金屬鰲離子使用說明

1、金屬鰲合填料鎳柱料說明書固定金屬離子親和柱主要用于金屬螯化離子。位于許多蛋白中的組氨酸殘基將會(huì)和許多金屬離子，例如鋅。銅，鎳，鐵等形成復(fù)合物。因此，該柱料能選擇性螯合一些具有組氨酸殘基的蛋白質(zhì)。但是半胱氨酸和咯氨酸殘基也能和固定化金屬螯和。但是親和力比組氨酸要弱。所以，結(jié)合的強(qiáng)度是和緩沖液的PH和金屬離子決定的。金屬螯和柱料主要是由亞氨基的乙酰乙酸成分耦聯(lián)瓊脂糖柱料，借助醚長(zhǎng)生7個(gè)原子的空間。全部容量：24-30um的含有zn的干膠柱料結(jié)構(gòu)：6%的高鉸鏈的瓊脂糖柱料大?。?5-165um平均微粒：90um直流速度：25度/0.1MPa/30倍柱床/5厘米高度/每小時(shí)可達(dá)700厘米最大壓強(qiáng)：0.

2、3MPaPH變化：長(zhǎng)期3-13       短期2-14化學(xué)穩(wěn)定：通用含水緩沖液0.01M鹽酸，1.0M NAOH, 20%乙醇（保存7天）物理性質(zhì)：可以忽略在PH或者離子變化下的體積變化耐熱性能：121度下0.1M乙酸鈉作用半小時(shí)金屬螯和柱料保存于事先填充于20%乙醇。所以要攪拌驅(qū)除20%乙醇溶液。換成去離子水。比例是25%去離子水和75%處理膠。處理金屬螯和柱料：1 平衡所有用到的材料于室溫。2 攪拌金屬螯和柱料3 倒水進(jìn)柱子，驅(qū)除氣體。用無離子水液封幾厘米。4 將金屬螯和柱料連續(xù)倒進(jìn)柱子，用玻璃棒支撐柱壁防止氣泡形成。5 然后立即用無離子水液封，裝上柱蓋，連

3、接上泵。6 打開柱子底部的開關(guān)，然后調(diào)節(jié)泵的流速。通常是不超過0.3MPa的。7 經(jīng)過一個(gè)穩(wěn)定的柱床填鴨后，維持填壓速度為3個(gè)柱苯甲脒瓊脂糖凝膠6B1 填料的準(zhǔn)備苯甲脒瓊脂糖凝膠6B可用20%的乙醇預(yù)脹。在包裝前，將漿狀混合物中的乙醇慢慢倒出，然后再倒入結(jié)合緩沖液至占總體積的25%（固定介質(zhì)占75%）。結(jié)合緩沖液中不能夠含有明顯增加粘性的試劑。在包裝完成以后，柱子可以使用含有較少的粘性試劑的緩沖液平衡。2瓊脂糖凝膠6B填料的包裝 1平衡所有的物質(zhì)至色譜將被使用的溫度 2填料的脫色 3用緩沖液沖洗柱子的每部分從而排盡里面的空氣。確保整個(gè)系統(tǒng)中沒有空氣。用幾厘米的緩沖液封閉柱子的排出口。 4連續(xù)地

4、將填料漿注入柱中。在裝料時(shí)使用玻璃棒引流可以最少地減少氣泡的進(jìn)入。 5然后立即用緩沖液填滿柱子的剩余部分，標(biāo)記下柱子的頂段，并連接柱子和蠕動(dòng)泵。 6打開柱子的出口，設(shè)置合適的（蠕動(dòng)泵）轉(zhuǎn)速。在隨后的層析操作中，流速最小應(yīng)為該速度的133%。但包裝中的最大流速是typically employed （參考表1） 備注：如果在最大線性流速時(shí)包裝，那么在隨后的層析操作中不能超過最大流速的75%。 7在達(dá)到恒定柱床高度時(shí)，維持3倍柱床體積的流速。如果想詳細(xì)了解柱子的包裝過程，可以參考我們的色譜分析手冊(cè)，原則和方法（18-1022-29），可以從3連接器的使用連接器應(yīng)該符合以下要求： 1在填料按照上述方

