生物一輪復(fù)習(xí)專題一基因工程課件

1、黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端 1.1.限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶二、基因工程的“基本工具”EcoRI 1.1.限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 一種限制性內(nèi)切酶只能一種限制性內(nèi)切酶只能識(shí)別識(shí)別雙鏈雙鏈DNA分子分子 的某種的某種 ，并且使每一條鏈，并且使每一條鏈中中 的兩個(gè)核苷酸之間的的兩個(gè)核苷酸之間的 斷斷開（開（切割切割DNA分子）分子）a.來源：來源： b.作用：作用：二、基因工程的“基本工具”形成形成平未端平未端（SmaI）及）及黏性未端黏性未端（EcoRI）主要從原核細(xì)胞分離主要從原核細(xì)胞分離 P5特定的核苷酸序列特定的核苷酸序列特定部位特定部位 磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵 2.

2、DNA2.DNA連接酶連接酶“分子縫合針分子縫合針”種類種類來源來源作用部作用部位位連接末端連接末端連接連接對(duì)象對(duì)象Ecoli DNA連接連接酶酶T4 DNA連連接酶接酶 大腸大腸桿菌桿菌T4噬噬菌體菌體磷酸二磷酸二酯鍵酯鍵黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端和平末端和平末端DNADNA片段片段 種類種類項(xiàng)目項(xiàng)目限制酶限制酶DNADNA連連接酶接酶DNADNA聚合酶聚合酶解旋酶解旋酶作用作用底物底物作用作用部位部位作用作用特點(diǎn)特點(diǎn)作用作用結(jié)果結(jié)果DNADNA分子分子DNADNA分子分子片段片段脫氧核苷酸脫氧核苷酸DNADNA分子分子磷酸二磷酸二酯鍵酯鍵磷酸二磷酸二酯鍵酯鍵磷酸二磷酸二酯鍵酯鍵堿基對(duì)

3、間堿基對(duì)間的氫鍵的氫鍵切割目的基因及載體，切割目的基因及載體，能專一性識(shí)別雙鏈能專一性識(shí)別雙鏈DNADNA分子的某種特定的核分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的兩個(gè)核苷酸之間的磷磷酸二酯鍵斷開酸二酯鍵斷開將雙鏈將雙鏈DNADNA片段片段“縫合縫合”起來，起來，恢復(fù)恢復(fù)被限制酶切被限制酶切開了的兩個(gè)開了的兩個(gè)核苷酸之間核苷酸之間的的磷酸二酯磷酸二酯鍵鍵只能將只能將單單個(gè)個(gè)脫氧核脫氧核苷酸苷酸添加添加到脫氧核到脫氧核苷酸鏈苷酸鏈上上將將DNADNA兩條鏈之兩條鏈之間的間的氫鍵氫鍵打開打開形成黏性末端形成黏性末端或平末端或平末端形

4、成重組形成重組DNADNA分子分子形成新的形成新的DNADNA分子分子形成單鏈形成單鏈DNADNA分子分子下圖為下圖為DNA分子在不同酶的作用下所發(fā)生的變化，分子在不同酶的作用下所發(fā)生的變化，圖中依次表示限制性核酸內(nèi)切酶、圖中依次表示限制性核酸內(nèi)切酶、DNA聚合酶、聚合酶、DNA連接酶、解旋酶作用的正確順序是連接酶、解旋酶作用的正確順序是()A BC DC據(jù)右圖所示，有關(guān)工具酶功能的敘述不正確的是（據(jù)右圖所示，有關(guān)工具酶功能的敘述不正確的是（ ）A. 限制性內(nèi)切酶可以切斷限制性內(nèi)切酶可以切斷a處，處，DNA連接酶可以連接連接酶可以連接a處處B. DNA聚合酶可以連接聚合酶可以連接a處處C. 解

