杏鮑菇多糖分離純化及純度鑒定張麗霞2015

1、杏鮑菇多糖的分離、純化及純度鑒定杏鮑菇多糖的分離、純化及純度鑒定 主講人：張麗霞主講人：張麗霞 教務(wù)處教務(wù)處 2016.3.4生物技術(shù)綜合大實(shí)驗(yàn)之三生物技術(shù)綜合大實(shí)驗(yàn)之三內(nèi)容提要內(nèi)容提要一、多糖純化的目的與意義一、多糖純化的目的與意義二、材料與設(shè)備二、材料與設(shè)備三、實(shí)驗(yàn)方法步驟三、實(shí)驗(yàn)方法步驟四、實(shí)驗(yàn)考核四、實(shí)驗(yàn)考核一、多糖純化的目的與意義一、多糖純化的目的與意義 多糖純化實(shí)質(zhì)：多糖純化實(shí)質(zhì)：將粗多糖中的雜質(zhì)（將粗多糖中的雜質(zhì)（蛋白質(zhì)、色素、蛋白質(zhì)、色素、低低聚糖、無機(jī)鹽）除去而獲得聚糖、無機(jī)鹽）除去而獲得分子量分子量和和極性均一極性均一的多糖組分。的多糖組分。 多糖純品實(shí)質(zhì)：多糖純品實(shí)質(zhì)：一

2、定分子量范圍內(nèi)的一定分子量范圍內(nèi)的均一組分均一組分。 多糖的純度多糖的純度是研究平菇多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)與生物活性的基礎(chǔ)。是研究平菇多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)與生物活性的基礎(chǔ)。 本實(shí)驗(yàn)首先采用本實(shí)驗(yàn)首先采用三氯乙酸法三氯乙酸法對提取的平菇粗多糖進(jìn)行對提取的平菇粗多糖進(jìn)行脫蛋白脫蛋白，然，然后利用后利用過氧化氫過氧化氫對其對其脫色素脫色素；再根據(jù)多；再根據(jù)多糖所帶電荷性質(zhì)糖所帶電荷性質(zhì)及及分子量的不分子量的不同同，采用，采用DEAE- -纖維素纖維素和和Sepharose CL-6B凝膠柱層析相結(jié)合的方法，凝膠柱層析相結(jié)合的方法，對平菇多糖進(jìn)行對平菇多糖進(jìn)行分級純化分級純化，采用，采用旋光法旋光法對得到的級分進(jìn)行對得

3、到的級分進(jìn)行純度鑒定純度鑒定，為后續(xù)研究平菇多糖的結(jié)構(gòu)特征和生物活性奠定基礎(chǔ)。為后續(xù)研究平菇多糖的結(jié)構(gòu)特征和生物活性奠定基礎(chǔ)。以最簡單的技術(shù)，以最簡單的技術(shù)， 最少的步驟，最少的步驟， 最高的收率，最高的收率， 最低的成本，最低的成本， 獲得純度樣品獲得純度樣品。多糖純化的目的多糖純化的目的二、材料與設(shè)備二、材料與設(shè)備 1.1.材料：材料：已提取的已提取的杏鮑菇粗多糖杏鮑菇粗多糖，常規(guī)干燥，備用。，常規(guī)干燥，備用。 2.2.設(shè)備：設(shè)備： 低速離心機(jī)低速離心機(jī) 、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 、自動數(shù)顯旋光儀、電熱恒、自動數(shù)顯旋光儀、電熱恒溫水浴鍋溫水浴鍋 、蘭格蠕動泵、自動部分收集器、梯度混合器、蘭

