac1338 gene in Escherichia coli , four factors forproducing HIS-Lac1338 by recombinant strain BL21(DE3) /pET32a(+)-lac1338 : culture temperature, inducing2+time, th

5、e final concentration of inductor Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) and Cu , were investigated. The optimized factors were determined by single factor analysis experiments.Methods: The optimum expression conditions were analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresi

6、s, meanwhile the activities were detected by enzyme-labeled instrument.Results BL21(DE3) /pET32a(+)- lac1338 cells induced under the optimized conditions (incubation at 30 C, at a2+initial bacteria density of OD6oo 1.6, induction with 0.2 mmol/L IPTG and 0.5 mmol/L Cu for 16 h) resulted in the accum

7、ulation of large amounts of soluble laccase. The culture provided 450 mg/L of laccase, which was increased by 250% compared to that under the original fermentation condition. Its activity was determined by its one-step purification through His-Binding-Resin affinity chromatography 1and the specific

8、activity to ABTS under the optimal conditions could reach 22.8 U/mL . Its degradation to different dye showed it could degrade more than 95% of Congo red and Indigo carmine.Conclusions Overall, the optimized process to express HIS-Lac1338 in E. Coli provided high amounts of soluble, and active recom

9、binant protein. The high expression yield permits fast and easy production for further basic and applied research.Keywords laccase;Escherichia coli ; expression； optimization of conditions; degradation to dyesCLC Q936 : Q78漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，最早是從日本的漆樹汁中發(fā)現(xiàn)的，在植物、真菌、細(xì)菌中廣泛存在2。隨著漆酶功能的逐步發(fā)現(xiàn)，漆酶的研究受到普遍的重視，它在降解木質(zhì)素

10、方面的功能3- 4，使其在制漿造紙工業(yè)，特別是紙漿生物漂白方面得到深入的研究和開發(fā)；在生物能源的開發(fā)利用方面應(yīng)用廣泛，如 利用漆酶降解木質(zhì)纖維原料中的木質(zhì)素，用于提高纖維素水解成單糖的效率及生產(chǎn)乙醇等新能源5;在環(huán)保方面具有很大的應(yīng)用潛力，如可去除有毒的非酚類、除草劑、殺蟲劑7、合成有機(jī)物8-9、石油工業(yè)廢物等物質(zhì)的毒性。近年來對細(xì)菌漆酶的研究越來越深入，它相比真菌漆酶有很多優(yōu)勢，如耐高溫，耐高pH 等，使其在環(huán)境治理方面有更廣闊的研究和應(yīng)用前景。目前限制漆酶廣泛應(yīng)用的重要因素是：重組蛋白大多以包涵體 形式表達(dá)、表達(dá)量不高、表達(dá)溫度低于常溫等，導(dǎo)致漆酶產(chǎn)量低、價格昂貴，實現(xiàn)漆酶的異源高效表達(dá)是

11、 解決這一問題的有效途徑。枯草芽抱桿菌(B. subtilis)漆酶基因cotA在大腸桿菌E. coli中表達(dá)，但大局部是包涵體，只有10%是可溶性蛋白10;此外，地衣芽胞桿菌(B. licheniformis )漆酶基因cotA，在不同的溫度下誘 導(dǎo)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)18 °誘導(dǎo)時酶活性最高11，然而低溫條件不適合大規(guī)模生產(chǎn)，因此常溫誘導(dǎo)可溶性重組蛋 白有重要意義12。葉茂等人研究的漆酶基因lac159，最高表達(dá)量為380 mg/L13，仍然不能滿足工業(yè)應(yīng)用， 所以優(yōu)化表達(dá)條件獲得漆酶高表達(dá)量是一個亟待解決的問題 。本研究中l(wèi)ac1338(GenBank，登錄號HM623889)來源于海洋

12、宏基因庫，與所有漆酶基因的序列一致性 低于40%,為一個新型基因。將該基因構(gòu)建到重組質(zhì)粒pET-32a(+)并轉(zhuǎn)化入Escherichia coli BL2I(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)，探索在不同誘導(dǎo)條件下融合蛋白的表達(dá)量及對底物ABTS的相對活性雙重指標(biāo)，探索最正確表達(dá)條件，并研究其對不同染料的降解情況。研究結(jié)果對于擴(kuò)大發(fā)酵生產(chǎn)漆酶具有一定的參考價值，同時為盡快 生產(chǎn)出擁有自主知識產(chǎn)權(quán)及低本錢的漆酶打下根底。1材料與方法1.1 材料1.1.1 菌株和質(zhì)粒 重組質(zhì)粒 pET-32a-lac1338 為本實驗室構(gòu)建并保存， Escherichia coli BL2l(DE3) 為本實驗 室保存 。主要

