細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

1、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)簡(jiǎn)介細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)簡(jiǎn)介細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念 原代培養(yǎng)原代培養(yǎng) 取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。長(zhǎng)的細(xì)胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。 傳代傳代 細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長(zhǎng)一定時(shí)間后，被細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長(zhǎng)一定時(shí)間后，被分開(kāi)接種到新的培養(yǎng)器皿中。分開(kāi)接種到新的培養(yǎng)器皿中。 培養(yǎng)細(xì)胞的特性培養(yǎng)細(xì)胞的特性 貼附生長(zhǎng)：貼附生長(zhǎng)： 必須貼附于支持物表面才能生長(zhǎng)。見(jiàn)于各必須貼附于支持物表面才能生長(zhǎng)。見(jiàn)于各種實(shí)體瘤細(xì)胞。種實(shí)體瘤細(xì)胞。 懸浮生長(zhǎng)：懸浮生長(zhǎng)： 于懸浮狀態(tài)下即可生長(zhǎng)，不需要貼附于支于懸浮狀態(tài)下即可生長(zhǎng)，不需要貼附于

2、支持物表面。見(jiàn)于各種造血系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞。持物表面。見(jiàn)于各種造血系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞。 3. 3. 細(xì)胞培養(yǎng)的生長(zhǎng)過(guò)程細(xì)胞培養(yǎng)的生長(zhǎng)過(guò)程(1) (1) 細(xì)胞系的生長(zhǎng)過(guò)程細(xì)胞系的生長(zhǎng)過(guò)程( (三個(gè)階段三個(gè)階段) )：a.a.原代培養(yǎng)或初代培養(yǎng)期原代培養(yǎng)或初代培養(yǎng)期 (1(14 4周周) )取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)生長(zhǎng)的細(xì)胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)b.b.傳代期傳代期 ( (數(shù)天到一周左右數(shù)天到一周左右) )細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長(zhǎng)一定細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長(zhǎng)一定時(shí)間后，被分開(kāi)接種至兩個(gè)或者更多的培養(yǎng)器皿時(shí)間后，被分開(kāi)接種至兩個(gè)或者更多的培養(yǎng)器皿中

3、中c.c.衰退期衰退期 ( (傳代傳代30305050次以后次以后) )在此期間細(xì)胞開(kāi)始時(shí)雖仍在此期間細(xì)胞開(kāi)始時(shí)雖仍然存活，但生殖已經(jīng)很緩慢并逐漸完全停止，進(jìn)然存活，但生殖已經(jīng)很緩慢并逐漸完全停止，進(jìn)而細(xì)胞發(fā)生衰亡、死亡而細(xì)胞發(fā)生衰亡、死亡(2) (2) 每代細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程每代細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程a.a.滯留期：包括游離期、貼壁期及潛伏期滯留期：包括游離期、貼壁期及潛伏期 游離期：細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮態(tài)，游離期：細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮態(tài)，也稱為懸浮期。此時(shí)細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形也稱為懸浮期。此時(shí)細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。10min10min4h4h 貼壁期：細(xì)胞附著于底物上，游離期結(jié)束。

4、貼壁期：細(xì)胞附著于底物上，游離期結(jié)束。細(xì)胞株平均在細(xì)胞株平均在1010分鐘一分鐘一5 5小時(shí)貼壁。血清中有促使小時(shí)貼壁。血清中有促使細(xì)胞貼壁的球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生細(xì)胞貼壁的球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長(zhǎng)基質(zhì)），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子長(zhǎng)基質(zhì)），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細(xì)胞再附著在吸附有促貼先吸附于底物上，懸浮細(xì)胞再附著在吸附有促貼壁因子的底物上。進(jìn)口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長(zhǎng)基質(zhì)壁因子的底物上。進(jìn)口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長(zhǎng)基質(zhì)以幫助細(xì)胞貼附。以幫助細(xì)胞貼附。 潛伏期：此時(shí)細(xì)胞有生長(zhǎng)活動(dòng)，而無(wú)細(xì)胞分潛伏期：此時(shí)細(xì)胞有生長(zhǎng)活動(dòng)，而無(wú)細(xì)胞分裂。細(xì)胞株潛伏期一般為

