聚合酶鏈式反應(yīng)及其在分子診斷中的應(yīng)用

1、.薂薆罿聿蒈薆肁芅莄薅螁肈芀薄袃芃蕿薃羅肆蒅螞肇節(jié)莁蟻螇肄芇蟻衿芀芃蝕肂膃薁蠆螁莈蕆蚈襖膁莃蚇羆莆艿蚆肈腿薈螅螈羂蒄螅袀膈莀螄肅羀莆螃螂芆節(jié)螂裊聿薀螁羇芄蒆螀聿肇莂蝿蝿節(jié)羋衿袁肅薇袈羃芁蒃袇膆肅葿袆裊荿蒞蒂羈膂芁蒂肀莇薀蒁螀膀蒆蒀袂莆莂蕿羄膈羋薈肇羈薆薇螆膇薂薆罿聿蒈薆肁芅莄薅螁肈芀薄袃芃蕿薃羅肆蒅螞肇節(jié)莁蟻螇肄芇蟻衿芀芃蝕肂膃薁蠆螁莈蕆蚈襖膁莃蚇羆莆艿蚆肈腿薈螅螈羂蒄螅袀膈莀螄肅羀莆螃螂芆節(jié)螂裊聿薀螁羇芄蒆螀聿肇莂蝿蝿節(jié)羋衿袁肅薇袈羃芁蒃袇膆肅葿袆裊荿蒞蒂羈膂芁蒂肀莇薀蒁螀膀蒆蒀袂莆莂蕿羄膈羋薈肇羈薆薇螆膇薂薆罿聿蒈薆肁芅莄薅螁肈芀薄袃芃蕿薃羅肆蒅螞肇節(jié)莁蟻螇肄芇蟻衿芀芃蝕肂膃薁蠆螁莈蕆蚈襖

2、膁莃蚇羆莆艿蚆肈腿薈螅螈羂蒄螅袀膈莀螄肅羀莆螃螂芆節(jié)螂裊聿薀螁羇芄蒆螀聿肇莂蝿蝿節(jié)羋衿袁肅薇袈羃芁蒃袇膆肅葿袆裊荿蒞蒂羈膂芁蒂肀莇薀蒁螀膀蒆蒀袂莆莂蕿羄膈羋薈肇羈薆薇螆膇薂薆罿聿蒈薆肁芅莄薅螁肈芀薄袃芃蕿薃羅肆蒅螞肇節(jié)莁蟻螇肄芇蟻衿芀芃蝕肂膃薁蠆螁莈蕆蚈襖膁莃蚇羆莆艿蚆肈腿薈螅螈羂蒄螅袀膈莀螄肅羀莆 聚合酶鏈式反應(yīng)及其在分子診斷中的應(yīng)用聚合酶鏈式反應(yīng)于1983年由美國Cetus公司  的K.Mullis建立，并和定點突變的發(fā)明者    M.Smith一起榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎，  為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究開創(chuàng)了嶄

3、新時代。一、PCR反應(yīng)原理和反應(yīng)過程DNA的體外復(fù)制包括3個步驟： ¡ C°C 95 °      變性（denaturation）:94 C°C  70 °        退火（annealing）:40 ¡ C°        延伸（extension）:72 ¡       3個步驟作為PCR的一個循環(huán)，每當完成一個循環(huán)，一個分子的

4、模板被復(fù)制為二個，產(chǎn)物量以指數(shù)形式增長。二、PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件（一）PCR反應(yīng)體系參與PCR反應(yīng)的主要成份:模板、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶和緩沖液等。1、 模板           包括基因組DNA、RNA、質(zhì)粒DNA、線粒體DNA等¡   ¡        模板DNA需較高的濃度           RNA作為模板時，須先將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以¡  

5、;      cDNA作為擴增的模板¼           模板量：1000ng、500ng、100ng、50ng¡2、引  物（Primers)   引物決定PCR擴增產(chǎn)物的特異性和長度，是化學(xué)合成的寡核苷酸片段。        化學(xué)合成的寡核苷酸¡       ¡ 能與模板特異地結(jié)合        引物決

