第15章-流式細(xì)胞儀教學(xué)指導(dǎo)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上第十五章 流式細(xì)胞儀1基本要求 1.1了 解(1) 流式細(xì)胞儀的發(fā)展史(2) 流式細(xì)胞儀測(cè)量數(shù)據(jù)的存貯、顯示與分析1.2 熟 悉(1) 流式細(xì)胞儀的主要性能指標(biāo)有哪些?這些指標(biāo)的作用、測(cè)量方法和影響因素是什么?(2) 流式細(xì)胞儀操作技術(shù)的質(zhì)量控制主要涉及那幾個(gè)方面？(3) 流式細(xì)胞儀出現(xiàn)故障及排除方法是什么?(4) 流式細(xì)胞儀主要應(yīng)用哪些領(lǐng)域？1.3 掌 握(1) 什么是流式細(xì)胞技術(shù)和流式細(xì)胞儀？(2) 流式細(xì)胞儀的工作原理是什么？(3) 簡(jiǎn)述流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)？(4) 流式細(xì)胞儀的液流系統(tǒng)由哪幾部分組成？(5) 流式細(xì)胞儀的流動(dòng)室通常由什么材料制成？(6) 流式細(xì)

2、胞儀的光源有什么特點(diǎn)？(7) 流式細(xì)胞儀的光學(xué)系統(tǒng)組成和各種濾光片的作用是什么?(8) 流式細(xì)胞儀所檢測(cè)的信號(hào)有哪些？(9)流式細(xì)胞儀信號(hào)所代表的意義、作用、測(cè)量方式和校正方法是什么？(10)流式細(xì)胞儀分選器的組成、細(xì)胞分選原理和影響因素是什么？2重點(diǎn)難點(diǎn) 2.1重 點(diǎn)(1) 流式細(xì)胞儀和流式細(xì)胞技術(shù)的基本概念(2) 流式細(xì)胞儀的工作原理(3) 流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)(4) 流式細(xì)胞儀所檢測(cè)的信號(hào)有哪些？(5) 流式細(xì)胞儀信號(hào)所代表的意義、作用、測(cè)量方式和校正方法是什么？(6) 流式細(xì)胞儀分選器的組成、細(xì)胞分選原理和影響因素2.2 難點(diǎn)(1) 流式細(xì)胞儀信號(hào)所代表的意義、作用、測(cè)量方式和校正方法

3、是什么？(2) 流式細(xì)胞儀分選器的組成、細(xì)胞分選原理和影響因素(3) 流式細(xì)胞儀的主要性能指標(biāo)有哪些?這些指標(biāo)的作用、測(cè)量方法和影響因素是什么?3講授學(xué)時(shí) 建議6學(xué)時(shí)8學(xué)時(shí)4內(nèi)容提要 4.1 流式細(xì)胞儀基本原理生物學(xué)顆粒分析原理 流式細(xì)胞技術(shù)是在單細(xì)胞水平上，對(duì)于處在快速直線(xiàn)流動(dòng)狀態(tài)中的大量細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)、快速的定量分析和分選的技術(shù)，現(xiàn)已成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究最先進(jìn)的分析技術(shù)之一。應(yīng)用流式細(xì)胞儀對(duì)于處在快速直線(xiàn)流動(dòng)狀態(tài)中的細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行快速的、多參數(shù)的定量分析和分選的技術(shù)稱(chēng)為流式細(xì)胞術(shù)。 生物學(xué)顆粒包括大的免疫復(fù)合物、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、病毒顆粒、脂質(zhì)體、細(xì)胞器、細(xì)菌、霉菌、染色體

4、、真核細(xì)胞、雜交細(xì)胞、聚集細(xì)胞等，所檢測(cè)的生物顆粒的理化性質(zhì)包括細(xì)胞大小、細(xì)胞形態(tài)、胞漿顆?；潭取NA含量、總蛋白質(zhì)含量、細(xì)胞膜完整性和酶活性等。 流式細(xì)胞儀是以激光為光源，集流體力學(xué)技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測(cè)量技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)以及細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的新型高科技儀器。 流式細(xì)胞儀是在熒光顯微鏡技術(shù)、血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀和噴墨技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。 鞘液和樣品流在噴嘴附近組成一個(gè)圓柱流束，與水平方向的激光束垂直相交，染色的細(xì)胞受激光照射后發(fā)出熒光，這些信號(hào)分別被光電倍增管熒光檢測(cè)器和光電二極管散射光檢測(cè)器接收，經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)儲(chǔ)存、計(jì)算、分析這些數(shù)字化信息，就可得到細(xì)胞的大小、活性、