5、裂。細(xì)胞株潛伏期一般為6 624h24h。b.b.指數(shù)生長(zhǎng)期：指數(shù)生長(zhǎng)期： 又稱對(duì)數(shù)期。此期間細(xì)胞增殖旺盛，成倍增又稱對(duì)數(shù)期。此期間細(xì)胞增殖旺盛，成倍增長(zhǎng)，活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。細(xì)胞生長(zhǎng)長(zhǎng)，活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。細(xì)胞生長(zhǎng)增殖狀況可以依據(jù)細(xì)胞倍增情況增殖狀況可以依據(jù)細(xì)胞倍增情況( (細(xì)胞群體倍增時(shí)細(xì)胞群體倍增時(shí)間間) )及細(xì)胞分裂指數(shù)等來(lái)判斷。及細(xì)胞分裂指數(shù)等來(lái)判斷。(3(35 5天天) )c.c.生長(zhǎng)停止期生長(zhǎng)停止期( (平臺(tái)期平臺(tái)期) )： 此期可供細(xì)胞生長(zhǎng)的底物面積已被生長(zhǎng)的細(xì)此期可供細(xì)胞生長(zhǎng)的底物面積已被生長(zhǎng)的細(xì)胞所占滿，細(xì)胞雖尚有活力但已不再分裂增殖。胞所占滿，細(xì)胞雖尚

6、有活力但已不再分裂增殖。此時(shí)細(xì)胞雖已停止生長(zhǎng)，但仍存在代謝活動(dòng)并可此時(shí)細(xì)胞雖已停止生長(zhǎng)，但仍存在代謝活動(dòng)并可繼續(xù)存活一定的時(shí)間。繼續(xù)存活一定的時(shí)間。( (二二) ) 培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的條件培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的條件1 1 細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需要細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需要 a.a.基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：氨基酸、維生素、碳水化合物及一些基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：氨基酸、維生素、碳水化合物及一些無(wú)機(jī)離子無(wú)機(jī)離子 b.b.促生長(zhǎng)因子等物質(zhì)促生長(zhǎng)因子等物質(zhì) c.c.此外激素也可有助于細(xì)胞生長(zhǎng)此外激素也可有助于細(xì)胞生長(zhǎng)2 2 細(xì)胞的生存環(huán)境細(xì)胞的生存環(huán)境 a.a.溫度溫度: : 適宜的溫度與取材的動(dòng)物種類(lèi)有關(guān)適宜的溫度與取材的動(dòng)物種類(lèi)有關(guān) b.b.氣相及氣

7、相及pH:pH:一般氣體環(huán)境為一般氣體環(huán)境為95%95%空氣加空氣加5%CO25%CO2的混合氣的混合氣體。體。 pH: 7.2-7.4 pH: 7.2-7.4 。CO2CO2為細(xì)胞生長(zhǎng)所需，同時(shí)又是細(xì)胞為細(xì)胞生長(zhǎng)所需，同時(shí)又是細(xì)胞代謝的產(chǎn)物，并與維持培養(yǎng)基的代謝的產(chǎn)物，并與維持培養(yǎng)基的pHpH有關(guān)，有關(guān)， CO2CO2增加將使增加將使pHpH下降。下降。 3 3 滲透壓：因細(xì)胞的類(lèi)型及種族而異。由于人類(lèi)血漿的滲透滲透壓：因細(xì)胞的類(lèi)型及種族而異。由于人類(lèi)血漿的滲透壓約為壓約為290m mol/L290m mol/L，因此認(rèn)為這是體外培養(yǎng)人類(lèi)細(xì)胞的理，因此認(rèn)為這是體外培養(yǎng)人類(lèi)細(xì)胞的理想滲透壓。想

