瘦肉精的檢測方法

1、瘦肉精的檢測方法1 測定原理“瘦肉精”克侖特羅競爭酶標免疫檢測方法快速測定的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)。酶聯(lián)板的微孔包被有針對兔抗克侖特羅特異性抗體的羊抗體(第二抗體。加入兔抗克侖特羅特異性抗體(第一抗體與第二抗體結(jié)合而被固定,洗滌后加入標準液或樣品溶液與酶結(jié)合物(酶標記抗原,標準液或樣品中的游離抗原與酶標抗原競爭兔抗克侖特羅特異性抗體上有限的結(jié)合位點。通過洗滌除去沒有與特異性抗體結(jié)合的酶標抗原,加入酶基質(zhì)(過氧化脲和發(fā)色劑(四甲基聯(lián)苯胺并孵育,結(jié)合到板上的酶標記物將無色的發(fā)色劑轉(zhuǎn)化為藍色的底物。加酸終止反應(yīng)后,顏色由藍色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。在單波長450 nm處測吸光度,吸收光強度與樣品中的克侖特羅濃度成反

2、比。2 試劑盒的組成每個盒中(包括標準分析孔材料如下:(11×96孔板(12排×8孔,包被有第二抗體(兔IgG抗體;(26個標準液(300ul/瓶為克侖特羅水溶液。濃度分別為0 ng/kg、100 ng/kg、300 ng/kg、900 ng/kg、2700 ng/kg、8100 ng/kg;(31個克侖特羅過氧物酶標記物濃縮液12 ml(紅色帽;(41個克侖特羅抗體濃縮液12 ml(黑色帽;(51個酶基質(zhì)/發(fā)色劑11 ml(藍色帽;(61個反應(yīng)停止液,1 mol/L硫酸14 ml(黃色帽;(71個緩沖液25 ml,酶標記物及抗體濃縮液稀釋用。3 試驗材料3.1 設(shè)備微孔板

3、酶標儀(450 nm、均質(zhì)器、冷凍離心機、離心管(50 ml、微量可調(diào)移液器(單道、八道、RIDAC18柱、濾紙(0.45m。3.2試劑甲醇(分析純、100%、50 mmol/LHCL、10 mmol/LHCL、50 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液(pH 3.0、500 mol/L 磷酸二氫鉀緩沖液(pH 3.0、1 mol/LNaOH。4 儲存條件試劑盒保存于2-8,不要冷凍。不用的微孔板放進原錫箔袋中并且與干燥劑一起重新密封。標準物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感,避免直接暴露在光線下。5 試劑變質(zhì)的跡象發(fā)色劑有任何顏色表明已變質(zhì),應(yīng)當棄之。0標準的吸光值小于0.6時,表示試劑可能變質(zhì)。6 樣品處理

4、6.1尿樣尿樣一般不用處理,取20清亮尿樣直接測定。如果尿樣混濁要過濾或離心至得到清亮尿樣。6.2肝臟、肉樣粉碎的5 g樣品與25 ml 50 mmol/L HCL混合,振蕩1.5 h,以達到均質(zhì)的目的。稱6 g均質(zhì)物(相當于1 g肝臟,加入離心管中。10-15條件下(非常重要4000轉(zhuǎn)/min或更高的轉(zhuǎn)速離心15 min。轉(zhuǎn)移上清液到另一個離心管中,加300l 1mol/L NaOH混合15 min。加入4 ml 500 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液(pH 3.0,簡單混合并在4保存至少1.5 h或過夜(非常重要。10-15條件下(非常重要4000轉(zhuǎn)/min或更高的轉(zhuǎn)速離心15 min。分離