13、試劑和儀器膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒購于 Omega；蛋白純化試劑盒購于德國Novagen公司；170 Mr/103 Prestained Protein Ladder購自廣州賽哲生物科技；2, 2'-連氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)購于Amresco公司；IPTG、氨芐青霉素購自TaKaRa公司。其他 常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。1.2 方法1.2.1 漆酶的誘導(dǎo)表達(dá) 將重組質(zhì)粒 pET-32a-lac1338 轉(zhuǎn)化入 Escherichia coli BL2l(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落接種到含氨芐青霉素 (Amp)的LB培養(yǎng)基中，37

14、°C、200 r/min過夜培養(yǎng)。次日按 1 %比例接種到 LB培養(yǎng)基(含Amp)中，37 °、220 r/min振蕩培養(yǎng)菌液至 OD600為1.6，參加IPTG至終濃度0.2 mmol/L 及Cu2+至終濃度0.5 mmol/L，30 °C誘導(dǎo)16 h ； 4 °、10 000 r/min離心3-5 min，收集菌體，冰浴進(jìn)行超 聲波破碎細(xì)胞(振幅設(shè)為300 W;超聲循環(huán)為：超聲 5 s,間隔5 s，時間設(shè)為 4 min) ； 4 °、12 000 r/min 離心10 min，分別取上清和沉淀煮沸5-10 min ； 4 °、12

15、 000 r/min離心10 min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測 (濃縮膠為 5 %，別離膠為 10 %)。融合蛋白表達(dá)量的測定采用多功能熒光分析系統(tǒng)及Image-lab軟件對SDS-PAGE電泳結(jié)果進(jìn)行分析，灰度掃描測定目的蛋白的百分比含量及 OD 值，以確定其相對含量及絕對含量。漆酶表達(dá)條件的優(yōu)化分別在不同的溫度、IPTG濃度、誘導(dǎo)時間、Cu2+濃度及不同的初始菌體濃度條件下對漆酶進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。通過 SDS-PAGE 電泳和酶活測定結(jié)果探索誘導(dǎo)條件對目的蛋白表達(dá)量的影 響。1 .2.4重組漆酶 HIS-Lac1338 的純化 參見 His?Bind? Purification Kit (

16、Novagen) 試劑盒說明書。目的蛋白濃度測定采用 BCA 法測定蛋白質(zhì)濃度，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)對照。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1，標(biāo)準(zhǔn)方程為 y=0.0347x+0.0142， R2=0.992。0.30.20.10.010Content of BSA( g g)圖1蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 The standard curve of protein酶活測定 以ABTS為底物，使3 ml檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液pH 6.0的反響體系中含5 mmol/LABTS、6 mmol/L Cu 2+和一定濃度的酶液樣品，將其混合均勻后于55 °水浴反響3 min，測OD420值，同時做不加酶液的空白

17、對照。 ABTS的摩爾消光系數(shù) £=36,000 M1cm-1。該條件下，每分鐘催化1 gmol ABTS氧化所需的酶量定義為1個酶活單位U。U =0.1844 >OD420 A/1XN/V2>to y=0.1844x為ABTS自由基濃度與吸光度值的關(guān)系曲線14; V1:反響總體積；V2：測定酶活時所取的酶液體積；N :酶液稀釋倍數(shù)；1.2.7 HIS-Lac1338對染料降解的研究漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，研究說明漆酶在染料廢水處理方面具有良好的應(yīng)用潛力，因此研究重組漆酶HIS-Lac1338對染料的降解作用及條件對其在染料工業(yè)中的應(yīng)用有著重要意義。本文考察了HIS-

18、Lac1338對多種工業(yè)染料莧菜紅，靛紅，溴酚藍(lán)，酸性紫7,結(jié)晶紫，橙紅G,剛果紅，羅丹明 B，亞甲基藍(lán)，考馬斯亮藍(lán) G250的降解作用。以不加酶液為空白對照，37 °搖床過夜16 h，并同時考察了 Ca2+與小分子介體ABTS對降解率的影響。降解率I=A0-A1/A0 >00%。 I，降解率；Ao，空白對照染料的光吸收值；A1,反響體系樣品染料的光吸收值。2結(jié)果與分析2.1漆酶表達(dá)條件的優(yōu)化誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度的優(yōu)化融合蛋白分別在 20 C、25 C、30 C和35 C下誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果如圖 2,不同的培養(yǎng)溫度對融合蛋白表達(dá)量和活性有較大的影響，當(dāng)誘導(dǎo)溫度到達(dá)30 C時，可溶性目的蛋白