4、格蠕動泵、自動部分收集器、梯度混合器、磁力攪拌器磁力攪拌器 、電子天平、電子天平 、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 、紫外可、紫外可見分光光度計(jì)見分光光度計(jì) 、干燥器。、干燥器。3.3.試劑試劑 三氯乙酸、三氯乙酸、30%過氧化氫、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、過氧化氫、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、DEAE - 纖維素、纖維素、Sepharose CL-6B、氯化鈉、氫氧化鈉、氯化鈉、氫氧化鈉、無水乙醇、無水乙醇、95%乙醇。乙醇。三、實(shí)驗(yàn)方法步驟三、實(shí)驗(yàn)方法步驟 1.1.杏鮑菇多糖的分離純化流程杏鮑菇多糖的分離純化流程 杏鮑菇粗多糖杏鮑菇粗多糖脫蛋白脫蛋白脫色素脫色素透析透析濃縮濃縮冷凍干冷凍干燥

5、得水溶多糖精品燥得水溶多糖精品DEAE-纖維素收集中性多糖組分纖維素收集中性多糖組分Sephade G-100柱層析收集最大組分柱層析收集最大組分透析透析濃縮濃縮醇沉過醇沉過夜夜離心離心沉淀經(jīng)無水乙醇、乙醚洗滌沉淀經(jīng)無水乙醇、乙醚洗滌常規(guī)常規(guī)干燥干燥純度鑒純度鑒定定純多糖。純多糖。2.2.脫蛋白脫蛋白 由于粗多糖中含有一定量由于粗多糖中含有一定量游離的游離的和和結(jié)合的結(jié)合的蛋白，為保蛋白，為保證多糖的純度，必須將證多糖的純度，必須將蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)脫去。常用的脫蛋白方法有脫去。常用的脫蛋白方法有Sevag法、法、三氯乙酸法三氯乙酸法和蛋白酶法（鏈蛋白酶、胰蛋白酶、和蛋白酶法（鏈蛋白酶、胰蛋白酶、木

6、瓜蛋白酶）等。木瓜蛋白酶）等。 三氯乙酸法脫蛋白三氯乙酸法脫蛋白 將粗多糖配成將粗多糖配成5%的糖液，加入的糖液，加入30%三氯乙酸三氯乙酸溶液，溶液，使三氯乙酸終濃度為使三氯乙酸終濃度為15%，在，在4冰箱中放置過夜；離心，冰箱中放置過夜；離心，棄去沉淀，得無蛋白的多糖溶液，再用棄去沉淀，得無蛋白的多糖溶液，再用1 mol/L NaOH溶溶液中和至液中和至PH為為7。3.3.脫色脫色 過氧化氫法脫色素過氧化氫法脫色素 將脫蛋白后的多糖溶液，用將脫蛋白后的多糖溶液，用濃氨水濃氨水調(diào)至調(diào)至pH為為8.0，逐滴，逐滴滴加滴加20%H2O2至溶液為至溶液為淺黃色淺黃色，50水浴，保溫水浴，保溫2 h

7、后過濾。后過濾。 4. 4.透析脫鹽透析脫鹽 將脫蛋白、脫色后多糖配成將脫蛋白、脫色后多糖配成5%溶液，置于溶液，置于透析袋透析袋中，中，先用自來水先用自來水逆向流水透析逆向流水透析72 h后，再用后，再用蒸餾水透析蒸餾水透析24 h，每每4 h換水一次。換水一次。5.5.干燥干燥 將脫蛋白、脫色、脫鹽后的杏鮑菇多糖溶液，水浴將脫蛋白、脫色、脫鹽后的杏鮑菇多糖溶液，水浴80濃縮至濃縮至10 mL, 加加三倍體積的無水乙醇三倍體積的無水乙醇過夜，離心取過夜，離心取沉淀，經(jīng)無水乙醇、乙醚洗滌后，常規(guī)干燥得平菇去蛋白沉淀，經(jīng)無水乙醇、乙醚洗滌后，常規(guī)干燥得平菇去蛋白除色素多糖。除色素多糖。6. 6.

