DNA電泳常見問題分析

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上DNA電泳常見問題凝膠電泳操作注意事項1、 瓊脂糖：不同廠家、不同批號的瓊脂糖，其雜質(zhì)含量不同，影響DNA的遷移及熒光背景的強度，應(yīng)有選擇地使用。2、 凝膠的制備：凝膠中所加緩沖液應(yīng)與電泳槽中的相一致，溶化的凝膠應(yīng)及時倒入板中，避免倒入前凝固結(jié)塊。倒入板中的凝膠應(yīng)避免出現(xiàn)氣泡，以免影響電泳結(jié)果。3、 電泳緩沖液：為保持電泳所需的離子強度和pH，應(yīng)經(jīng)常更新電泳緩沖液。4、 樣品加入量：一般情況下，0.5cm寬的梳子可加0.5g的DNA量,加樣量的多少依據(jù)加樣孔的大小及DNA中片段的數(shù)量和大小而定.當加樣孔大時,樣品上樣量應(yīng)相應(yīng)加大,否則會造

2、成條帶淺甚至辨認不清;反之則應(yīng)適當減少加樣量，但是上樣量過多會造成加樣孔超載，從而導致拖尾或彌散，對于較大的DNA此現(xiàn)象更明顯。5、 DNA樣品中鹽濃度會影響DNA的遷移率，平行對照樣品應(yīng)使用同樣的緩沖條件以消除這種影響。6、 DNA遷移率取決于瓊脂糖凝膠的濃度，遷移分子的形狀及大小。采用不同濃度的凝膠有可能分辯范圍廣泛的DNA分子，制備瓊脂糖凝膠可根據(jù)DNA分子的范圍來決定凝膠的濃度。小片段DNA的檢測應(yīng)采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，以提高分辨率。7.選擇的實驗材料要新鮮，處理時間不易過長。8.在加入細胞裂解緩沖液前，細胞必須均勻分散，以減少DNA團塊形成。9. 提取的DNA不

3、易溶解：不純，含雜質(zhì)較多；加溶解液太少使?jié)舛冗^大。沉淀物太干燥，也將使溶解變得很困難。10. 電泳檢測時DNA成涂布狀：操作不慎；污染核酸酶等。11.分光光度分析DNA的A280/A260小于1.8；不純，含有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。在這種情況下，應(yīng)加入SDS至終濃度為0.5%，并重復(fù)步驟28。12.酚/氯仿/異戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸?。汉邼舛鹊腄NA，可加大抽提前緩沖液的量或減少所取組織的量DNA電泳常見問題分析之一1  請問配制聚丙烯酰胺凝膠電泳膠時，促凝的是TEMED還是過硫酸銨？膠聚時間很長如何解決？過硫酸銨提供驅(qū)動丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所需的自由基，而TEMED通過催化過

4、硫酸銨形成自由基而加速它倆的聚合。膠聚合時間長可能是TEMED失效了，過硫酸銨固體時間過久也會失效的。一個讓PAGE膠很快聚合的方法：不要先配AP（過硫酸銨）溶液，因為AP很容易變質(zhì)。在保證TEMED和AP質(zhì)量的情況下，每次配膠時，直接稱一定量的AP粉劑溶入液體狀態(tài)的PAGE中，這樣可以保證AP的催化能力，而且可以多加一點。配25ml的PAGE膠，加0.03克AP粉劑，最后加入25ulTEMED，20分鐘左右就可以凝固（當然這個時候拔梳子，會有少量未凝固的PAGE在孔里形成絲狀干擾，使加的樣品看起來不太漂亮，但一般不影響跑膠效果和條帶的形狀和位置）。   2  D

5、NA電泳的MARKER怎么是扭曲的？1、 配制膠時的緩沖液需要和電泳緩沖液不是同時配制的.最好是同時配制.電泳時緩沖液高過液面12mm即可。2、 電泳時電壓過高,可以在電泳前15分鐘用較低電壓(3V/cm),等條帶出孔后比較漂亮了.然后再調(diào)電壓。3、 上樣時盡量慢慢加樣,等樣品自然沉降后再加電壓。 3  跑出的DNA帶模糊？1、 DNA降解：避免核酸酶污染。2、 電泳緩沖液陳舊:電泳緩沖液多次使用后，離子強度降低，pH值上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳效果。建議經(jīng)常更換電泳緩沖液。3、 所用電泳條件不合適:電泳時電壓不應(yīng)超過20V/cm，溫度30；巨大DNA鏈電泳，溫度應(yīng)15；核查所