6、定產(chǎn)物的特異性和長度¡        引物設(shè)計時必須遵循一些原則 ¡  設(shè)計引物的原則：        二條引物分別位于被擴增片段的兩端，與模板正負鏈序列互補¡        長度為18 ¡ 25個核苷酸        二條引物之間避免形成引物二聚體¡        引物的堿基組成應(yīng)平衡¡    &

7、#160;  ¡ 引物退火溫度計算：Tm=2（A+T）+（C+G）        引物的5端可被修飾（引入酶切位點、引入突變位點、生物素等標記）¡What parameters affect the Tm?(Tm is defined as the temp at which half the molecules are single-stranded)3、脫氧核苷三磷酸（dNTP）        ¡ 是dATP、dCTP、dGTP和dTTP4種脫氧核苷三磷酸的混合物反應(yīng)體系

8、中各種核苷酸的濃度必須一致濃度過高雖能加快反應(yīng)速度，但非特異性擴增也隨之增加dNTP濃度：20 mol/L,濃度升高增加非特異性擴增m 2004、DNA聚合酶        從一種生活在熱泉（8090）中的水棲噬熱菌Thermus¡ aquaticus, Taq）中提取，有很高的耐熱穩(wěn)定性Taq 酶的作用:   模板指導(dǎo)下，以dNTP為原料，在引物3-OH末端加上脫氧單核苷酸，形成3, 5 -磷酸二酯鍵，使DNA鏈沿53方向延伸，催化DNA合成。   最適酶量：1-2.5U （酶量過多，導(dǎo)致非特異性擴增）

9、        Taq DNA聚合酶復(fù)制的保真性：¡        Taq¡ DNA聚合酶無3 5外切酶活性，因而無校正功能，在復(fù)制新鏈的過程中會發(fā)生堿基錯配。        Taq¡ DNA聚合酶在每次循環(huán)中產(chǎn)生的移碼突變率為1/30000，堿基替換率為1/8000，故擴增的片段越長，錯配的機率越高。        耐熱的¡ DNA多聚酶：       

10、Pwo DNA polymerase、Tth DNA polymerase、Pfu DNA¡ polymerase具有較高的熱穩(wěn)定性，較高的保真性，降低堿基錯配率2 10倍。5、鎂離子濃度       ¡ 鎂離子濃度是一個至為關(guān)鍵的因素，對于反應(yīng)    系統(tǒng)本身、穩(wěn)定核苷酸和提高Taq 酶的活性有直接影響   雖然Taq 酶的活性只與游離的Mg2+濃度有關(guān)，    但PCR反應(yīng)體系中dNTP、引物、模板DNA及    鰲合劑的存在均可與Mg2+結(jié)合而降低游

11、離    Mg2+的濃度從而影響酶的活性。   當dNTP濃度為200 mol/L時，MgCl2的濃度為1.5mmol/L較宜。m6、其它反應(yīng)因素         pH：調(diào)節(jié)至酶反應(yīng)所需的最適pH（¡ pH =7.2左右）        鹽：合適的鹽濃度有利于穩(wěn)定雜交體，有利于引物與模板雜交基質(zhì)：BSA、gelatin¡ 、Tween20、DTT等（牛血清白蛋白或明膠等基質(zhì)可以保護Taq 酶的活性）（二）PCR的反應(yīng)條件    

12、60;  ¡ 反應(yīng)溫度（變性、退火、延伸）        反應(yīng)時間（變性、退火、延伸）¡        循環(huán)次數(shù)（PCR效率及產(chǎn)物量）¡1、溫度      變性溫度：94 97      退火溫度：低于引物Tm 5 左右               溫度過高：降低擴增效率   &

13、#160;           溫度過低：增加非特異性擴增     延伸溫度：72 ，此時Taq酶具有較高的                酶促活性2、時間 第一次變性應(yīng)給予足夠時間（5 7分鐘）  每一個步驟所需時間取決于擴增片段的長度，一般為30秒 1分鐘，時間過長易導(dǎo)致非特異性擴增3、循環(huán)次數(shù)        ¡