5、核酸含量、酶和抗原的性質(zhì)等物理和生化指標(biāo)。流式細(xì)胞儀細(xì)胞分選原理在壓電晶體上加上頻率為30kHz的信號(hào)，使液柱斷裂成一連串均勻的液滴。當(dāng)某類(lèi)細(xì)胞的特性與要分選的細(xì)胞相同時(shí)，流式細(xì)胞儀就會(huì)在這類(lèi)細(xì)胞形成液滴時(shí)給含有這類(lèi)細(xì)胞的液滴充以特定的電荷，帶有電荷的液滴向下落入偏轉(zhuǎn)板間的靜電場(chǎng)時(shí)，依所帶電荷的符號(hào)分別向左偏轉(zhuǎn)或向右偏轉(zhuǎn)，落入指定的收集器內(nèi)，從而達(dá)到細(xì)胞分類(lèi)收集的目的。4.2 流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)可分為流動(dòng)室及液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)；激光光源及光束成形系統(tǒng)；光學(xué)系統(tǒng)；信號(hào)檢測(cè)與分析系統(tǒng)；細(xì)胞分選系統(tǒng)等五個(gè)部分。流式細(xì)胞儀流動(dòng)室與液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)流動(dòng)室是FCM的核心部件，被測(cè)樣品在此與激光束相交。

6、流動(dòng)室內(nèi)充滿(mǎn)了鞘液,鞘液的作用是將樣品流環(huán)包。流式細(xì)胞儀激光光源與光束成形系統(tǒng)激光是細(xì)胞微弱熒光快速分析的理想光源。激光光束在到達(dá)流動(dòng)室前，先經(jīng)過(guò)透鏡將其聚焦，形成幾何尺寸約為22m×66m即短軸稍大于細(xì)胞直徑的光斑。流式細(xì)胞儀光學(xué)系統(tǒng)FCM的光學(xué)系統(tǒng)是由若干組透鏡、濾光片和小孔組成，它們分別將不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)送入不同的電子探測(cè)器。作為FCM光學(xué)系統(tǒng)中的主要光學(xué)元件的濾光片，主要分為長(zhǎng)通濾片、短通濾片和帶通濾片三類(lèi)。長(zhǎng)通濾光片 短通濾光片帶通濾光片流式細(xì)胞儀信號(hào)檢測(cè)與分析（1）散射光信號(hào) 散射光分為前向角散射和側(cè)向角散射，散射光不依賴(lài)任何細(xì)胞樣品的制備技術(shù)(如染色)，稱(chēng)為細(xì)胞的物理

7、參數(shù) 前向角散射 前向角散射與被測(cè)細(xì)胞的大小有關(guān)，確切地說(shuō)與細(xì)胞直徑的平方密切相關(guān)。 側(cè)向角散射 側(cè)向角散射是指與激光束正交900方向的散射光信號(hào)。側(cè)向散射光對(duì)細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感，可提供細(xì)胞內(nèi)精細(xì)結(jié)構(gòu)和顆粒性質(zhì)的信息。（2）熒光信號(hào) 當(dāng)激光光束與細(xì)胞正交時(shí)，一般會(huì)產(chǎn)生兩種熒光信號(hào)。一種是細(xì)胞自身在激光照射下發(fā)出微弱的熒光信號(hào)，稱(chēng)為細(xì)胞自發(fā)熒光；另一種是經(jīng)過(guò)特異熒光素標(biāo)記細(xì)胞后，受激發(fā)照射得到的熒光信號(hào)，通過(guò)對(duì)這類(lèi)熒光信號(hào)的檢測(cè)和定量分析能了解所研究細(xì)胞的存在和定量。 熒光信號(hào)線(xiàn)性測(cè)量和對(duì)數(shù)測(cè)量： 熒光信號(hào)的面積和寬度 光譜重疊的校正從下圖可以看出，陰影為探測(cè)器檢測(cè)光譜的范圍，

