茶葉內(nèi)生菌的分離、脂肪酸鑒定及其生防功能初探

1、.8植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào) 2007Journal of Plant Resources and Environment茶葉內(nèi)生菌的分離、脂肪酸鑒定及其生防功能初探陳 璐，劉 波，藍(lán)江林，蘇明星，朱育菁收稿日期：2007-4-15基金項(xiàng)目：國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）（2006AA10A211）作者簡(jiǎn)介：陳璐(1982)，女，福建泉州人，碩士生，實(shí)習(xí)研究員，主要從事生物技術(shù)和植物病害生物防治研究。通訊作者：朱育菁（1972），女，博士，副研究員，E-mail: zyjingfz（福建省農(nóng)科院生物技術(shù)研究所，福建 福州 350003）摘 要：對(duì)采自有機(jī)茶生產(chǎn)基地和加工廠的“大白毫”和“福云六

2、號(hào)”茶葉樣品進(jìn)行內(nèi)生菌的分離、脂肪酸鑒定和抑菌譜測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果表明：從7份樣品中共分離到16株細(xì)菌，1株真菌，沒(méi)有分離到放線菌。老葉中均未檢測(cè)到內(nèi)生菌，芽葉中內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量為26.0139.5×106cfu/g。同樣是有機(jī)種植，“福云六號(hào)”芽葉的含菌量是“大白毫”的1.94倍。常規(guī)種植的“大白毫”的芽葉的含菌量為97.5139.5×106cfu/g，明顯高于有機(jī)種植的26.528.3%×106cfu/g。殺青對(duì)有機(jī)種植“大白毫”芽葉內(nèi)生菌含量沒(méi)有明顯影響，但卻使常規(guī)種植芽葉的內(nèi)生菌含量降低30.10%?！按蟀缀痢睅в屑t桿菌屬（Rhodobacter）、微桿菌屬（Mi

3、crobacterium）、根瘤菌屬（Rhizobium）和貪噬菌屬（Variovorax）這4個(gè)屬的內(nèi)生細(xì)菌。“福云六號(hào)”僅含有根瘤菌屬和貪噬菌屬。供試的15株菌中，有11株對(duì)供試10種病原菌表現(xiàn)出拮抗活性。放射根瘤菌Eb659號(hào)菌株有著最廣的抑菌譜，能夠抑制3種病原菌，番茄青枯雷爾氏菌、西瓜細(xì)菌性果班病菌和棉花黃萎病大麗輪枝菌株，尤其是對(duì)西瓜果斑菌具有極好的抑菌效果，抑菌圈能達(dá)到53.00 mm，對(duì)于作為生防菌防治植物病害具有一定的應(yīng)用和開(kāi)發(fā)價(jià)值。關(guān)鍵詞：茶葉；內(nèi)生菌；分離；脂肪酸鑒定；生物防治 中圖分類(lèi)號(hào)： 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： 文章編號(hào)：Isolation, fatty-acid identi

4、fication and the biocontrol potential of endophyte in theasienensis (Camellia sinensis) CHEN Lu, LIU Bo, LAN Jiang-lin, SU Ming-xing, ZHU Yu-jing (Institute of Biotechnology, Fujian Academy of Agricultural Sciences，F(xiàn)uzhou 350003，China) J. Plant Resour. & Environ2007Abstract：The isolation, fatty-

5、acid identification and inhibition ability against pathogeny of endophyte in theasienensis (Camellia sinensis) were conducted. The theasienensis samples were collected from organic tea planting base and processing factory, and the varieties of the theasienensis were “DABAOHAO” and “FUYUNLIUHAO”. The

6、 results showed that 16 endophytic bacteria and 1 endophytic fungus were isolated from 7 theasienensis samples, while no actinomycete was found. Not any endophyte was detected in the old leaves, whereas the endophytic bacteria in the bud were 26.0-139.5×106cfu/g. The endophyte in bud of “FUYUNL

7、IUHAO” was 1.94 times higher than “DABAOHAO”, while both were treated with organ planting. However, the endophytes in “DABAOHAO” buds treated with normal planting were 97.5-139.5×106cfu/g, obviously higher than 26.528.3%×106cfu/g of the buds treated with organic planting. Fixing Technique

8、didnt influence the endophyte number in the bud of “DABAOHAO” treated with organic planting, while the number decreased 30.10% in the bud treated with normal planting. “DABAOHAO” contained four genus of endophtic bacteria, such as Rhodobacter, Microbacterium, Rhizobium and Variovorax, and the “FUYUN

9、LIUHAO” only had Rhizobium, and Variovorax. 11 endophytic bacteria of theasienensis showed inhibition abilities to 10 pathogenies. Eb 659 (R. radiobacter) had the biggest inhibition spectrum, which could inhibit 3 kinds of pathogenies, Ralstonia solanacearum, Acidovorax avenae subsp. citrulli and Ve