6、用電泳緩沖液是否有足夠的緩沖能力。4、 DNA上樣量過多：減少凝膠中DNA上樣量。5、 DNA樣含鹽過高：電泳前通過乙醇沉淀去除過多的鹽。6、 有蛋白污染：電泳前酚抽提去除蛋白。7、 DNA變性：電泳前勿加熱，用20mM NaCl緩沖液稀釋DNA。4  有不規(guī)則DNA帶遷移?1、 對于/Hind III片段cos位點復(fù)性：電泳前于65加熱DNA 5分鐘，然后在冰上冷卻5分鐘。2、 電泳條件不合適：電泳電壓不超過20V/cm；溫度30；經(jīng)常更換電泳緩沖液。3、 DNA變性：以20mM NaCl Buffer稀釋DNA，電泳前勿加熱。5  跑出的DNA條帶帶弱或無DNA帶？1、

7、 DNA的上樣量不夠：增加DNA的上樣量；聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖電泳靈敏度稍高，上樣量可適當降低。2、 DNA降解：避免DNA的核酸酶污染。3、 DNA走出凝膠：縮短電泳時間，降低電壓，增強凝膠濃度。4、 對于EB染色的DNA，所用光源不合適?應(yīng)用短波長（254nm）的紫外光源。6  跑出的DNA帶缺失不完整是怎么回事?1、 如果是小DNA帶走出凝膠，可以縮短電泳時間或降低電壓或增強凝膠濃度。2、 分子大小相近的DNA帶不易分辨?增加電泳時間，核準正確的凝膠濃度。3、 DNA 變性：電泳前請勿高溫加熱DNA鏈，以20mM NaCl Buffer稀釋DNA。DNA鏈巨大，常規(guī)凝膠電

8、泳不合適?在脈沖凝膠電泳上分析。7  做PCR電泳后跑電泳，目的基因是489BP的，結(jié)果每次切膠回收后再跑電泳就變成500多了，快到600了？為什么？有時只靠電泳結(jié)果判斷是不準確的，同樣的片段每次跑的遠近會有不同。有經(jīng)驗顯示目的片段是1300多，結(jié)果就跑到1000的marker下面去了，后來證實片段沒有問題。也有做的一個片段也是這樣，是490BP.理論上兩個條帶一樣，可是PCR結(jié)果顯示就是大小不一致。然后回收以后的檢測結(jié)果又全部都一樣了，后來又拿去做了下一個測序，才知道根本沒有問題。8：為什么marker條帶非常模糊，無法辨別具體條帶？  A：出現(xiàn)上述情況，可能有以下幾個原

9、因：1. marker條帶出現(xiàn)了降解。請確保在使用過程中避免核酸酶污染；2. 電泳緩沖液陳舊。電泳緩沖液多次使用后，離子濃度降低，pH值上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳效果，建議經(jīng)常更換電泳緩沖液；3. 電泳條件不合適。電泳時電壓應(yīng)不超過20V/cm，溫度應(yīng)低于30；4. marker上樣量過多。請根據(jù)說明書選用合適上樣量；5. 凝膠質(zhì)量不好。建議使用質(zhì)量較好的瓊脂糖；此外，凝膠凝固不均勻也會導致條帶模糊。9：為什么marker條帶出現(xiàn)不規(guī)則的條帶（如啞鈴狀等）？ A：出現(xiàn)上述情況，多與以下幾個原因有關(guān)：1. 電泳緩沖液陳舊。老化的電泳緩沖液離子濃度降低，pH值上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳

10、效果，建議經(jīng)常更換電泳緩沖液；2. 電泳條件不合適。電泳時電壓應(yīng)不超過20V/cm，電壓太高可能也會導致marker條帶出現(xiàn)不規(guī)則現(xiàn)象。此外，凝膠質(zhì)量差以及凝膠冷卻時凝固不均勻也會導致該現(xiàn)象出現(xiàn)。10為什么marker條帶非常弱或者根本沒有條帶？ A：出現(xiàn)上述情況可能是：1. marker上樣量較低，可適當增加上樣量；2. 凝膠質(zhì)量較差或凝膠凝固不均勻也會導致電泳條帶弱或根本沒有條帶；3. 電泳時間過長導致marker條帶跑出凝膠，可縮短電泳時間，降低電壓，增加凝膠濃度。11：為什么marker缺帶？ A：對于含有較小片段的marker，如果出現(xiàn)缺帶現(xiàn)象，可能是因為：1. 小條帶跑出凝膠或分子