8、FITC探測(cè)器會(huì)探測(cè)到少量的PE光譜，而PE探測(cè)器則檢測(cè)到較多的FITC光譜。克服這種誤差的最有效方法是使用熒光補(bǔ)償電路，利用已知標(biāo)準(zhǔn)樣品或熒光小珠，可合理設(shè)置熒光信號(hào)的補(bǔ)償值。下圖中點(diǎn)A通過(guò)透鏡f成像在A處，而點(diǎn)B通過(guò)透鏡f成像在B處。在光電倍增管前放上一小孔，作為空間濾波器，排除其它雜散光信號(hào)，從而確保了A點(diǎn)光源進(jìn)不了B點(diǎn)處，B點(diǎn)光源也進(jìn)不了A點(diǎn)處。因此，避免第一激光(488nm)激發(fā)出的FL1，F(xiàn)L2，F(xiàn)L3和第二激光(635nm) 激發(fā)出的FL4間的補(bǔ)償。當(dāng)然FL1，F(xiàn)L2和FL3是來(lái)自于同一點(diǎn)光源，它們之間的補(bǔ)償是不可避免的。流式細(xì)胞儀細(xì)胞分選器細(xì)胞分選器由水滴形成、充電及偏轉(zhuǎn)三部分

9、組成。（1）水滴的形成 安裝在流動(dòng)室上的壓電晶體加有數(shù)萬(wàn)赫茲的電信號(hào)，于是壓電晶體帶動(dòng)流動(dòng)室一起振動(dòng)。液流從噴孔出來(lái)后，需要經(jīng)過(guò)一段距離才被破壞形成水滴。 （2）水滴的充電 給水滴充電的脈沖并不是在做出分選決定時(shí)立即產(chǎn)生并加到流束上的，而是當(dāng)細(xì)胞達(dá)到分離點(diǎn)時(shí)才加上的。 （3）水滴的偏轉(zhuǎn) 當(dāng)水滴從流束上將要斷開(kāi)時(shí)給整個(gè)流束充電，則水滴從流束上斷開(kāi)后便帶有同極性的多余表面電荷，在電場(chǎng)中偏向與其有相反電荷的電極板而被分選。4.3 流式細(xì)胞儀的主要性能指標(biāo) 靈敏度靈敏度的高低是衡量?jī)x器檢測(cè)微弱熒光信號(hào)的重要指標(biāo)。一般以能檢測(cè)到單個(gè)微球上最少標(biāo)有FITC或PE熒光分子數(shù)目來(lái)表示，現(xiàn)在的FCM均可達(dá)到檢測(cè)

10、小于100個(gè)熒光分子的指標(biāo)。前向角散射光檢測(cè)靈敏度是指能夠檢測(cè)到的最小顆粒大小，一般目前商品化的FCM可以測(cè)量到0.2m0.5m左右。儀器的分辨率分辨率是衡量?jī)x器測(cè)量精度的指標(biāo)，通常用變異系數(shù)CV(Coefficient of Variation)值表示。分析速度一般可達(dá)到3000個(gè)/秒6000個(gè)/秒左右，大型機(jī)已達(dá)到每秒幾萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。分選指標(biāo)分選指標(biāo)主要包括分選速度、分選純度和分選收獲率。4.4 流式細(xì)胞儀應(yīng)用的技術(shù)要求 檢測(cè)樣品制備的重要性如果兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞間粘連重疊或細(xì)胞碎片過(guò)多，都會(huì)影響信號(hào)的收集及所收集信號(hào)的真實(shí)性，所以制備單細(xì)胞懸液是進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析最關(guān)鍵的第一步。 免疫分析中常用的熒光染料與標(biāo)記染色熒光信號(hào)來(lái)自于細(xì)胞的自發(fā)熒光或被分析細(xì)胞經(jīng)特異性熒光標(biāo)記染色后通過(guò)激光束激發(fā)后所產(chǎn)生的。因此，被分析細(xì)胞在制備成單細(xì)胞懸液后，經(jīng)過(guò)與熒光染料染色后才能上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。 流式細(xì)胞儀操作技術(shù)的質(zhì)量控制光路與流路校正 CV值越小，則儀器工作狀態(tài)精度越高。CV值一般在23左右，不超過(guò)510。PMT校準(zhǔn) 對(duì)光電倍增管的校正是流式細(xì)胞儀在使用前進(jìn)行的一項(xiàng)重要質(zhì)控指標(biāo)。絕對(duì)計(jì)數(shù)的校準(zhǔn) 在進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)時(shí)，常需對(duì)測(cè)定細(xì)胞進(jìn)行絕對(duì)計(jì)