10、rticillium dahliae.Keywords：Theasienensis, endophyte, isolation, fatty-acid detection, biocontrol隨著全球?qū)Y源和環(huán)境問(wèn)題的廣泛關(guān)注，實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略得到世界各國(guó)的認(rèn)同和響應(yīng)。使用化學(xué)殺菌劑是控制農(nóng)作物病害的有效方法，但化學(xué)殺菌劑污染環(huán)境，誘導(dǎo)病菌抗性增強(qiáng)，破壞生態(tài)平衡，因此植物病害的生物防治研究越來(lái)越受到重視1。自1898年Vogl從黑麥草種子內(nèi)分離出第一株內(nèi)生真菌以來(lái)，植物內(nèi)生菌作為一種新的微生物資源受到了廣泛的關(guān)注2。人們發(fā)現(xiàn)植物體內(nèi)存在大量有益的內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生真菌，這些內(nèi)生菌在植物體內(nèi)能產(chǎn)

11、生多種生物學(xué)作用，可以提供植物所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如氮源(內(nèi)生共生固氮)及一些激素，參與植物的防衛(wèi)功能，能夠促進(jìn)植物快速生長(zhǎng)，增強(qiáng)植物抗逆境、抗病害、抗動(dòng)物危害的能力3。由于內(nèi)生菌具有在植物體內(nèi)獨(dú)立自主的分裂繁殖和傳遞的特性，使之有可能成為生物防治中有潛力的微生物農(nóng)藥和增產(chǎn)菌，因此分離并利用作物的內(nèi)生菌控制作物的病蟲(chóng)害、開(kāi)發(fā)有益內(nèi)生菌以提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)對(duì)于可持續(xù)性農(nóng)業(yè)具有重要意義4。福建省是茶葉種植和生產(chǎn)大省，全省共有茶園面積14.5hm2，居全國(guó)第三位，因此開(kāi)發(fā)茶葉內(nèi)生菌作為生防制劑有著良好的發(fā)展前景。本研究擬從茶葉上分離篩選具有廣譜抑菌活性的內(nèi)生細(xì)菌，應(yīng)用于植物病害的生物防治。1 材料和方法

12、1.1 材料1.1.1 供試植物 茶葉樣本于2006年3月采自福鼎品品香茶業(yè)有限公司和福安市天香茶葉有限公司的有機(jī)茶生產(chǎn)基地和加工廠，茶葉品種為大白毫和福云六號(hào)，種植方式為有機(jī)種植或和普通種植，加工工藝為殺青和未殺青，葉為老葉和芽葉。樣本采回實(shí)驗(yàn)室后在24 h內(nèi)用于微生物的分離。1.1.2 供試病原菌 豬大腸桿菌K88（Escherichia coli），購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所；棉花黃萎病大麗輪枝菌（Verticillium dahliae），購(gòu)自德國(guó)菌種中心（DMSZ）提供；西瓜細(xì)菌性果斑病菌（Acidovorax avenae subsp. citrulli），由福建農(nóng)林大學(xué)提供；黃曲霉（As

13、pergillus flavus），由福建師范大學(xué)提供；番茄枯萎病尖孢鐮刀菌 （Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici）由浙江大學(xué)提供；番茄青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum），甘藍(lán)輪枝菌（Verticillium longisporum)，西瓜枯萎病尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. niveum），澤瀉白斑病菌（Ramularia alismatis），苦瓜炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare），均由本實(shí)驗(yàn)室分離。1.1.3 內(nèi)生菌分離、增殖、拮抗測(cè)定培養(yǎng)基 細(xì)菌分離與增殖培養(yǎng)均

14、采用NA培養(yǎng)基，真菌培養(yǎng)與拮抗測(cè)定均采用PDA培養(yǎng)基，放線菌分離采用高氏一號(hào)培養(yǎng)基。1.1.4 脂肪酸提取培養(yǎng)基與試劑 TSBA培養(yǎng)基：30 g胰蛋白胨大豆肉湯（Tryptic soy broth，TSB）+15 g瓊脂+1 L水（TSB購(gòu)于Fisher公司）。皂化試劑：氫氧化鈉45 g+甲醇150 mL+水150mL；甲基化試劑：6N鹽酸325 mL+甲醇275 mL；萃取試劑：正已烷200 mL+甲基叔丁基乙醚200 mL；洗滌試劑：氫氧化鈉10.8 g+水900 mL（配制方法由MIDI公司提供）。1.2 方法1.2.1 茶葉內(nèi)生菌的分離 采用植物表面消毒法對(duì)不同茶樹(shù)品種的葉子進(jìn)行表面處