11、量大小非常相近的條帶不易辨認所致，可適當縮短電泳時間，降低電壓，同時增加凝膠濃度；2. 凝膠中EB含量過低，導致大片段結(jié)合EB量太少或沒有，在紫外光下亮度太低，可適當增加EB用量。問題原因解決辦法DNA帶模糊 DNA降解避免核酸酶污染電泳緩沖液陳舊 電泳緩沖液多次使用后，離子強度降低，pH值上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳效果。建議經(jīng)常更換電泳緩沖液所用電泳條件不合適電泳時電壓不應(yīng)超過20V/cm，溫度30；巨大DNA鏈電泳，溫度應(yīng)15；核查所用電泳緩沖液是否有足夠的緩沖能力DNA上樣量過多減少凝膠中DNA上樣量DNA樣含鹽過高電泳前通過乙醇沉淀去除過多的鹽有蛋白污染電泳前

12、酚抽提去除蛋白DNA變性電泳前勿加熱，用20mM NaCl緩沖液稀釋DNA不規(guī)則DNA帶遷移對于/Hind III片段cos位點復(fù)性電泳前于65加熱DNA 5分鐘，然后在冰上冷卻5分鐘電泳條件不合適電泳電壓不超過20V/cm；溫度30；經(jīng)常更換電泳緩沖液DNA變性以20mM NaCl Buffer稀釋DNA，電泳前勿加熱帶弱或無DNA帶DNA的上樣量不夠增加DNA的上樣量；聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖電泳靈敏度稍高，上樣量可適當降低DNA降解避免DNA的核酸酶污染DNA走出凝膠縮短電泳時間，降低電壓，增強凝膠濃度對于EB染色的DNA，所用光源不合適應(yīng)用短波長（254nm）的紫外光源DNA帶缺失小

13、DNA帶走出凝膠縮短電泳時間，降低電壓，增強凝膠濃度分子大小相近的DNA帶不易分辨增加電泳時間，核準正確的凝膠濃度DNA 變性電泳前請勿高溫加熱DNA鏈，以20mM NaCl Buffer稀釋DNA DNA鏈巨大常規(guī)凝膠電泳不合適   在脈沖凝膠電泳上分析問題可能原因解決方法DNA Marker降解核酸酶污染每次吸取時更換滅菌槍頭，勿將電泳緩沖液帶入管中；用后密閉4°C保存保存不當4°C 或-20°C保存，避免多次反復(fù)凍融；不可加熱DNA Marker無法正確分離瓊脂糖質(zhì)量差使用質(zhì)量可靠的瓊脂糖制膠電泳緩沖液多次使用后失效更換緩沖液條帶黯淡核酸

14、濃度過低增加上樣量核酸降解使用不含核酸酶的試劑和耗材制備樣品DNA條帶被示蹤染料掩蓋提高上樣量；避免使用與目的片段遷移率相同的示蹤染料條帶模糊或彌散電泳緩沖液多次使用后失效更換緩沖液核酸部分降解使用不含核酸酶的試劑和耗材制備樣品核酸樣品純度差，含有DNA結(jié)合蛋白或高濃度的鹽份酚/仿抽提或乙醇沉淀去除蛋白、鹽份等雜質(zhì)電壓過低，電泳時間過長根據(jù)凝膠大小和電泳緩沖液類型，使用適當?shù)碾妷哼M行電泳染色時間過長或拍照前放置過久，DNA條帶彌散電泳結(jié)束后及時觀察、拍照條帶缺失DNA條帶分子量過大使用脈沖凝膠電泳分子量接近的DNA條帶沒有分開選擇適當?shù)哪z濃度進行電泳電泳緩沖液使用不當SD和TBE緩沖液適于分

15、析較小分子量的DNA片段，大片段分子不能完全分離；TAE緩沖液不適于分離很小的DNA片段電泳時間過長或電壓過高，DNA走出凝膠縮短電泳時間，調(diào)整電壓電極插反，DNA走出凝膠正確連接電極方向條帶大小不正確核酸降解或形成聚合物加熱處理或重新制備樣品 DNA酶切Marker的cos位點復(fù)性電泳前65°C加熱5分鐘，冰上冷卻5分鐘以后再上樣相同分子量的DNA片段由于結(jié)構(gòu)或序列的差異而有不同的遷移率判斷DNA分子是否有特殊結(jié)構(gòu)，如缺口、超螺旋、二聚體等；富含AT堿基的DNA遷移率比同分子量富含GC堿基的DNA片段慢梳子變形，點樣孔不在同一水平線上使用完好的梳子制膠帶型異常不同樣本的上樣條件不同選用相同的上樣緩沖液，上樣量盡可能接近上樣量過大或過小選擇