19、的表達(dá)量到達(dá)峰值；誘導(dǎo)溫度高于 30、C時，目的蛋白主要以包涵體的形式存在。以ABTS為底物，測定各個誘導(dǎo)溫度時的HIS-Lac1338酶活性，如圖3，誘導(dǎo)溫度為30 C時HIS-Lac1338的酶活最大，所以選取 30 °C為最正確 誘導(dǎo)溫度。朋舸寤1圖 2 重組漆酶 HIS-Lac1338 的最正確誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度。M, Marker; Lane 1, 3, 5, 7: 20 °C, 25 °C, 30 °C , 35 °C 誘導(dǎo)破碎后上清蛋白；Lane 2, 4, 6, 8: 20 °C , 25 °C , 30 

20、6;C , 35 °C誘導(dǎo)破碎后沉淀蛋白Fig. 2 The optimal induction temperatures of HIS- Lac1338. M,Marker; Lane1,3,5,7: The supernatant proteinin duced at 20 °C, 25 °C , 30 °C, 35 °C; La ne 2, 4, 6, 8: The supernata nt protein in duced at 20° C , 25 °C , 30 °C , 35 °Cao604

21、0 hunbArtai1 eniprlurc(X?)圖3不同誘導(dǎo)溫度誘導(dǎo)后的HIS丄ac1338的酶活檢測及可溶性蛋白含量Fig. 3 Relative activity of HIS-Lac1338 expressed after different temperature and percentage of soluble protein誘導(dǎo)培養(yǎng)時間的優(yōu)化融合蛋白HIS-Lac1338分別誘導(dǎo)表達(dá)0、2、6、8、12、16、18、20、35h，由圖4可知，誘導(dǎo)時間為16 h時蛋白表達(dá)量最大，繼續(xù)延長誘導(dǎo)時間，蛋白表達(dá)量無明顯變化甚至 降低。以ABTS為底物，分別測定誘導(dǎo)不同時間的HIS-L

22、ac1338酶活，結(jié)果如圖5,誘導(dǎo)16 h的HIS-Lac1338酶活最大，繼續(xù)增加誘導(dǎo)時間，酶活逐漸降低，所以選取16 h為最正確誘導(dǎo)時間。圖4重組漆酶HIS-Lac1338的最正確誘導(dǎo)培養(yǎng)時間。M, Marker; Lane 1-9:誘導(dǎo)時間分別為0,2, 6,8,12, 16, 18, 20, 35 h的蛋白樣品Fig. 4 The optimal induction time of HIS-Lac1338. M,Marker; Lane 1-9:the supernatant protein induced for 0, 2,6,8, 12, 16, 18, 20, 35 h8flao

23、I I SflluWi pfgHnnm201G圖5不同誘導(dǎo)時間誘導(dǎo)后的HIS-Lac1338酶活檢測及可溶性蛋白含量Fig. 5 Relative activity of HIS-Lac1338 expressed after different intervals and percentage of solubleprotein2.1.3 IPTG 誘導(dǎo)濃度的優(yōu)化實驗采用不同濃度 IPTG 0.025、0.05、0.075、0.1、0.2、0.3、0.5 mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果如圖6,不同的IPTG濃度對融合蛋白表達(dá)量影響不大；以 ABTS為底物，對各樣品進(jìn)行酶活測定，由圖7可知，當(dāng)

24、IPTG終濃度為0.2 mmol/L時酶活最高，所以選擇IPTG濃度為0.2 mmol/L為最正確誘導(dǎo)濃度。1701301D070圖6 HIS- Lac1338的最正確IPTG誘導(dǎo)濃度。M,分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白；Lane1-8: IPTG終濃度分別為0, 0.025, 0.05,0.075, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5 mmol/L誘導(dǎo)時破碎后的上清蛋白；Fig. 6 The optimal concentration of IPTG of recombinant HIS-Lac1338. M, Marker； Lane1-8： the supernatantprotein of 0, 0

25、.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5 mmol/L;亠遲醴"童>-IKlGdnl)圖7 IPTG濃度誘導(dǎo)后的HIS丄ac1338酶活測定及可溶性蛋白含量Fig. 7 Relative activity of HIS 丄 ac1338 induced by different concentration of IPTG and percentage ofsoluble protein244誘導(dǎo) Cu2+濃度的優(yōu)化在不同 Cu2+濃度 0、0.1、0.25、0.5、1.0、2.0 mmol/L 下誘導(dǎo) HIS-Lac1338 表達(dá)，SDS-PA