8、滲透壓。4 4 無(wú)污染及無(wú)毒：無(wú)毒是培養(yǎng)細(xì)胞的必須條件。凡與細(xì)胞直無(wú)污染及無(wú)毒：無(wú)毒是培養(yǎng)細(xì)胞的必須條件。凡與細(xì)胞直接接觸者接接觸者( (如培養(yǎng)瓶、底物、培養(yǎng)劑等如培養(yǎng)瓶、底物、培養(yǎng)劑等) )或間接接觸者或間接接觸者( (如如瓶蓋瓶塞等瓶蓋瓶塞等) )，若具細(xì)胞毒性，都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。污，若具細(xì)胞毒性，都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。污染問(wèn)題包括細(xì)菌等微生物的污染、不同細(xì)胞類(lèi)型的交叉污染問(wèn)題包括細(xì)菌等微生物的污染、不同細(xì)胞類(lèi)型的交叉污染及上述有害物質(zhì)的污染。染及上述有害物質(zhì)的污染。培養(yǎng)細(xì)胞所需的耗材和儀器培養(yǎng)細(xì)胞所需的耗材和儀器超凈工作臺(tái)：為細(xì)胞操作提供無(wú)菌環(huán)境超凈工作臺(tái)：為細(xì)胞操作提供無(wú)菌環(huán)境紫外燈：

9、紫外線消毒。主要用于操作臺(tái)、塑料紫外燈：紫外線消毒。主要用于操作臺(tái)、塑料培養(yǎng)皿等表面消毒。培養(yǎng)皿等表面消毒。高壓滅菌鍋：濕熱消毒高壓滅菌鍋：濕熱消毒電熱干燥箱：干熱消毒電熱干燥箱：干熱消毒濾器：過(guò)濾除菌，濾器：過(guò)濾除菌，大多用于遇熱容易變性而失大多用于遇熱容易變性而失效的試劑或培養(yǎng)液效的試劑或培養(yǎng)液，包括人工合成培養(yǎng)基、血，包括人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用清、酶液等均采用0.22um0.22um濾膜過(guò)濾除菌。濾膜過(guò)濾除菌。 酸缸：玻璃儀器泡酸，出去蛋白酶酸缸：玻璃儀器泡酸，出去蛋白酶 4 4、-20-20冰箱冰箱，-80-80超低溫冰箱，液氮罐：用超低溫冰箱，液氮罐：用于儲(chǔ)存常用的溶液或

10、凍存細(xì)胞于儲(chǔ)存常用的溶液或凍存細(xì)胞 自動(dòng)雙重純水蒸餾器，超純水儀：細(xì)胞培養(yǎng)用液自動(dòng)雙重純水蒸餾器，超純水儀：細(xì)胞培養(yǎng)用液均需用超純水配制均需用超純水配制 耗材：培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿，移液管，移液器，凍存耗材：培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿，移液管，移液器，凍存管等管等 光學(xué)顯微鏡：定時(shí)觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。光學(xué)顯微鏡：定時(shí)觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。COCO2 2培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱nCO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37 ，5CO2 。n使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題： 用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微松，以保證通氣。保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒（90 ，14 h)。箱內(nèi)滅菌蒸餾水，蒸餾水槽中保持3000毫升以保持箱內(nèi)濕度，避免培

11、養(yǎng)液蒸發(fā)。2 2、培養(yǎng)用品的清洗和消毒滅菌、培養(yǎng)用品的清洗和消毒滅菌玻璃：玻璃： 浸泡浸泡刷洗刷洗( (洗衣粉或洗潔精洗衣粉或洗潔精) )，流水，流水、蒸餾水沖干凈、蒸餾水沖干凈烘干烘干泡酸泡酸(12-24h )(12-24h )流水、單蒸雙蒸分別沖洗流水、單蒸雙蒸分別沖洗10-810-8次次高溫滅高溫滅菌后烘干備用菌后烘干備用酸缸成分酸缸成分: : 濃鹽酸濃鹽酸 25g25g，重鉻酸鉀，重鉻酸鉀 50cm50cm2 2，蒸餾水，蒸餾水 450cm450cm2 2塑料：塑料：a.a.濾器和注射器：清水、單雙蒸水分別沖洗濾器和注射器：清水、單雙蒸水分別沖洗烘烘干干b.b.多孔培養(yǎng)板：紫外照射多孔