5、法包裝之后，關(guān)閉柱子的出口和從柱子上移動(dòng)上端。小心地用緩沖液將柱子的剩余部分填滿，在上端形成一個(gè)新月面。 2將連接器按照一定角度插進(jìn)柱子中，并確保沒有帶進(jìn)空氣。 3使這一階段處于管狀連接狀態(tài)，柱子和泵、柱子和樣品裝置閥之間不能夠有氣泡存在。 4慢慢擰開活塞，以便于空氣排出柱子系統(tǒng)，洗脫液慢慢進(jìn)入毛習(xí)管。柱子入口內(nèi)側(cè)的閥門應(yīng)該處于正確的方向，從而確保在此操作中空氣能夠順利的排出。 5在填料的表面將連接器固定一個(gè)合適的位置，打開柱子的出口和開始洗脫。用過柱洗脫液，以包裝流速洗脫柱子，直到柱床平衡。必要時(shí)重置連接器。此時(shí)柱子已經(jīng)平衡，可以使用。4蛋白結(jié)合一個(gè)合適的結(jié)合緩沖液是由50mMTris-HC

6、l（pH8.0）和0.5M NaCl組成。盡管理想的結(jié)合溫度是4°C，但是室溫條件下也可以獲得良好的結(jié)果。在上樣之后，用結(jié)合緩沖液沖洗填料直到基線穩(wěn)定為止。5蛋白洗脫結(jié)合物被特異或者非特異性洗脫。為了特異性洗脫結(jié)合物，可以使用類似于P-氨基苯甲脒的競(jìng)爭(zhēng)劑。競(jìng)爭(zhēng)性洗脫緩沖液：20mM P-氨基苯甲脒/結(jié)合緩沖液 非特異性洗脫結(jié)合物的方法：1. 根據(jù)結(jié)合為點(diǎn)帶點(diǎn)基團(tuán)的離子化程度不同而改變離子強(qiáng)度。洗脫液通常在NaCl濃度為1M左右時(shí)能夠競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。在梯級(jí)梯度和連續(xù)梯度中都可以使用。2. 根據(jù)結(jié)合為點(diǎn)帶點(diǎn)基團(tuán)的離子化程度不同而改變pH值。在梯級(jí)梯度和連續(xù)梯度中都可以使用。3. 調(diào)節(jié)洗脫緩沖

7、液的極性，增加二氧雜環(huán)乙烷到10%或者乙二醇到50%可以用于結(jié)合物的洗脫。4. 使用變性劑，比如尿素或者鹽酸胍，都可以用于結(jié)合物的洗脫。6 再生 依據(jù)樣品的特性，選用高pH緩沖液（0.1M Tris-HCl+.05MNaCl，pH8.5）和低pH緩沖液（0.1M NaAc+.05MNaCl，pH4.5），通過用2-3倍柱床體積的緩沖液洗脫，苯甲脒瓊脂糖6B就可以重復(fù)使用。然后用3-5倍柱床體積的結(jié)合緩沖液重平衡，重復(fù)三次洗脫。在色譜中使用過的去垢劑或者變性劑，也可以被用于沖洗緩沖液。賴氨酸瓊脂糖凝膠4B說明書賴氨酸瓊脂糖凝膠4B，是通過CNBr方法將L-Lys固定在瓊脂糖凝膠4B上。L-Lys

8、通過-氨基相互連接，空下的-氨基和-羧基在色譜層析中就可以與樣品物資相互結(jié)合。通過生物學(xué)特異性或L-Lys的電荷依賴性，從而用來純化分子。賴氨酸瓊脂糖凝膠4B含有一群特異性吸附物資，可以用來分離血纖維蛋白溶酶原和血纖維蛋白溶酶原活性物資，分離rRNA和純化雙鏈DNA。雖然其分離純化的具體機(jī)制還沒有完全明白，但是究其用途，分離可能運(yùn)用其靜電性和立體異構(gòu)化效應(yīng)。表一配體密度4-7umol Lys/ml干料結(jié)合能力0.6mg人血纖維蛋白溶酶原/ ml干料 0.6-0.7mg rRNA/ ml干料柱床結(jié)構(gòu)4瓊脂糖平均顆粒大小90um一、填料的準(zhǔn)備賴氨酸瓊脂糖凝膠4B目前是壓縮凍干成添加物。在中性pH中

9、，這些添加物必須被洗掉。稱取所需量的填料凍干粉（1g干粉可形成4ml最終調(diào)料漿）并懸浮在蒸餾水中。調(diào)料將會(huì)立刻脹大，此時(shí)應(yīng)在高壓過的燒杯中用蒸餾水沖洗15分鐘（孔隙率 G3），用大約200ml蒸餾水/g凍干粉，添加到整數(shù)。將凍干粉制成漿，結(jié)合緩沖液占75%，填料占25%？。結(jié)合緩沖液中不能夠含有明顯增加粘性的試劑。在包裝完成以后，柱子可以使用含有較少的粘性試劑的緩沖液平衡。二、瓊脂糖凝膠4B的包裝（略）三、連接器的使用連接器應(yīng)該符合以下要求： 1在填料按照上述方法包裝之后，關(guān)閉柱子的出口和從柱子上移動(dòng)上端。小心地用緩沖液將柱子的剩余部分填滿，在上端形成一個(gè)新月面。 2將連接器按照一定角度插進(jìn)柱