8、 多糖含量測定多糖含量測定 采用采用苯酚苯酚-硫酸法硫酸法測定樣品中的多糖含量。測定樣品中的多糖含量。 （1）測定原理為）測定原理為：游離的寡糖、多糖中的己糖或糖醛酸在濃硫：游離的寡糖、多糖中的己糖或糖醛酸在濃硫酸的作用下，酸的作用下，脫水生成糠醛脫水生成糠醛，再與，再與苯酚苯酚作用起作用起顯色反應(yīng)顯色反應(yīng)，在一定范圍在一定范圍內(nèi)其顏色深淺與糖的含量成正比，吸收值與糖含量呈線性關(guān)系。內(nèi)其顏色深淺與糖的含量成正比，吸收值與糖含量呈線性關(guān)系。且己且己糖在糖在490 nm處（戊糖及糖醛酸在處（戊糖及糖醛酸在480 nm）有最大吸收，故用）有最大吸收，故用比色法比色法測測定多糖含量。該法簡單，快速，靈

9、敏，對每種糖僅需制作一條標(biāo)準(zhǔn)曲定多糖含量。該法簡單，快速，靈敏，對每種糖僅需制作一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，且顏色持久。線，且顏色持久。 （2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：準(zhǔn)確稱取準(zhǔn)確稱取105干燥恒重的干燥恒重的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖50 mg定容于定容于500 mL容量瓶中，加水至刻度，用移液管分別吸容量瓶中，加水至刻度，用移液管分別吸取取0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL轉(zhuǎn)入試管中，轉(zhuǎn)入試管中，各以各以蒸餾水蒸餾水補(bǔ)至補(bǔ)至1.0 mL，每個(gè)濃度，每個(gè)濃度重復(fù)三個(gè)平行重復(fù)三個(gè)平行。然后分別。然后分別向每支試管中加入向每支試管中加入6%苯酚試劑苯酚試劑0.5 mL

10、及濃硫酸及濃硫酸2.5 mL，搖勻，搖勻，沸水浴中煮沸沸水浴中煮沸10 min，冷卻至室溫，放置，冷卻至室溫，放置10 min后在后在490 nm處測定吸光值處測定吸光值A(chǔ)。以吸光值以吸光值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，糖含量為縱坐標(biāo)，糖含量C為橫坐標(biāo)，為橫坐標(biāo)，得糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線得糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線A = kC。（3）樣品溶液制備：）樣品溶液制備：精密稱取杏鮑菇多糖精密稱取杏鮑菇多糖5 mg，先加，先加10 mL蒸餾水溶解，然后定容至蒸餾水溶解，然后定容至50 mL。（4）樣品含量測定：）樣品含量測定：用移液管吸取樣品液用移液管吸取樣品液1.0 mL，加入，加入6%苯苯酚溶液酚溶液0.5 mL及濃硫酸及濃硫酸2.5 m

11、L，按上述方法進(jìn)行操作，測其，按上述方法進(jìn)行操作，測其吸光值，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品糖含量。吸光值，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品糖含量。 7. 7. 分級分級 通過通過熱水煮提方法熱水煮提方法提取的多糖，通常是提取的多糖，通常是混合物混合物，且，且分分子量不均一子量不均一，其單糖組成、分子結(jié)構(gòu)和聚合度往往不同，其單糖組成、分子結(jié)構(gòu)和聚合度往往不同，可通過可通過柱層析柱層析的方法，對其進(jìn)行分級以達(dá)的方法，對其進(jìn)行分級以達(dá)純化的目的純化的目的。本。本實(shí)驗(yàn)中，采用實(shí)驗(yàn)中，采用DEAE-纖維素纖維素和和瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠Sepharose CL-6B柱層析相結(jié)合的方法對平菇多糖進(jìn)行分級，分離純化出各柱層析相結(jié)合的