12、培養(yǎng)板：紫外照射c.c.膠塞，瓶蓋等：流水、單蒸雙蒸分別沖洗膠塞，瓶蓋等：流水、單蒸雙蒸分別沖洗烘烘干干用雙蒸水煮沸用雙蒸水煮沸30min 30min 烘干烘干消毒滅菌：高溫濕熱滅菌消毒滅菌：高溫濕熱滅菌 玻璃玻璃：121 121 ，30min30min 塑料：塑料：115 115 ，15min15min細(xì)胞培養(yǎng)用液和培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)用液和培養(yǎng)基培養(yǎng)用液培養(yǎng)用液a.a.水：蒸餾水或去離子水水：蒸餾水或去離子水b.b.平衡鹽溶液平衡鹽溶液(BSS)(BSS)：維持滲透壓、調(diào)節(jié)：維持滲透壓、調(diào)節(jié)pHpH值以及值以及供給細(xì)胞生存所需的能量和無(wú)機(jī)離子成分。主要供給細(xì)胞生存所需的能量和無(wú)機(jī)離子成分。主要作

13、為合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)液及用于洗滌組織、細(xì)胞作為合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)液及用于洗滌組織、細(xì)胞等。一般用等。一般用PBSPBS緩沖液緩沖液1 1PBSPBS配方：配方： KCl 0.2g KCl 0.2g，NaCl 8gNaCl 8g， KH KH2 2POPO4 4 0.2g 0.2g， NaNa2 2HPOHPO4 4.12H.12H2 2O 2.89gO 2.89g， 加蒸餾水定容至加蒸餾水定容至1000ml1000ml 胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而

14、使細(xì)胞分離。胞分離。 胰蛋白酶液濃度越高，作用越強(qiáng)，但超過(guò)一定限度會(huì)胰蛋白酶液濃度越高，作用越強(qiáng)，但超過(guò)一定限度會(huì)損傷細(xì)胞。損傷細(xì)胞。 胰蛋白酶液消化時(shí)間：胰蛋白酶液消化時(shí)間：2-102-10分鐘。分鐘。 用含血清培養(yǎng)液終止其對(duì)細(xì)胞的消化作用。用含血清培養(yǎng)液終止其對(duì)細(xì)胞的消化作用。 胰蛋白酶配方：胰蛋白酶配方： 0.25g0.25g胰蛋白酶，胰蛋白酶，0.02g 0.02g EDTA EDTA 溶于溶于100ml 1100ml 1PBSPBS，過(guò)，過(guò)濾除菌。濾除菌。C C 消化液：消化液：培養(yǎng)基培養(yǎng)基培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的溶液，分天培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的

15、溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。液）。優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點(diǎn)：來(lái)源受限。缺點(diǎn)：來(lái)源受限。 成分復(fù)雜，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的成分復(fù)雜，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。分析。 易發(fā)生支原體污染易發(fā)生支原體污染 合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類(lèi)和合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類(lèi)和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計(jì)出許數(shù)量，用人工方法模擬合成的。

16、目前已設(shè)計(jì)出許多種培養(yǎng)基，如多種培養(yǎng)基，如TC199TC199、MEMMEM、-MEM-MEM、 DMEMDMEM等。等。 合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無(wú)機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。化合物、無(wú)機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。 優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定。優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定。 成本低成本低 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞胞 生長(zhǎng)需要。生長(zhǎng)需要。 人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長(zhǎng)和人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基