14、重復(fù)次數(shù)一般設(shè)為2535個循環(huán)        擴增反應(yīng)的平臺效應(yīng)：¡    理論上，PCR反應(yīng)產(chǎn)物呈指數(shù)性增長，但這種增長形式在擴增25-25個循環(huán)以后便放慢直至停止，達到反應(yīng)平臺，此時擴增產(chǎn)物量不再隨循環(huán)次數(shù)的增加而呈指數(shù)增長 ¡       平臺出現(xiàn)得遲早與模板的初始量有關(guān)，模板初始量越多，平臺出現(xiàn)得越早。        平臺效應(yīng)產(chǎn)生的因素：¡   引物二聚體的產(chǎn)生、反應(yīng)產(chǎn)物、各組分的消耗和變性、引物和

15、已擴增的DNA片段間的競爭等三、PCR技術(shù)的質(zhì)量控制（一）實驗室的規(guī)范化設(shè)置實驗室的規(guī)范化設(shè)置：       試劑貯存和準備區(qū)         標本制備區(qū)         擴增反應(yīng)區(qū)         產(chǎn)物分析區(qū) PCR技術(shù)的質(zhì)量保證：       基因擴增檢驗的全過程的質(zhì)量保證       室內(nèi)質(zhì)量

16、控制和室間質(zhì)量評價 PCR實驗系統(tǒng)中的污染源及防污染措施         防污染體系：¡       ¡ 正確設(shè)置實驗室、嚴格規(guī)范實驗操作、完整有效的去污染措施、人員培訓(xùn)、試劑質(zhì)量反應(yīng)體系中以dUTP取代dTTP，再加入尿嘧啶糖苷酶（UNG）即可破壞以往的擴增產(chǎn)物（二）PCR技術(shù)的質(zhì)量保證   分析前因素：標本采集、運送、穩(wěn)定化處理、貯存   分析中因素：核酸提取、逆轉(zhuǎn)錄、擴增反應(yīng)、設(shè)置   對照系統(tǒng)（包括陰性對照、陽性對照、內(nèi)對照等）

17、   分析后因素：報告形式、反饋的信息等第二節(jié) 以PCR為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù)以PCR為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù)        逆轉(zhuǎn)錄PCR (reverse transcription PCR,¡ RT-PCR)        定量PCR (quantitative PCR )¡        多重PCR (multiplex PCR)¡         免疫PCR¡   

18、;     差異顯示PCR (differential display PCR, DD-PCR)¡ ¡       PCR誘導(dǎo)定點突變        原位PCR (in situ PCR)¡ 一、逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）       ¡ 以細胞內(nèi)總RNA或mRNA為材料進行體外擴增的技術(shù)。        主要用于克隆¡ cDNA、合成cDNA探針，檢測RNA病毒、

19、分析基因表達等逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA方式：       ¡ 以隨機進行的PCR擴增所需的下游引物作為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的引物以oligo(dT)作為引物， mRNA3末端polyA尾與之互補以人工合成的隨機序列六核苷酸混合物作為引物，進行擴增二、定量PCR       ¡ 對DNA或RNA樣本的靶序列進行定量分析。       ¡        主要用于基因表達的分析、病原體核酸的檢測等¡ 在定量PCR反應(yīng)體

20、系中，除了常規(guī)PCR反應(yīng)所需的材料和試劑外，還必須引入內(nèi)參照系統(tǒng)。       ¡ -肌球蛋白基因b內(nèi)參照系統(tǒng)一般選用與待測序列結(jié)構(gòu)無關(guān)的基因常用的內(nèi)參照基因是（PCR的參照系統(tǒng)）  相對定量PCR設(shè)計相對定量PCR實驗方案時須注意： ¡       預(yù)先確定最佳模板量和PCR循環(huán)數(shù)，使所       采用的各反應(yīng)參數(shù)在擴增指數(shù)范圍內(nèi)，避       免平臺效應(yīng)。   

21、1;     “管家基因”與靶基因同管擴增，擴增產(chǎn)物       的長度應(yīng)有所不同，以保證電泳能將兩者       分離開。        熒光定量PCR（fluorescence quantitative¡ PCR,FQ-PCR），又稱實時PCR，是目前較精確的進行定量檢測PCR的方法       ¡ FQ-PCR通過熒光信號對PCR過程中產(chǎn)物量進行實時監(jiān)測，精確計算出PCR的初始模板量Reve