5、全部上清液(應(yīng)是清亮的,非常重要,使其升至室溫(20-24,然后用RIDAC18柱純化。RIDAC18柱純化樣品必須在室溫條件下(20-24,并嚴格控制過柱時流速。用3 ml甲醇洗滌柱子,控制流速為1滴/s。用2ml洗滌液(50 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液pH 3.0,洗滌柱子。肝臟、肉樣的全部上清液進柱,控制流速為1滴/4s。用2 ml洗滌液(50 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液pH 3.0,洗滌柱子,流速為1滴/s。用正壓除去殘留的流體并用空氣或氮氣吹2 min,干燥柱子。用1 ml甲醇洗脫樣品,控制流速1滴/4s。在50-60并在弱空氣或氮氣流下完全蒸發(fā)甲醇溶劑。用1 ml蒸餾水溶解干燥

6、的殘留物,取20l進行分析。6.3飼料取10g飼料樣品,用10 mmol/LHCL溶解,連續(xù)震蕩10 min,用濾紙過濾,在濾液中加入120l 1mol/L NaOH 進行中和,檢查pH,用NaOH控制PH值在6.5-7.5之間,取上清液20l進行分析。稀釋倍數(shù)為25(即含有0.04 g飼料樣品/ml。7 測定步驟第一步:所有試劑及樣品在開始檢測前必須回升至室溫(20-24,測定操作在20-24下進行。第二步:用盒中緩沖液以體積110的比例稀釋實際用量的克侖特羅抗體濃縮液(黑色蓋,稀釋前輕輕混均抗體,不要猛烈振蕩。第三步:取出實驗需要數(shù)量的微孔板條,足夠標準和樣品所用的數(shù)量,標準和樣品做兩個平

7、行試驗,記錄標準和樣品的位置。剩余的微孔板條放進原錫箔袋中并且與提供的干燥劑一起重新密封,置于2-8冷藏。第四步:每個微孔中底部加100l稀釋后的抗體溶液,室溫(20-24孵育微孔板15 min,避免光線照射。第五步:孵育的同時進行酶標記物的稀釋,用盒中緩沖液以體積110的比例稀釋實際用量的克侖特羅酶標記物濃縮液(紅色蓋,稀釋前輕輕混均抗體,不要猛烈振蕩,避光放置。第六步:洗板,甩出孔中液體,將微孔架倒置在吸水紙上拍打,直到紙上無明顯水跡(拍打3次,以保證完全除去孔中的液體。用250l蒸餾水充入孔中,再次甩掉微孔中液體,并在吸水紙上拍打,重復(fù)操作兩次。加洗滌水的移液器管尖必須置于微孔上方約0.

8、5 cm處打出洗滌水,避免將板孔中的游離抗體帶入洗滌水中。洗板后立即進行下一步操作,不要讓板孔干燥。第七步:加入20l標準或處理好的樣品到各自的微孔底部,標準和樣品做兩個平行實驗。第八步:加入100l稀釋了的酶標記物至微孔底部,輕輕震蕩微孔析并在桌面上作圓周運動以混勻。移液器管尖不要接觸到孔中的混合物,避免交叉污染。第九步:室溫孵育微孔板30 min,避免放置,盡可能每隔10 min輕輕振蕩1次,準備好酶基質(zhì)/發(fā)色劑,并注意避光放置。第十步:洗板,同第六步。在洗板過程中加洗滌水的移液器置于微孔板上方0.5 cm處打出洗滌水,避免將板孔中的游離酶標記物帶入洗滌水中。第十一步:不要讓板孔干燥,迅速加入100l酶基質(zhì)/發(fā)色劑到每個孔中,步驟操作要迅速,避免頭尾反應(yīng)時間相差過長,輕輕振蕩板并在桌面上作圓周運動以混勻。移液器管尖不要接觸微孔中的混合物,避免交叉污染。第十二步:室溫暗處孵育微孔板15 min,暗處避光放置,同時準備好反應(yīng)停止液。第十三步:每孔加入100l反應(yīng)停止液,混勻,60 min內(nèi)用酶標儀測量450 nm處波長吸光度值。8 結(jié)果所獲得的標準和樣品吸光度值的平均值除以第一個標準(0標準的吸光度