5、旋酶可以使解旋酶可以使b處解開處解開D. 連接連接C處的酶可以為處的酶可以為DNA連接酶連接酶D 3. 3.分子運(yùn)載車分子運(yùn)載車運(yùn)載體運(yùn)載體（1 1） 作用：作用：將目的基因送入受體細(xì)胞將目的基因送入受體細(xì)胞（2 2） 具備的條件：具備的條件：a.a.能在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并復(fù)制能在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并復(fù)制b.b.具有一個(gè)或多個(gè)酶切位點(diǎn)，便于目的基因插入具有一個(gè)或多個(gè)酶切位點(diǎn)，便于目的基因插入. .c. c.有標(biāo)記基因，便于篩選有標(biāo)記基因，便于篩選. .d.d.對(duì)受體細(xì)胞無害對(duì)受體細(xì)胞無害. .質(zhì)粒質(zhì)粒、噬菌體、動(dòng)植物病毒、噬菌體、動(dòng)植物病毒（3 3）種類：）種類：質(zhì)粒質(zhì)粒細(xì)菌擬核細(xì)菌擬核DN

6、ADNA之外結(jié)構(gòu)簡單、之外結(jié)構(gòu)簡單、能能自主復(fù)制自主復(fù)制的很小的的很小的環(huán)狀環(huán)狀DNADNA分子分子。特別提醒特別提醒1.一般來說，天然載體往往不能滿足人類的所有一般來說，天然載體往往不能滿足人類的所有要求，因此人們根據(jù)不同的目的和需要，對(duì)某些要求，因此人們根據(jù)不同的目的和需要，對(duì)某些天然的載體進(jìn)行人工改造天然的載體進(jìn)行人工改造2.限制酶限制酶切割位點(diǎn)切割位點(diǎn)所處的位置必須是在所處的位置必須是在所需的標(biāo)所需的標(biāo)記基因之外記基因之外，這樣才能保證標(biāo)記基因的完整性，這樣才能保證標(biāo)記基因的完整性，有利于對(duì)目的記憶的檢測(cè)。有利于對(duì)目的記憶的檢測(cè)。二、基因工程的基本操作程序（步驟）獲取目的基因獲取目的基

7、因構(gòu)建表達(dá)載體構(gòu)建表達(dá)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞導(dǎo)入受體細(xì)胞目的基因檢測(cè)與鑒定目的基因檢測(cè)與鑒定第一步第一步第二步第二步第三步第三步第四步第四步（一）目的基因的獲取2.獲取方法獲取方法（2 2）. .從從基因文庫基因文庫中獲取目的基因中獲取目的基因1 1）基因組文庫（鳥槍法）基因組文庫（鳥槍法）提取某生物提取某生物全部全部DNA用適當(dāng)用適當(dāng)限制酶切割限制酶切割許許 多多DNA片段片段與載體連接與載體連接導(dǎo)入受體菌群導(dǎo)入受體菌群該生物基該生物基因組文庫因組文庫1.目的基因：目的基因：主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因2 2）部分基因文庫（）部分基因文庫（CDNACDNA）（1 1）. .從供

8、體細(xì)胞從供體細(xì)胞直接提取直接提?。? 3）利用）利用PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因技術(shù)擴(kuò)增目的基因1 1）原理：）原理： 2 2）條件：）條件：DNADNA復(fù)制復(fù)制 目的基因（模板）、引物、原料（目的基因（模板）、引物、原料（4 4種種脫氧核苷酸）、耐高溫的脫氧核苷酸）、耐高溫的DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq酶）、酶）、能量等能量等 3 3）過程：）過程： 高溫變性高溫變性（9095）低溫退火低溫退火（5560）中溫延伸中溫延伸（7075）多次多次重復(fù)重復(fù)4 4）方式：以）方式：以_方式擴(kuò)增，即方式擴(kuò)增，即_（n n為擴(kuò)增為擴(kuò)增循環(huán)循環(huán) 的次數(shù)）的次數(shù)）指數(shù)指數(shù)2 2n n（4 4）.