22、rse transcription followed by Polymerase Chain Reaction        Considered to be the most sensitive method¡ for the detection and quantification of gene expression levels.        Used¡ as a follow-up when a particular gene is suggested in micro-array

23、studies. ¡       Potential problems with sensitivity, specificity and reproducibility.熒光信號的檢測方法：        1、DNA結(jié)合染料技術(shù)¡       ¡ 2、水解探針技術(shù)（TaqMan probe）技術(shù)        3、雜交探針技術(shù)¡        

24、 CEA§ 基因在消化系統(tǒng)上皮腺癌，     尤其是直結(jié)腸癌和胃癌中高表達，      因此在腫瘤細胞內(nèi)可檢測到其轉(zhuǎn)     錄本，而在正常成人體內(nèi)極少表    達。          在腫瘤發(fā)生血道轉(zhuǎn)移時，外周血§     中有少量腫瘤細胞殘留。用靈敏、    特異的技術(shù)檢測到這些腫瘤細胞    中CEA基因的轉(zhuǎn)錄本，是發(fā)現(xiàn)腫   &#

25、160; 瘤早期轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。三、多重PCR          在同一反應(yīng)體系中加入多對引物，同時擴增一份DNA樣本中多個不同序列的靶片段。四、免疫PCR       ¡ 將PCR產(chǎn)物用ELISA方法加以檢測的技術(shù)。在對目的基因擴增時，dNTP中同時混有用生物素標記的Bio-16-dUTP，使擴增產(chǎn)物帶有生物素標記。若該產(chǎn)物能與突變點特異的寡核苷酸探針（3端地高辛11-DIG-ddUTP標記）雜交，則該產(chǎn)物便帶有地高辛標記信號，可利用與抗地高辛抗體共價結(jié)合的酶標檢測系統(tǒng)進行顯色反應(yīng)，從而

26、判斷突變的存在。（一）寡核苷酸探針檢測系統(tǒng)（二）RNA探針-抗體捕獲系統(tǒng)五、差異顯示PCR（differential display PCR,DD-PCR）        一種以逆轉(zhuǎn)錄PCR為基礎(chǔ)的研究基因表達差異的技術(shù)。¡       ¡ DD-PCR主要用于腫瘤和多種疾病的分子遺傳學(xué)研究，是目前篩選基因表達差異最有效的方法。六、PCR誘導(dǎo)定點突變       ¡ （一）引入點突變        （二）引

27、入大片段缺失¡第三節(jié)  PCR產(chǎn)物的檢測       ¡ PCR-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）         等位基因特異性寡核苷酸¡   （allele specific oligonucleotide, ASO）        單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single strand conformation  ¡     polym

28、orphism, SSCP）         變性梯度凝膠電泳（DGGE）¡         融點曲線分析（melting¡ curve analysis）        PCR產(chǎn)物的序列分析¡ 一、PCR-RFLP            利用正常序列或突變序列是否處于限制性內(nèi)切酶的酶切位點而設(shè)計。若點突變處于某一限制性內(nèi)切酶的酶切位點內(nèi)，可在突變點兩側(cè)設(shè)計引物，使PCR產(chǎn)物含有該突變序

29、列。用相應(yīng)的內(nèi)切酶對正常產(chǎn)物和突變產(chǎn)物進行水解并作電泳分離，可根據(jù)水解片段的大小和電泳位置區(qū)分二者。Results of Southern BlotPCR-SSCP單鏈DNA分子具有特定的二級空間構(gòu)象，取決于該分子本身的堿基組成。突變DNA的PCR產(chǎn)物經(jīng)變性后產(chǎn)生與正常DNA空間構(gòu)象不同的兩條單鏈在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中時，不同構(gòu)象的單鏈片段具有不同的電泳遷移率，從而能區(qū)別正常與突變的DNA      不同順序              不同構(gòu)象