17、（如血清）。繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。 血清中含有：血清中含有： 多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等） 多種金屬離子多種金屬離子 激素；激素； 促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。 各種生長(zhǎng)因子各種生長(zhǎng)因子 轉(zhuǎn)移蛋白轉(zhuǎn)移蛋白 不明成分不明成分 一般說(shuō)來(lái)含一般說(shuō)來(lái)含5 5小牛血清的培養(yǎng)基對(duì)大多數(shù)細(xì)胞可以小牛血清的培養(yǎng)基對(duì)大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死但支持細(xì)胞生長(zhǎng)一般需加維持細(xì)胞不死但支持細(xì)胞生長(zhǎng)一般需加 1010血清血清 常用血清有胎牛血潔、新生牛血清、小牛血情、兔血常用血清有胎牛血潔、新

18、生牛血清、小牛血情、兔血清、馬血清等，其中以清、馬血清等，其中以胎牛血清胎牛血清質(zhì)量最好。質(zhì)量最好。 血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無(wú)沉淀物，無(wú)細(xì)菌、支原體、病毒污透明，淡黃色，無(wú)沉淀物，無(wú)細(xì)菌、支原體、病毒污染。染。 血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）：血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）：56 56 ，30 30 分鐘分鐘 血清的消毒：過(guò)濾除菌血清的消毒：過(guò)濾除菌 抗菌素的使用：抗菌素的使用： 在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細(xì)菌的生長(zhǎng)。抑制可能存在的細(xì)菌的生長(zhǎng)。 通

19、常是通常是青霉素和鏈霉素青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100100單位。單位。 完全培養(yǎng)基的組成完全培養(yǎng)基的組成 基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基 8080一一9595 血清血清 5 5一一2020（一般加（一般加1010） 青、鏈霉素（雙抗）青、鏈霉素（雙抗） 1%1%三、細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)三、細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù) 培養(yǎng)操作基本要領(lǐng)和要求培養(yǎng)操作基本要領(lǐng)和要求 1 1、無(wú)菌操作、無(wú)菌操作一無(wú)菌操作）無(wú)菌操作一無(wú)菌操作）無(wú)菌操作 操作間消毒：紫外線燈操作間消毒：紫外線燈 30-5030-50分鐘分鐘 （工作臺(tái)）（工作臺(tái)）

20、洗手和著裝洗手和著裝 ：75%75%酒精酒精 火焰消毒火焰消毒 ：酒精燈或煤氣燈：酒精燈或煤氣燈 2 2、基本培養(yǎng)操作技術(shù)、基本培養(yǎng)操作技術(shù) 細(xì)胞換液細(xì)胞換液 1 1、提前將所需儀器試劑放入超凈工作臺(tái)滅菌、提前將所需儀器試劑放入超凈工作臺(tái)滅菌30min30min以上以上 2 2、吸去培養(yǎng)皿中舊的培養(yǎng)基（從皿兩側(cè)吸取、吸去培養(yǎng)皿中舊的培養(yǎng)基（從皿兩側(cè)吸?。?3 3、加入、加入3mlPBS3mlPBS清洗細(xì)胞，從兩側(cè)注入，緩慢清洗細(xì)胞，從兩側(cè)注入，緩慢晃動(dòng)晃動(dòng)1-2min1-2min 4 4、吸去、吸去PBSPBS，加入，加入5-8ml5-8ml培養(yǎng)基培養(yǎng)基 5 5、在顯微鏡下觀察細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)后，放入

21、培養(yǎng)箱、在顯微鏡下觀察細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)后，放入培養(yǎng)箱中中細(xì)胞傳代細(xì)胞傳代貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代方法貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代方法 吸去舊的培養(yǎng)基，加入吸去舊的培養(yǎng)基，加入3ml PBS 3ml PBS 清洗清洗1-2min1-2min 吸去吸去PBSPBS后，加入后，加入1ml 0.25%1ml 0.25%胰酶消化胰酶消化2min2min 顯微鏡下觀察細(xì)胞，待細(xì)胞由梭形變成圓形后，小心吸去顯微鏡下觀察細(xì)胞，待細(xì)胞由梭形變成圓形后，小心吸去胰蛋白酶液，加入胰蛋白酶液，加入2-3ml2-3ml含含10%10%血清的培養(yǎng)基終止消化血清的培養(yǎng)基終止消化 用移液槍吹打培養(yǎng)皿底部，使消化后的細(xì)胞從皿壁上脫落用移液槍吹打培養(yǎng)皿底部