10、子中，并確保沒有帶進(jìn)空氣。 3使這一階段處于管狀連接狀態(tài)，柱子和泵、柱子和樣品裝置閥之間不能夠有氣泡存在。 4慢慢擰開活塞，以便于空氣排出柱子系統(tǒng)，洗脫液慢慢進(jìn)入毛習(xí)管。柱子入口內(nèi)側(cè)的閥門應(yīng)該處于正確的方向，從而確保在此操作中空氣能夠順利的排出。 5在填料的表面將連接器固定一個(gè)合適的位置，打開柱子的出口和開始洗脫。用過柱洗脫液，以包裝流速洗脫柱子，直到柱床平衡。必要時(shí)重置連接器。此時(shí)柱子已經(jīng)平衡，可以使用。四、蛋白結(jié)合與賴氨酸瓊脂糖凝膠4B結(jié)合的蛋白應(yīng)該處于生理pH下狀態(tài)。推薦的結(jié)合緩沖液是：50mM，pH7.5的磷酸鹽緩沖液。對(duì)于血纖維蛋白溶酶原的純化，推薦以下操作方法：1用2-3倍柱床體積

11、的推薦結(jié)合緩沖液平衡填料上樣。最多使用10倍柱床體積的血清。上樣后，用結(jié)合緩沖液沖洗填料，直到基線穩(wěn)定為止。向結(jié)合緩沖液中添加NaCl至終濃度為0.5M和能夠?qū)捤傻叵疵?，或成為非特異性結(jié)合物。用0.2M -氨基己酸的蒸餾水溶液洗脫血纖維蛋白溶酶原。用至少倍柱床體積的結(jié)合緩沖液重平衡填料。推薦使用pH7.5磷酸鹽緩沖液（0.2M的-氨基己酸/50ml）, 并且每五次循環(huán)含有1M NaCl-氨基己酸可以使用交聯(lián)葡聚糖G-25從血纖維蛋白溶酶原去除。五、蛋白洗脫賴氨酸瓊脂糖凝膠4B是一個(gè)含有親和多種生物分子的特異吸附劑。一些蛋白分子間相互作用的生物學(xué)特異性主要取決于它們配體的特異性結(jié)構(gòu)，而其他分子則

12、通過靜電作用這種非特異方式結(jié)合。l 特異性結(jié)合生物分子，像血纖維蛋白溶酶原，可以用競(jìng)爭(zhēng)性洗脫液進(jìn)行洗脫。使用含有配基或者目的分子的競(jìng)爭(zhēng)性試劑。例如：含有-氨基己酸的緩沖液，能夠洗脫特異性結(jié)合物資。血纖維蛋白溶酶原通常使用0.2M-氨基己酸。在梯級(jí)梯度和連續(xù)梯度中都可以使用。l 非特異性結(jié)合生物分子能夠通過逐步增加離子強(qiáng)度的方法進(jìn)行洗脫。洗脫液通常在NaCl濃度為M左右時(shí)就能夠完全洗脫。在梯級(jí)梯度和連續(xù)梯度中都可以使用。l 也可以使用溫度梯度法進(jìn)行洗脫。例如rRNA和賴氨酸瓊脂糖凝膠4B親和力受溫度的影響，隨著溫度的降低，rRNA分離就需要一個(gè)較高的鹽濃度。六、再生依據(jù)樣品的特性，選用高pH緩沖液（0.1M Tris-HCl0.5MNaCl，pH8.5）和低pH緩沖液（0.1M NaAc0.5MNaCl，pH4.5），通過用2-3倍柱床體積的緩沖液重復(fù)洗脫，賴氨酸瓊脂糖凝膠4B就可以重復(fù)使用。然后用至少5倍柱床體積的結(jié)合緩沖液重平衡，至少重復(fù)三次。在色譜中使用過的去垢劑或者變性劑，也可以被用于沖洗緩沖液。在血纖維蛋白溶酶原純化之后，填料再生的方法，用幾倍柱床體積的pH7.5 50mM磷酸