30、60;             不同電泳行為熔點曲線分析(melting curve analysis）        DNA片段中突變堿基與正常堿基不能配對而形成異源雙鏈，所產(chǎn)生的Tm較完全配對的同源雙鏈的Tm低，在儀器上顯示出不同的曲線從而將突變序列檢測出來。所需儀器如高效液相色譜儀(DHPLC)、WAVE DNA片段分析系統(tǒng)、LightCycler等。PCR產(chǎn)物的序列分析（DNA sequencing）    

31、      主要見于分子克隆時對于目的基因擴   增片段的序列鑒定以及對致病基因檢測時   分析擴增片段中點突變的位置和性質(zhì)。          可將產(chǎn)物純化后作為模板直接測序，   也可將PCR產(chǎn)物克隆入載體后再測序，后   者測序的效果更好 ，常用T-A克隆。Sanger測序技術(shù)：  以待測序列的單鏈DNA作為模板，加入一個引物和dNTP作為底物，并加入一定比例的2，3-ddNTP，在DNA聚合酶的作用

32、過程中，正常dNTP的摻入使鏈延伸，若ddNTP的摻入則使鏈終止，這樣就可以得到一系列長度不同的以四種ddNTP結(jié)尾的DNA片段，經(jīng)電泳后可直接讀出堿基序列。第四節(jié) PCR技術(shù)在分子診斷中的應(yīng)用PCR技術(shù)在分子診斷中的應(yīng)用        感染性疾病中病原微生物核酸的檢測¡       ¡ 單基因遺傳性疾病的基因診斷        多基因病相關(guān)基因的檢測¡        腫瘤相關(guān)基因的檢測¡

33、0;      ¡ 移植配型和法醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用一、感染性疾病的分子診斷         定性或定量檢測致病微生物的核酸，¡   已經(jīng)用于病毒、細菌和寄生蟲感染   的診斷。         動態(tài)、定量地檢測病原體核酸能對¡   療效判斷和病情預(yù)后提供客觀的依   據(jù)。SARS相關(guān)冠狀病毒的分子診斷     &#

34、161;    2003年4月，香港研究者Peiris等報     告了50 例SARS病人的臨床表現(xiàn)和    病毒學(xué)研究結(jié)果證明，新冠狀病毒   可能是SARS的致病原因。  （Lancet, 2003, 361: 9365)     ¡    其它實驗室陸續(xù)得出相同結(jié)論。         2003年4月，德國漢堡Bernhard-&#

35、161;     Nocht熱帶醫(yī)學(xué)研究所學(xué)者 Drosten    等用隨機擴增技術(shù)，獲得長度為    300 bp的核苷酸序列。         根據(jù)這段序列，建立了檢測新冠狀¡     病毒的常規(guī)和實時定量PCR技術(shù)。（.org on April 10, 2003）引物和探針     ¡    BNIoutS2-BNIoutAs     &#

36、160;       BNI-1片段，189 bp    BNIinS-BNIinAs             BNI-1片段的內(nèi)套片段，108bp         BNITMSARS1BNITMSARAs2¡    BNITMSARP(熒光素標記的探針）             產(chǎn)物長度

37、：77 bp         檢測標本¡    痰液、咽拭子、鼻拭子、支氣管肺    泡灌洗液 、血漿、糞便。         檢測方法¡      1. 逆轉(zhuǎn)錄-巢式PCR      2. 逆轉(zhuǎn)錄-實時PCR結(jié) 果         病人和接觸者（具臨床癥狀）的痰  &

38、#160;¡    液中用外套引物檢測到了病毒。         病人的其它標本用套式PCR檢測到¡    病毒。     ¡    有報道顯示，在可能SARS病人    中， 病毒的檢出率為100%。         在疑似SARS病人中的檢出率為¡    23%。    &#

39、160;    所有健康接觸者中未檢測到病毒。¡         檢測病毒的3種方¡ 法（血清學(xué)檢測、    病毒分離、PCR技術(shù)）中，PCR技    術(shù)的檢出率最高。討 論     ¡    疾病的早期即可獲得陽性結(jié)果（早于血     清轉(zhuǎn)換期）。         特異性較高（