22、，使消化后的細(xì)胞從皿壁上脫落下來(lái)下來(lái) 吹打混勻后用移液槍將一部分液體移入另一滅菌干凈培養(yǎng)吹打混勻后用移液槍將一部分液體移入另一滅菌干凈培養(yǎng)皿中皿中 分別向兩個(gè)皿中加入分別向兩個(gè)皿中加入4-6ml4-6ml培養(yǎng)基，搖勻后培養(yǎng)培養(yǎng)基，搖勻后培養(yǎng) 細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中需要每天進(jìn)行常規(guī)檢細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中需要每天進(jìn)行常規(guī)檢查和顯微鏡觀察，及時(shí)了解細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、數(shù)量查和顯微鏡觀察，及時(shí)了解細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、數(shù)量改變、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞有無(wú)移動(dòng)、有無(wú)污染、培改變、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞有無(wú)移動(dòng)、有無(wú)污染、培養(yǎng)液養(yǎng)液pHpH是否變酸、變黃是否更換等。是否變酸、變黃是否更換等。 3 3、培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的觀察、培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)

23、狀況的觀察4 4、細(xì)胞凍存和復(fù)蘇、細(xì)胞凍存和復(fù)蘇低溫液氮冷凍貯存低溫液氮冷凍貯存 ：-196 -196 原理：原理： 10%10%的的DMSODMSO或甘油或甘油要點(diǎn)：慢凍快融要點(diǎn)：慢凍快融細(xì)胞凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融細(xì)胞凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融 凍存方法（1 1）預(yù)先配制凍存液：）預(yù)先配制凍存液：80%80%含血清培養(yǎng)基含血清培養(yǎng)基+10%DMSO+10%+10%DMSO+10%血清血清（2 2）吸去培養(yǎng)皿中舊的培養(yǎng)基，加）吸去培養(yǎng)皿中舊的培養(yǎng)基，加3mlPBS3mlPBS清洗細(xì)胞約清洗細(xì)胞約1min1min，棄去，棄去PBSPBS（3 3）加入）加入1ml1ml胰酶消化胰酶消化2-3m

24、in2-3min，觀察細(xì)胞貼壁情況。待細(xì)胞變圓后，小，觀察細(xì)胞貼壁情況。待細(xì)胞變圓后，小心吸去胰酶，加入心吸去胰酶，加入3ml3ml含血清的培養(yǎng)基終止消化含血清的培養(yǎng)基終止消化（4 4）將）將3ml3ml的帶細(xì)胞培養(yǎng)基加入兩個(gè)的帶細(xì)胞培養(yǎng)基加入兩個(gè)1.5mlEP1.5mlEP管中，管中，4 4,1000rmp,1000rmp，離心，離心5min5min，棄上清，棄上清（5 5）吸?。┪?ml1ml凍存液加入一個(gè)凍存液加入一個(gè)EPEP管中小心吹散細(xì)胞，后加入另一個(gè)管中小心吹散細(xì)胞，后加入另一個(gè)EPEP管管中吹散細(xì)胞，兩中吹散細(xì)胞，兩EPEP管細(xì)胞合在一起，加入管細(xì)胞合在一起，加入2ml2ml凍存管中充分混勻凍存管中充分混勻（6 6）封口：擰緊瓶蓋，膠布封好口端，并寫(xiě)明細(xì)胞種類(lèi)、時(shí)間、代數(shù)。）封口：擰緊瓶蓋，膠布封好口端，并寫(xiě)明細(xì)胞種類(lèi)、時(shí)間、代數(shù)。（7 7）凍存：）凍