12、方法對平菇多糖進(jìn)行分級，分離純化出各級分多糖。級分多糖。（1） DEAE-纖維素的預(yù)處理和裝柱纖維素的預(yù)處理和裝柱 將將DEAE-纖維素用纖維素用蒸餾水充分浸泡溶脹蒸餾水充分浸泡溶脹后，傾倒除去水分，后，傾倒除去水分，再用再用0.5 M NaOH溶液浸泡溶液浸泡1 h，用蒸餾水反復(fù)洗滌至，用蒸餾水反復(fù)洗滌至PH等于等于7。再用。再用0.5 M的的HCl溶液浸泡溶液浸泡1 h，用蒸餾水洗至，用蒸餾水洗至中性中性，真空，真空清除氣泡，備用。清除氣泡，備用。 裝柱時(shí)，先將裝柱時(shí)，先將DEAE-纖維素沿著纖維素沿著玻璃棒玻璃棒緩慢倒入，以防產(chǎn)緩慢倒入，以防產(chǎn)生氣泡。柱子裝好后，依次用生氣泡。柱子裝好后

13、，依次用5倍柱體積的蒸餾水倍柱體積的蒸餾水、3倍柱體倍柱體積的積的NaCl和和5倍柱體積的蒸餾水倍柱體積的蒸餾水進(jìn)行平衡，流速設(shè)定為進(jìn)行平衡，流速設(shè)定為20 cm h-1。（2）杏鮑菇多糖的離子交換柱層析的線性梯度洗脫）杏鮑菇多糖的離子交換柱層析的線性梯度洗脫 稱取稱取50 mg杏鮑菇多糖，溶于杏鮑菇多糖，溶于5 mL蒸餾水中，在已平蒸餾水中，在已平衡好的衡好的DEAE-纖維素離子交換柱纖維素離子交換柱(1.5 14 cm，Cl-型型) 上上進(jìn)行上樣，先用進(jìn)行上樣，先用100 mL蒸餾水蒸餾水做流動相進(jìn)行洗脫，再用做流動相進(jìn)行洗脫，再用01.0 M NaCl溶液溶液300 mL進(jìn)行線形梯度洗脫

14、，進(jìn)行線形梯度洗脫，流速流速1.0 mL/min，每個(gè)試管收集每個(gè)試管收集3 mL洗洗脫液，脫液，苯酚苯酚-硫酸法硫酸法測定洗測定洗脫液中相對的糖含量分布。脫液中相對的糖含量分布。（3）杏鮑菇杏鮑菇多糖的凝膠柱層析分析多糖的凝膠柱層析分析 取取5 mg杏鮑菇多糖樣品，溶于杏鮑菇多糖樣品，溶于1 mL的的0.15 MNaCl（生理（生理鹽水）溶液中，離心（鹽水）溶液中，離心（3000 rpm/min，5 min），取上清上），取上清上樣于樣于Sepharose CL-6B凝膠層析分析柱凝膠層析分析柱(1.5 90 cm)，洗脫，洗脫液為液為0.15 M NaCl溶液，流速為溶液，流速為0.18

15、mL/min，每管收集，每管收集2.2 mL，苯酚苯酚-硫酸法硫酸法檢測洗脫液中相對糖含量分布。檢測洗脫液中相對糖含量分布。8. 純度鑒定純度鑒定 旋光儀鑒定多糖純度：旋光儀鑒定多糖純度：不同的多糖具有不同的比旋度，它們在不同濃不同的多糖具有不同的比旋度，它們在不同濃度的乙醇中具有不同溶解度，所以，如多糖水溶液經(jīng)不同濃度的乙醇沉淀度的乙醇中具有不同溶解度，所以，如多糖水溶液經(jīng)不同濃度的乙醇沉淀所得的沉淀物，具有相同比旋度，則證明該多糖為均一組分。所得的沉淀物，具有相同比旋度，則證明該多糖為均一組分。 將杏鮑菇將杏鮑菇多糖多糖樣品溶于水，成為近似樣品溶于水，成為近似半飽和溶液半飽和溶液，置于，置