15、理后，并以不同培養(yǎng)基進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌、真菌和放線菌的分離。根據(jù)菌落形態(tài)、顏色等隨機(jī)挑取單菌落，按常規(guī)方法純化后保存，供測(cè)試鑒定。1.2.2 茶葉內(nèi)生細(xì)菌的脂肪酸鑒定1.2.2.1 脂肪酸的提取 細(xì)菌培養(yǎng)條件：TSBA平板培養(yǎng)基，四線劃線法，培養(yǎng)溫度28±1 ，培養(yǎng)時(shí)間24±2 h。獲菌：用接種環(huán)挑取3-5環(huán)（約40 mg濕重）的菌落置入一個(gè)干凈、干燥的有螺旋蓋的試管中（最佳的獲菌區(qū)域?yàn)榈?區(qū)）。皂化：加入1.0±0.1 mL皂化試劑，擰緊蓋子，振蕩5-10 sec，放入95-100 的沸水中5 min，室溫冷卻，振蕩5-10 sec，再水浴25 min，室溫冷卻。甲基

16、化：開(kāi)蓋加入2.0±0.1 mL甲基化試劑，擰緊蓋子，振蕩5-10 sec，80±1水浴10 min，移開(kāi)且快速用流動(dòng)自來(lái)水冷卻至室溫。萃取：加入1.25±0.1 mL的萃取試劑，擰緊蓋子，溫和混合旋轉(zhuǎn)10 min，打開(kāi)管蓋，利用干凈的移液管取出每個(gè)樣本的下層水相部份?；鞠礈欤杭尤?.0±0.2 mL洗滌試劑，擰緊蓋子，溫和混合旋轉(zhuǎn)5 min，打開(kāi)管蓋，利用干凈的移液管移出約2/3體積的上層有機(jī)相到干凈的氣相色譜檢體小瓶，用于氣相檢測(cè)。1.2.2.2 脂肪酸的氣相色譜檢測(cè) 氣相色譜系統(tǒng)采用的是美國(guó)Agilent 6890N型，包括全自動(dòng)進(jìn)樣裝置、石英毛

17、細(xì)管柱及氫火焰離子化檢測(cè)器；分析軟件應(yīng)用美國(guó)MIDI公司開(kāi)發(fā)的基于細(xì)菌細(xì)胞脂肪酸成分鑒定細(xì)菌的軟件Sherlock MIS4.5（Microbial Identification System）和 LGS4.5（Library Generation Software）。在下述色譜條件下平行分析脂肪酸甲酯混合物標(biāo)樣和待檢樣本：二階程序升高柱溫，170 起始，5 ·min-1升至260 ，而后40 ·min-1升溫至310 ，維持90 sec；汽化室溫度250 、檢測(cè)器溫度300 ；載氣為氫氣（2 mL·min-1）、尾吹氣為氮?dú)猓?0 mL·min-1）；

18、柱前壓l0.00 psi（1psi=6.895 kPa）；進(jìn)樣量l l，進(jìn)樣分流比100:l。1.2.2.3 脂肪酸鑒定 系統(tǒng)根據(jù)各組分保留時(shí)間計(jì)算等鏈長(zhǎng)(ECL)值確定目標(biāo)組分的存在、采用峰面積歸一化法計(jì)算各組分的相對(duì)含量，再將二者與系統(tǒng)譜庫(kù)中的標(biāo)準(zhǔn)菌株數(shù)值匹配計(jì)算相似度(similarityindex，SI)，從而給出一種或幾種可能的菌種鑒定結(jié)果。一般以最高SI的菌種名稱(chēng)作為鑒定結(jié)果，但當(dāng)其報(bào)告的幾個(gè)菌種的SI比較接近時(shí)，則根據(jù)色譜圖特征及菌落生長(zhǎng)特性進(jìn)行綜合判斷。以脂肪酸混合標(biāo)樣校正保留時(shí)間。1.2.3 茶葉內(nèi)生細(xì)菌抑菌譜的測(cè)定 將1.2.1中分離得到的15株茶葉內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行抑菌譜測(cè)定。

19、供試菌株的培養(yǎng)：將各供試內(nèi)生菌株在NA平板上活化，用NA培養(yǎng)液于30、170 r·min-1振蕩培養(yǎng)48 h備用。拮抗測(cè)定試驗(yàn)采用改良的瓊脂擴(kuò)散法。7株病原真菌在PDA平板上培養(yǎng)25 d后，用無(wú)菌水沖洗菌苔，配成孢子懸浮液。吸取制備好的孢子懸浮液1 mL，加入到熔化并冷卻到45左右的6 mL PDA培養(yǎng)基（瓊脂含量為0.9%）中，混勻，傾覆在已凝固的PDA平板上。待上層培養(yǎng)基冷卻凝固后，在平板上打孔（直徑為6 mm），在每個(gè)孔內(nèi)加內(nèi)生菌發(fā)酵液40 L，每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，以無(wú)菌水為對(duì)照，將平板置于25 恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 d后觀察抑菌情況及抑菌圈大小。3株病原細(xì)菌在NA培養(yǎng)液中發(fā)酵培