9、 .人工合成人工合成1 1）利用相應(yīng)）利用相應(yīng)mRNAmRNA反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄形成形成 mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶雜交雙鏈雜交雙鏈核酸酶核酸酶單鏈單鏈DNADNADNA聚合酶聚合酶雙鏈雙鏈DNA2 2）根據(jù)已知的氨基酸序列合成根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNADNA 蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的氨基酸序氨基酸序列列推測(cè)推測(cè)mRNAmRNA的的核苷酸核苷酸序列序列推測(cè)推測(cè)基因的基因的核苷酸核苷酸序列序列化學(xué)化學(xué)合成合成目的目的基因基因放入放入DNA合成儀中合成儀中1.1.構(gòu)建目的：構(gòu)建目的： 使目的基因在受體細(xì)胞中使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在穩(wěn)定存在，并且，并且可可遺傳給下一代遺傳給下一代，同時(shí)，使目的基因能夠，同

10、時(shí)，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用表達(dá)和發(fā)揮作用。2.2.構(gòu)建零件及其作用構(gòu)建零件及其作用（1 1）目的基因目的基因（2 2）啟動(dòng)子啟動(dòng)子：是基因首端上：是基因首端上RNARNA聚合酶的識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)，聚合酶的識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)，驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄。驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄。（二）基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心）（3）終止子終止子：位于基因尾端，使轉(zhuǎn)錄終止：位于基因尾端，使轉(zhuǎn)錄終止（4）標(biāo)記基因標(biāo)記基因 ： 便于篩選出含有目的基因的受體細(xì)胞（常便于篩選出含有目的基因的受體細(xì)胞（常使用抗性基因或熒光蛋白基因作為標(biāo)記基因）使用抗性基因或熒光蛋白基因作為標(biāo)記基因）DNADNA連接酶連接酶重組重組DNADNA分子（重組質(zhì)粒）分子（重組

11、質(zhì)粒）3.3.基因表達(dá)載體的構(gòu)建一般過程基因表達(dá)載體的構(gòu)建一般過程基因表達(dá)載體基因表達(dá)載體連接啟動(dòng)子、終止子等連接啟動(dòng)子、終止子等質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA分子分子限制酶處理限制酶處理一個(gè)切口一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端兩個(gè)黏性末端兩個(gè)切口兩個(gè)切口四個(gè)黏性末端四個(gè)黏性末端同一種同一種目的基因目的基因注意注意：構(gòu)建過程中工具酶的使用與任意連接的現(xiàn)象構(gòu)建過程中工具酶的使用與任意連接的現(xiàn)象（三）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞生物種類生物種類受體細(xì)胞受體細(xì)胞導(dǎo)入方法導(dǎo)入方法植物植物動(dòng)物動(dòng)物微生物微生物體細(xì)胞體細(xì)胞或受精或受精卵卵受精卵受精卵農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 基因槍法基因槍法花粉管通道法花粉管通道法顯微注射法顯微注射

12、法感受態(tài)細(xì)胞處理法感受態(tài)細(xì)胞處理法1.1.導(dǎo)入植物細(xì)胞導(dǎo)入植物細(xì)胞（農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法）TiTi質(zhì)粒的質(zhì)粒的T-DNAT-DNA上上目的目的基因基因插入插入轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)入農(nóng)農(nóng)桿桿菌菌導(dǎo)入導(dǎo)入植物植物細(xì)胞細(xì)胞植物細(xì)植物細(xì)胞染色胞染色體體DNA插入插入表達(dá)表達(dá)2.2.導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞( (顯微注射技術(shù)顯微注射技術(shù)) )含目的基因含目的基因的表達(dá)載體的表達(dá)載體顯微顯微注射注射動(dòng)動(dòng) 物物 的的受受 精精 卵卵含目的基因含目的基因的受精卵的受精卵分裂分裂 分化分化早期胚胎早期胚胎雌性動(dòng)物輸雌性動(dòng)物輸卵管或子宮卵管或子宮發(fā)發(fā)育育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物移移 植植3.3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞將目的基