26、GE電泳結(jié)果如圖8。以ABTS為底物，測定不同 Cu2+濃度誘導(dǎo)后的HIS-Lac1338的酶活，結(jié) 果如圖9。由圖可知，雖然 Cu2+濃度為0、0.1、0.25 mmol/L時的蛋白表達(dá)量與 0.5 mmol/L時相差不大， 但酶活相差很大，進(jìn)一步說明漆酶的活性位點(diǎn)需要Cu2+;但當(dāng)Cu2+濃度增加至1.0 mmol/L，2.0 mmol/L時HIS-Lac1338表達(dá)量大大降低，推測原因是Cu2+濃度太高抑制了菌體的生長。所以選取0.5 mmol/L為a Au Au Au - 7JAJ Au- 7f CJM J11二 t t iJ i i 二：im-最正確誘導(dǎo)Cu2+濃度。圖 8 HIS-

27、Lac1338 的最正確 Cu2+ 誘導(dǎo)濃度。M, Marker; Lane 1-6: Cu 2+ 終濃度分別為 0, 0.1, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 mmol/L 誘導(dǎo)破碎后的上清蛋白；2+Fig. 8 The optimal concentration of Cu of HIS-Lac1338. M, Marker; Lane 1-6: the supernatant protein of 0, 0.1,0.25, 0.5, 1.0, 2.0 mmol/L Cu2120Rt'hEivL'iKljvJlii%-)-_Sihuhk pmlcin in圖9不同濃

28、度Cu2+W導(dǎo)后的HIS-Lac1338的酶活檢測及可溶性蛋白含量2+Fig. 9 Relative activity of HIS-Lac1338 induced by different concentration of Cu and percentage ofsoluble protein加誘導(dǎo)劑時的初始菌體濃度加IPTG和CuSO4,超聲破碎菌體,在不同的起始菌體密度OD600為0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8，2.0時時的HIS-Lac1338活性，結(jié)果如圖11。由圖可知，當(dāng)起始菌體密度OD600為1.6時參加誘導(dǎo)劑，蛋白表達(dá)SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖10。以ABTS

29、為底物測定不同起始菌體密度量最大及酶活均為最高，所以選取起始菌體密度OD 600為1.6作為最正確起始密度。kDa17013D1QQ70也恤 1234567圖10加誘導(dǎo)劑前的最正確起始菌體濃度。M, Marker; Lane 1-7:菌體濃度為OD600為0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2.0時誘導(dǎo)破碎后上清蛋白Fig. 10 The optimal concentration of initial cell density of HIS-Lac1338. M,Marker； Lane 1-7： the supernatantprotein of 0.8, 1.0,

30、 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2.0 OD600 ;no°%圖11不同起始菌體密度誘導(dǎo)后的HIS丄ac1338的酶活檢測及可溶性蛋白含量Fig. 11 Relative activity of HIS-L ac1338 after induction at different initial cell density and percentage of soluble protein22重組漆酶HIS-Lac1338的純化及蛋白濃度測定重組菌株BL21/pET- lac1338在含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，參加IPTG至終濃度0.2mmol/L，及CuSO4至終濃度

31、0.5 mmol/L，30 °C誘導(dǎo)16 h，離心收集菌體，用超聲波破碎至澄清，上清液 即為粗酶液。粗酶液按His?Bind? Purification Kit Novagen試劑盒說明書純化，產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE檢測，見圖12。如圖，純化后的重組漆酶HIS-Lac1338為單一的條帶，分子量約為67 Mr/103其中18 Mr/103為表達(dá)載體上的融合蛋白標(biāo)簽，與理論預(yù)測蛋白分子量相同。根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得純化后的HIS-Lac1338的濃度為0.25 mg/ml，酶活測定顯示純化后的HIS-Lac1338酶活為5.7 U/ml，比酶活即為22.8U/mg。kD日 Marke

32、r 1231701301007055圖12純化后重組漆酶 HIS-Lac1338的SDS-PAGE電泳。M, Marker; Lane 1-3:純化后重組蛋白HIS-Lac1338Fig. 12 SDS-PAGE analysis of purified HIS- Lac1338. M,Marker; Lane 1-3: purified HIS-Lac13382.3 HIS-Lac1338對染料降解的研究HIS-Lac1338對10種染料的降解效果如圖13所示，由圖可知，當(dāng)添加Ca2+時能有效促進(jìn)HIS-Lac1338對染料的降解能力單獨(dú)使用 HIS-Lac1338時并不具備降解能力；當(dāng)同時