40、SARS患者中的陽性率約為¡     80%，對照中的陰性率約98%100%）。         現(xiàn)有的方法敏感性較差，陰性結(jié)果不能¡    排除病毒感染。討 論        痰液中病毒RNA濃度極高，說明病毒從呼吸道¡    排放是主要傳播途徑。       ¡ 血清中檢測到極低濃度的病毒RNA，提示病毒    復(fù)

41、制不僅發(fā)生于呼吸道。        病人恢復(fù)晚期的糞便中存在病毒RNA，說明糞¡    便可能也是一種傳播途徑。        鼻、咽拭子中含有的病毒RNA顯著少于痰液，¡    提示不適合作為標本（有可能漏檢）。SARS相關(guān)冠狀病毒分子診斷中必須注意的問題     ¡    必須在規(guī)范的基因擴增實驗室中進行。         

42、應(yīng)采取必要的質(zhì)控規(guī)程，包括陽性對照¡     和陰性對照。         ¡  陽性結(jié)果時必須對原始樣本重復(fù)檢驗或      者擴增基因的另一個片段或在另一個實      驗室對同一樣本進行檢測。 二、單基因疾病的診斷           單基因遺傳病是由于某一基因結(jié)     構(gòu)的變化或由其而引起

43、的基因表達異    常所導(dǎo)致的疾病，因此用分子生物學(xué)    技術(shù)檢測致病基因的遺傳缺陷是診斷    這些疾病最根本的手段。1. 血友病的分子診斷        X染色體連鎖隱性遺傳¡         F基因和F基因發(fā)生突變           血漿凝¡   血因子和的合成量和（或）質(zhì)的異常      

44、;     患者反復(fù)自發(fā)性出血2. DMD的分子診斷       ¡ X染色體連鎖隱性遺傳性肌肉疾病，發(fā)病   率為1/3 500個男孩        DMD基因位于Xp21.2-21.3，全長2¡ 500Kb    DMD基因的突變導(dǎo)致dystrophin缺陷        檢測DMD基因的技術(shù)：¡    Southern印跡、多重PCRDMD的

45、基因檢測         迪謝內(nèi)肌營養(yǎng)不良(DMD) 是一種高發(fā)病§     率、高致殘、高致死的X染色體連鎖的遺      傳性疾病，在3500個活產(chǎn)男嬰中即有一     個患者。     §    致病基因DMD的全長為250kb，有79個外    顯子。       

46、60; DMD 的最主要遺傳缺陷是外顯子缺失，§    約占60%70%。DMD基因外顯子缺失的檢測LGMD2B的基因定位                和遺傳缺陷的研究 ¡       肢帶型肌營養(yǎng)不良(limb-girdle muscular dystrophy, LGMD）是一組累及肩胛、骨盆帶    和四肢近端肌肉的遺傳性疾病。       

47、; LGMD1：顯性遺傳（1A、1B、1C）¡       ¡ LGMD2：隱性遺傳（2A2H）        不同類型的LGMD不僅在遺傳學(xué)上具高度異質(zhì)¡    性（不同致病基因，不同基因突變），臨床表    現(xiàn)亦十分不一致，臨床診斷和分類十分困難。 ENMC的診斷標準       ¡ LGMD的診斷必須符合以下2個標準之一：  1. 致病基因與已知的某一LGMD基因位點&#

48、160;     連鎖  2. 檢測到致病基因編碼產(chǎn)物的缺陷家系資料致病基因的定位        用迄今已報道的 LGMD2A2H 8個基因¡   所在位點附近共14個STR標記對家系成   員DNA樣本進行連鎖分析，以期找出與   該家系連鎖的致病基因。致病基因定位結(jié)果        連鎖分析顯示此家系在D2S377位點的Lod¡     Score值為1.85，在

49、D2S286 位點的Lod score 值    為0.51，其他各位點的值均為負數(shù)。統(tǒng)計結(jié)果    支持D2S337位點和 D2S286 位點與 LGMD2B     致病基因連鎖。其他各位點與致病基因不連    鎖。    Lod score值< 1：不支持連鎖    Lod score值>1：支持連鎖    Lod score值>3：強烈支持連鎖致病基因編碼產(chǎn)物檢測結(jié)果        先證者L