13、因?qū)胛⑸锛?xì)胞感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞吸收吸收DNADNA表達(dá)載體與感表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合受態(tài)細(xì)胞混合用用CaCa2+2+處理處理細(xì)胞細(xì)胞 （CaClCaCl2 2溶液）溶液）感受態(tài)感受態(tài)細(xì)胞細(xì)胞原核生物特點(diǎn)：繁原核生物特點(diǎn)：繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)少殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)少方法：方法：檢查是否成功導(dǎo)檢查是否成功導(dǎo)入與表達(dá)入與表達(dá)1.1.分子檢測(cè)分子檢測(cè)導(dǎo)入檢測(cè)：是否插入了目的基因?qū)霗z測(cè)：是否插入了目的基因轉(zhuǎn)錄檢測(cè)：是否轉(zhuǎn)錄出了轉(zhuǎn)錄檢測(cè)：是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAmRNA翻譯檢測(cè)：是否翻譯成蛋白質(zhì)翻譯檢測(cè)：是否翻譯成蛋白質(zhì)方法方法DNADNA分子雜交分子雜交(DNA-DNA)(DNA-DNA)方

14、法方法分子雜交分子雜交(DNA-mRNA)(DNA-mRNA)方法方法抗原抗原- -抗體雜交抗體雜交2.2.個(gè)體鑒定個(gè)體鑒定: : 抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等（四）目的基因的檢測(cè)與鑒定（四）目的基因的檢測(cè)與鑒定（根據(jù)是否顯現(xiàn)（根據(jù)是否顯現(xiàn)出出雜交代雜交代判斷）判斷）特別提醒特別提醒 師說師說P2201.目的基因的目的基因的插入位點(diǎn)不是隨意插入位點(diǎn)不是隨意的，基因表達(dá)需的，基因表達(dá)需要啟動(dòng)子與終止子的調(diào)控，所以目的基因應(yīng)插入要啟動(dòng)子與終止子的調(diào)控，所以目的基因應(yīng)插入到啟動(dòng)子與終止子到啟動(dòng)子與終止子之間的部位之間的部位2.基因工程操作過程中基因工程操作過程中只有第

15、三步只有第三步（將目的基因（將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞）導(dǎo)入受體細(xì)胞）沒有堿基互補(bǔ)配對(duì)現(xiàn)象沒有堿基互補(bǔ)配對(duì)現(xiàn)象，第一步，第一步存在逆轉(zhuǎn)錄法獲得存在逆轉(zhuǎn)錄法獲得DNA，第二步存在黏性末端連，第二步存在黏性末端連接現(xiàn)象，第四步檢測(cè)存在分子水平雜交方法。接現(xiàn)象，第四步檢測(cè)存在分子水平雜交方法。3.以以目的基因目的基因的單鏈作為分子雜交技術(shù)的基因探的單鏈作為分子雜交技術(shù)的基因探針針三、基因工程的應(yīng)用三、基因工程的應(yīng)用（一）植物基因工程（一）植物基因工程1.1.抗蟲轉(zhuǎn)基因植物（抗蟲轉(zhuǎn)基因植物（如轉(zhuǎn)基因抗蟲棉如轉(zhuǎn)基因抗蟲棉減輕農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的污染減輕農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的污染）2.2. 抗病轉(zhuǎn)基因生物抗病轉(zhuǎn)基因生物（抗病毒