33、添加Ca2+和小分子介95%以上，對溴酚藍(lán)也有體ABTS時，其對染料降解能力得到一定的增強(qiáng)，對剛果紅及靛紅的降解率達(dá)50%以上的降解率，但對結(jié)晶紫，橙黃G,羅丹明B未見有明顯的降解能力圖13 HIS-Lac1338對不同染料降解情況比擬Fig. 13 Comparison of degradation rate of HIS 丄 ac1338 to different dyes3討論研究說明，低濃度IPTG和低溫條件可以提高可溶性蛋白的表達(dá)量15，但由于低溫誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白不宜大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，因此常溫誘導(dǎo)產(chǎn)生可溶性的重組蛋白有著極其重要的意義16。本研究中培養(yǎng)溫度為30 °C時蛋白表

34、達(dá)量較高且活性最高，適宜常溫大規(guī)模生產(chǎn)；誘導(dǎo)劑IPTG濃度對融合蛋白 HIS-Lac1338表達(dá)量及活性影響較小，本研究采用低濃度0.2 mmol/L，即可到達(dá)理想效果。在漆酶蛋白誘導(dǎo)表達(dá)過程中，添加外源銅離子不僅能輔助漆酶蛋白的正確折疊，提高漆酶的活性，還有助于提高漆酶的穩(wěn)定性17。研究說明 Cu2+濃度為0 mmol/L，0.1 mmol/L， 0.25 mmol/L時的蛋白表達(dá)量與 0.5 mmol/L時相差不 大，但酶活差異很大，進(jìn)一步說明漆酶的活性位點(diǎn)需要Cu2+。Dube E等研究的源于鏈霉菌屬Streptomyces coelicolor的漆酶在宿主鏈霉菌屬Streptomyce

35、s lividansLAF10-164異源表達(dá)，34 °C培養(yǎng)72 h蛋白量到達(dá)350 mg/L18；而Koschorreck等通過隨機(jī)突變和點(diǎn)突變 的方法提高 B. licheniformis漆酶基因 CotA的表達(dá)量，在18 °C過夜誘導(dǎo)培養(yǎng)，其表達(dá)量可達(dá)300mg/L19；目前報道的表達(dá)量最高的為葉茂等人研究的重組漆酶Lac159,其表達(dá)量為380 mg/L 13，因此重組漆酶HIS-Lac1338為漆酶基因中的最高表達(dá)量。本研究中的漆酶雖然表達(dá)量很高，但比酶活為22.8 U/mg (10.26 U/ml)較低。Obruca S等20用ABTS做誘導(dǎo)劑在鐮抱菌中獲得1

36、2.04 U/mL的漆酶活力；來自于擔(dān)子菌類 Basidiomycete Trametes sp在P. pastoris中異源表達(dá)，其最高可達(dá)8.3 X104 U/L(ABTS為底物)21。因此如何提高漆酶HIS-Lac1338的比酶活成為下一步實驗工作的重心。由于該酶表達(dá)水平較高，因此為了更好地應(yīng)用于工業(yè)，在接下來的工作中還需要對其酶學(xué)性質(zhì)如最適 溫度、最適pH等進(jìn)行研究；可以考慮通過定向進(jìn)化的方法獲得酶活提高的突變酶。該漆酶與其他漆酶不 同之處在于對愈創(chuàng)木酚沒有催化活性，其原因需作進(jìn)一步探索，所以在下一步的工作中，我們將對該漆酶 的三維結(jié)構(gòu)及底物作用位點(diǎn)進(jìn)行深入研究。ABTS等小分子介體不

37、僅能增強(qiáng)漆酶對染料的降解效率，而且能介導(dǎo)漆酶和非酶底物染料之間的氧化 作用，使得漆酶能降解非漆酶底物的染料22，例如偶氮類染料不是漆酶的底物，大局部的漆酶那么不能直接降解此類染料23，但HIS-Lac1338在ABTS及Ca2+協(xié)同作用下能完全降解偶氮類染料羅丹明；在靛系染料 中，只能降解靛紅，而不能降解靛藍(lán)，其原因可能是基團(tuán)結(jié)構(gòu)的差異性影響了漆酶HIS-Lac1338對其降解效果24。另外，接下來的研究可結(jié)合蛋白的三維結(jié)構(gòu)、染料的結(jié)構(gòu)及其作用方式通過定向進(jìn)化的方法提高 其染料降解率。參考文獻(xiàn)1 王國棟 , 陳曉亞 . 漆酶的性質(zhì)、功能、催化機(jī)理和應(yīng)用 J. 植物學(xué)通報 , 2003, 20

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