16、于磁力攪拌器磁力攪拌器上，上，在攪拌下在攪拌下滴加乙醇滴加乙醇，使溶液中，使溶液中乙醇濃度達(dá)到乙醇濃度達(dá)到20%，攪拌片刻，使沉淀完全，攪拌片刻，使沉淀完全，離心得沉淀離心得沉淀。上清液中再繼續(xù)滴加乙醇，使溶液中。上清液中再繼續(xù)滴加乙醇，使溶液中乙醇濃度達(dá)乙醇濃度達(dá)40%，所產(chǎn)，所產(chǎn)生的沉淀再經(jīng)離心。生的沉淀再經(jīng)離心。前后兩次沉淀，分別干燥后在相同條件下測定其水溶前后兩次沉淀，分別干燥后在相同條件下測定其水溶液的比旋度。液的比旋度。 將將10 mL5%飽和糖液飽和糖液用國產(chǎn)用國產(chǎn)WXG 6型自動旋光儀，鈉燈光源，以蒸型自動旋光儀，鈉燈光源，以蒸餾水調(diào)零點(diǎn)，餾水調(diào)零點(diǎn)，1dm管室溫下測定。管室溫

17、下測定。四、實(shí)驗(yàn)考核四、實(shí)驗(yàn)考核 根據(jù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容撰寫小論文；要求：格式根據(jù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容撰寫小論文；要求：格式按照按照“大慶師范學(xué)院學(xué)報(bào)自然科學(xué)版模板大慶師范學(xué)院學(xué)報(bào)自然科學(xué)版模板”格式撰寫，格式撰寫，3000字左右。字左右。層析技術(shù)層析技術(shù) Ion Exchange (IEX)離子交換離子交換電荷 可用于 層析的任何步驟，根據(jù)純度要求，包括粗純捕獲、中間純化和最后的精細(xì)純化Size Exclusion (SEC)分子篩（或凝膠過濾）分子篩（或凝膠過濾）分子大小 用于中間純化、脫鹽和緩沖液交換、最后精細(xì)純化原理與操作原理與操作層析的層析的5個(gè)操作步驟個(gè)操作步驟裝柱并平衡裝柱并平衡上樣上樣平衡平衡洗脫洗

18、脫再生再生上樣裝填有層析介質(zhì)的層析柱分離分離組分流出原理與操作原理與操作層析圖層析圖原理與操作原理與操作第一峰第一峰, 外水體積外水體積, Vo,不與柱中填料相互作用直接從柱中不與柱中填料相互作用直接從柱中流出。這是樣品中的未結(jié)合物質(zhì)流出。這是樣品中的未結(jié)合物質(zhì)VoVeVt蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量 (A280), 由由UV檢測器讀出，檢測器讀出，y軸軸基線基線洗脫峰，有些可以很好的分離，洗脫峰，有些可以很好的分離，有些分得不是很好，有部分交叉有些分得不是很好，有部分交叉有時(shí)這里也顯示梯有時(shí)這里也顯示梯度濃度等檢測值度濃度等檢測值時(shí)間或體積，時(shí)間或體積，x軸軸凝膠過濾層析凝膠過濾層析離子交換層析離子

19、交換層析凝膠過濾層析凝膠過濾層析分離純化原理分離純化原理柱長的選擇柱長的選擇 分離：80120cm 脫鹽：30cm以下 洗脫液洗脫液 離子強(qiáng)度低高離子作用 排阻作用（0.05-0.2M) 疏水作用 pH中性中性流速，流速，根據(jù)層析介質(zhì)的說明，一般很低樣品容量樣品容量：13CV凝膠過濾層析凝膠過濾層析操作參數(shù)選擇操作參數(shù)選擇cationweakstronganionweakstrongDEAEDiethylamino-ethylQ Quaternary amineCMCarboxy-methylSSulfonate離子交換層析離子交換層析離子交換層析類型及其選擇離子交換層析類型及其選擇-O-CH2CH2-NH+C2H5C2H5-N+(CH3)3-O-CH2-C-O-O-SO3-Products:UNOsphere Q & S, M