16、、細(xì)菌或真菌轉(zhuǎn)基因植物抗病毒、細(xì)菌或真菌轉(zhuǎn)基因植物）3.3.抗逆轉(zhuǎn)基因作物抗逆轉(zhuǎn)基因作物（如轉(zhuǎn)如轉(zhuǎn)魚抗凍蛋白基因魚抗凍蛋白基因番茄、轉(zhuǎn)基因抗除番茄、轉(zhuǎn)基因抗除草劑玉米草劑玉米）4.4.改良植物的品質(zhì)（改良植物的品質(zhì)（如富含賴氨酸的轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因延如富含賴氨酸的轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因延熟番茄熟番茄）（二）動(dòng)物基因工程（二）動(dòng)物基因工程1.1.提高動(dòng)物生長速度提高動(dòng)物生長速度 如如轉(zhuǎn)生長激素基因鯉魚轉(zhuǎn)生長激素基因鯉魚2 2. .改善畜產(chǎn)品的品質(zhì)改善畜產(chǎn)品的品質(zhì) 如如低乳糖轉(zhuǎn)基因牛（轉(zhuǎn)腸乳糖酶基因）低乳糖轉(zhuǎn)基因牛（轉(zhuǎn)腸乳糖酶基因）3.3.生產(chǎn)藥物生產(chǎn)藥物 生物反應(yīng)器生物反應(yīng)器（如乳腺生物反應(yīng)器、膀胱

17、生物反（如乳腺生物反應(yīng)器、膀胱生物反應(yīng)器）應(yīng)器）注：注：構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)需在目的基因前加入在某器官構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)需在目的基因前加入在某器官特異表達(dá)的啟動(dòng)子特異表達(dá)的啟動(dòng)子，使目的基因只在特定器官中表達(dá)并，使目的基因只在特定器官中表達(dá)并被分泌。被分泌。如如牛乳腺生物反應(yīng)器時(shí)基因表達(dá)載體包括牛乳腺生物反應(yīng)器時(shí)基因表達(dá)載體包括：牛乳腺分泌蛋白基因及其啟動(dòng)子牛乳腺分泌蛋白基因及其啟動(dòng)子+ +目的基目的基因因+ +標(biāo)記基因標(biāo)記基因+ +終止子終止子+ +復(fù)制原點(diǎn)復(fù)制原點(diǎn)4.4.做器官移植供體做器官移植供體利用某種利用某種調(diào)節(jié)因子抑制或設(shè)法除去調(diào)節(jié)因子抑制或設(shè)法除去供體器官供體器官抗原抗原決定基因的

18、表達(dá)決定基因的表達(dá)，獲得，獲得沒有免疫排斥反應(yīng)沒有免疫排斥反應(yīng)的轉(zhuǎn)基的轉(zhuǎn)基因克隆豬器官因克隆豬器官（三）基因工程藥物（三）基因工程藥物利用基因工程方法制造轉(zhuǎn)基因的利用基因工程方法制造轉(zhuǎn)基因的工程菌工程菌，可，可高效率地生產(chǎn)出各種高質(zhì)量、低成本的藥品。高效率地生產(chǎn)出各種高質(zhì)量、低成本的藥品。用基因工程方法，使外源基因得到高用基因工程方法，使外源基因得到高效率表達(dá)的菌類細(xì)胞株系。效率表達(dá)的菌類細(xì)胞株系。我國已生產(chǎn)的藥物：我國已生產(chǎn)的藥物：白細(xì)胞介素白細(xì)胞介素-2-2、干擾素、乙、干擾素、乙肝疫苗等肝疫苗等（四）基因診斷與基因治療（四）基因診斷與基因治療 1.1.基因診斷：基因診斷：用放射性同位素等標(biāo)記的用放射性同位素等標(biāo)記的“DNADNA探針探針”檢測(cè)肝炎病毒等病毒感染及遺傳缺陷，不但準(zhǔn)確而檢測(cè)肝炎病毒等病毒感染及遺傳缺陷，不但準(zhǔn)確而且迅速。且迅速。2.2.基因治療：基因治療：把健康的外源基因?qū)胗谢蛉毕莸陌呀】档耐庠椿驅(qū)胗谢蛉毕莸募?xì)胞中，達(dá)到治療疾病的目的。細(xì)胞中，達(dá)到治療疾病的目的。類型類型體外基因治療體外基因治療體內(nèi)基因治療體內(nèi)基因