50、GMD2B基因的編碼蛋白dysferlin¡ 條帶密度與正常對照相比有明顯下降，其余各蛋白條帶與正常對照相比無明顯改變。DYSF基因突變的檢測     ¡    在DYSF基因的突變熱點區(qū)篩查，以期     找出導(dǎo)致 dysferlin缺陷的基因突變。          逆轉(zhuǎn)錄PCR¡ ¡         產(chǎn)物克隆至載體后作序列分析DYS

51、F基因檢測結(jié)果     ¡    cDNA第6425/6426位(52號外顯子)缺失     1個G堿基 (6425/6426 del G)。     ¡    第2019位密碼子agg       agc，下游讀碼    發(fā)生移碼突變，使第2035位密碼子 atg             

52、0;        tga (53號外顯子，M 2035 X)。         終止密碼的提前產(chǎn)生是 dysferlin缺陷的¡    原因。         是尚未報道的一個新突變，也是中國第¡    一例DYSF基因突變。     ¡    根據(jù)患者病史、體征和分子診斷實驗結(jié)  &#

53、160; 果，這是一個由于 DYSF 基因突變造成    相應(yīng)編碼產(chǎn)物缺陷而導(dǎo)致的疾病。三、多基因病的分子診斷         多基因病具一定的遺傳因素，家庭§   發(fā)病率高于人群發(fā)病率，但是疾病   的產(chǎn)生都以一定的環(huán)境條件為誘因，   遺傳因素在其中所起作用程度各異。     §    多基因病中的遺傳因素是若干個     易感基因微

54、小作用的累加，某一   易感基因結(jié)構(gòu)的變化不足以導(dǎo)致   疾病的產(chǎn)生。          人類基因組多態(tài)性是多基因病基因§    診斷的基礎(chǔ)，易感基因多態(tài)性的檢    測能幫助我們理解多基因病發(fā)生的    機制，有助于對疾病的診斷和分類?；蚨鄳B(tài)性與鹽敏感性高血壓-內(nèi)收素     a            

55、    血管緊張素轉(zhuǎn)換酶  上皮鈉通道                血管緊張素原  心鈉素                2腎上腺素能受體b           SA                     

56、            G蛋白亞單位3ACE基因多態(tài)性與高血壓靶器官損傷疾病        研究報告數(shù)      I D                   D D冠心病              30

57、0;                + 11 %             + 32 %  心肌梗死          15                 + 12 %     &

58、#160;       + 39 %腦卒中                5                 + 22 %             + 94 %高血壓腎病       19   

59、60;            + 10 %             + 53 %糖尿病腎病       11                + 40 %             + 56 %    

60、       * 與II型相比，DD型和ID型發(fā)生上述疾病的危險性增高程度         (145個ACE基因I/D多態(tài)性研究49959例的薈萃分析）基因多態(tài)性與高血壓靶器官損傷腦卒中    載脂蛋白E    -纖維蛋白原b    血管緊張素原    血管緊張素II的1型受體    內(nèi)皮型一氧化氮合酶    心鈉素冠心病    

61、0;副氧酶     凝血因子V     凝血因子VII     載脂蛋白B基因多態(tài)性檢測與個體化治療        人類基因組計劃已經(jīng)完成，功能基因組¡   計劃正在實施。 ¡       有朝一日，臨床醫(yī)師能根據(jù)病人易感基   因的多態(tài)性設(shè)計有效的、個體化的治療    方案，以達到最佳的治療效果。 TOHP試驗中AG

62、T基因研究目的：觀察AGT基因分型與限鈉鹽攝入及減輕體重后的             血壓變化和高血壓發(fā)病率間的關(guān)系對象：1509例基因分析：AGT基因G-A多態(tài)性結(jié)果：            三年后高血壓發(fā)生率（%）                        &#

63、160;        對照組     限鹽組     減輕體重組       AA型        45              28              &#

64、160; 25        GG型        32             41                32                    

65、0;                              Hunt SC,et al: Hypertension, 1998;32:393-401基因多態(tài)性分析              指導(dǎo)抗高血壓藥物的選擇   藥物種類      

66、;        基因        利尿劑                    -內(nèi)收素a            ACE抑制劑               ACE、AT1-受