分子醫(yī)學(xué)技能：E玫瑰花環(huán)形成實驗

1、E玫瑰花環(huán)形成實驗 u 掌握掌握E花環(huán)形成的原理u 熟悉E花環(huán)形成實驗的步驟及光鏡下E 花環(huán)的形態(tài)u 熟悉磁珠分離的原理 實驗?zāi)康腡 T細胞的表面分子細胞的表面分子是是T T細胞與其細胞與其它細胞和分子間相互識別及作它細胞和分子間相互識別及作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。它們在用的物質(zhì)基礎(chǔ)。它們在T T細胞活細胞活化、增殖和分化等過程中起重化、增殖和分化等過程中起重要作用。要作用。 TCR-CD3 TCR-CD3復(fù)合物參與復(fù)合物參與T T細胞的細胞的抗原識別和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；抗原識別和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)； CD2 CD2、CD28CD28、CTLA-4CTLA-4、CD45CD45、CD40L CD40L 等膜蛋白參與等膜蛋

2、白參與T T細胞活化細胞活化及及T T細胞與其它細胞間相互作用。細胞與其它細胞間相互作用。 CD4/CD8 CD4/CD8分子輔助分子輔助TCRTCR識別結(jié)識別結(jié)合抗原，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；根據(jù)合抗原，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；根據(jù)CD4CD4和和CD8CD8分子的表達將其分為分子的表達將其分為CD4CD4+ +T T和和CD8CD8+ +T T細胞。細胞。T細胞細胞CD2CD3TCRCD8密度梯度離心法密度梯度離心法CD4T T細胞表面分子細胞表面分子依靠表面標記的分離方法 流式細胞術(shù)分離法流式細胞術(shù)分離法：利用各種熒光素標記的表面標記特異性抗體，使不同表面標記的細胞結(jié)合上不同的熒光素，借助熒光活化細胞分選儀

3、將各種細胞分離開來。 * * 免疫磁珠分離法免疫磁珠分離法：將針對細胞某種表面標記的特異性抗體包被在磁性微珠上，與磁珠交聯(lián)的抗體能夠特異性結(jié)合具有這種表面標記的細胞，然后用強磁場可將具有這種表面標記的細胞分離出來。磁珠磁珠(microbead)標記細胞上的磁珠在掃標記細胞上的磁珠在掃描電鏡下也幾乎看不到描電鏡下也幾乎看不到磁珠分離策略：磁珠分離策略：一一. . 陽性分選陽性分選磁珠標記目的細胞磁珠標記目的細胞未標記細胞先行流出未標記細胞先行流出移出磁場后收移出磁場后收集目的細胞集目的細胞CD4+T細胞細胞分離柱分離柱CD4-T細胞細胞磁珠標記非目的細胞磁珠標記非目的細胞目的細胞先行流出目的細胞

4、先行流出二二. . 陰性分選陰性分選成熟的人T細胞表面表達綿羊紅細胞（SRBC）受體（即CD2分子），能與SRBC結(jié)合形成玫瑰花環(huán)樣結(jié)構(gòu)，可在光學(xué)顯微鏡下觀察計數(shù)。本法可用于分離外周血T細胞及檢測T細胞的數(shù)量和比例。E花環(huán)分離法原理* TTBSRBCCD2實驗方案取外周血取外周血綿羊紅細胞綿羊紅細胞淋巴細胞淋巴細胞分離顯微鏡下觀察顯微鏡下觀察+實驗材料1.肝素抗凝血2.Hanks液3.淋巴細胞分離液4.綿羊紅細胞懸液5.滅活小牛血清6.水平離心機、37溫箱、顯微鏡等實驗步驟淋巴細胞的分離淋巴細胞的分離用用Hanks液配成液配成10106 6細胞細胞/0.1/0.1mlml加等量滅活小牛血清加等

5、量滅活小牛血清(0.1ml)取取0.1ml加入加入0.50.5綿羊紅細胞綿羊紅細胞0.2ml混勻，混勻，3737溫箱放置溫箱放置5 5分鐘分鐘1000rpm離心離心5min加加1 1小滴小滴1 1美藍，用毛細吸管輕輕混勻美藍，用毛細吸管輕輕混勻取取1 1滴于玻片上，加上蓋玻片滴于玻片上，加上蓋玻片高倍鏡下觀察玫瑰花環(huán)形成細胞高倍鏡下觀察玫瑰花環(huán)形成細胞置置44冰箱冰箱5min30-45min結(jié)果判斷結(jié)果判斷u凡能結(jié)合三個以上綿羊紅細胞者為玫瑰花形成陽性細胞。正常人的花環(huán)形成率50-70%，大致可以代表周圍血中T細胞的百分數(shù)。左左:（甲紫染色，（甲紫染色，800）：可見）：可見2個被綿羊紅細胞包圍而形成玫瑰環(huán)的個被綿羊紅細胞包圍而形成玫瑰環(huán)的T淋巴細胞；淋巴細胞；右右:（吖啶橙染色）：圖中可見（吖啶橙染色）：圖中可見3個染成橙黃色熒光的個染成橙黃色熒光的T淋巴細胞被綿羊紅細胞所包圍。淋巴細胞被綿羊紅細胞所包圍。 T淋巴細胞玫瑰花環(huán)T淋巴細胞玫瑰花環(huán)掃描電鏡，淋巴細胞玫瑰花環(huán)掃描電鏡，6500測定外周血中的T細胞數(shù)，觀察受檢者的細胞免疫功能及免疫增強劑的療效。觀察免疫抑制劑的效果，協(xié)助進行惡性腫瘤療效