20、養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，吸取制備好的發(fā)酵液1 mL，加入到熔化并冷卻到45 左右的6 mL NA培養(yǎng)基（瓊脂含量為0.9%）中，混勻，傾覆在已凝固的NA平板上。待上層培養(yǎng)基冷卻凝固后，在平板上打孔（直徑為6 mm），在每個(gè)孔內(nèi)加內(nèi)生菌發(fā)酵液40 L，每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，以無(wú)菌水為對(duì)照，將平板置于25 恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 d后觀察抑菌情況及抑菌圈大小。2 結(jié)果與分析2.1 茶葉內(nèi)生菌的分離供試茶葉樣本內(nèi)生菌分離培養(yǎng)的試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1、2。從7份樣品中共分離到16株細(xì)菌，1株真菌，沒(méi)有分離到放線菌。不同品種間、不同種植方式和不同的加工方式的茶葉樣本的內(nèi)生菌種類(lèi)和含量均存在著一定的差異。茶葉品種“福云六號(hào)”和

21、“大白毫”的新鮮采摘的老葉中均未檢測(cè)到內(nèi)生菌，而芽葉中均存在著大量的內(nèi)生菌，分離到的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量為26.0139.5×106cfu/g。同樣是有機(jī)種植，“福云六號(hào)”芽葉的含菌量是“大白毫”的1.94倍。常規(guī)種植的“大白毫”的芽葉的含菌量為97.5139.5×106cfu/g，明顯高于有機(jī)種植的26.528.3%×106cfu/g。殺青工藝對(duì)有機(jī)種植“大白毫”芽葉內(nèi)生菌含量沒(méi)有明顯影響，但卻使常規(guī)種植芽葉的內(nèi)生菌含量降低30.10%。表1 7種茶葉樣本內(nèi)生菌的分離結(jié)果Table 1 Endophytes isolated from 7 different theas

22、ienensis samples樣品Sample品種名Variety采集地點(diǎn)Collection site類(lèi)型Type內(nèi)生細(xì)菌Endophytic bacterium內(nèi)生真菌Endophytic fungus內(nèi)生菌總量Total種類(lèi)含菌量（×106cfu/g）種類(lèi)含菌量（×106cfu/g）種類(lèi)含菌量（×106cfu/g）大白毫福鼎常規(guī)種植，殺青期長(zhǎng)，芽葉4 97.500.04 97.5大白毫福鼎常規(guī)種植，殺青期短，芽葉3139.500.03139.5大白毫福鼎有機(jī)種植，殺青過(guò)，芽葉3 26.012.34 28.3福云六號(hào)福安有機(jī)種植，新鮮采摘，芽葉3 51.50

23、0.03 51.5福云六號(hào)福安有機(jī)種植，新鮮采摘，老葉0 0.000.00 0.0大白毫福鼎有機(jī)種植，新鮮采摘，芽葉3 26.500.03 26.5大白毫福鼎有機(jī)種植，新鮮采摘，老葉0 0.000.00 0.0樣品號(hào)分離到4株不同菌落形態(tài)的細(xì)菌，樣品II號(hào)與、II號(hào)、IV號(hào)和號(hào)各分離到3株不同菌落形態(tài)的細(xì)菌。同時(shí)，III號(hào)樣品還分離到真菌1株。上述菌株分別編號(hào)為Eb646-Eb662。內(nèi)生細(xì)菌在茶葉中的含量差異顯著，含量最小的Eb656僅為2.0×106cfu/g，含量最高的是Eb651，高達(dá)115.0×106cfu/g。表2 各個(gè)茶葉樣本分離到的內(nèi)生菌的含菌量Table

24、2 Population of each endophyte isolated from the theasienensis samples樣品編號(hào)菌株編號(hào)內(nèi)生菌類(lèi)型含菌量（×106cfu/g）Eb646真菌2.3Eb647細(xì)菌22.0Eb648細(xì)菌52.5Eb649細(xì)菌9.0Eb650細(xì)菌14.0Eb651細(xì)菌115.0Eb652細(xì)菌14.5Eb653細(xì)菌10.0Eb654細(xì)菌21.0Eb655細(xì)菌3.0Eb656細(xì)菌2.0Eb657細(xì)菌32.0Eb658細(xì)菌9.0Eb659細(xì)菌10.5Eb660細(xì)菌7.5Eb661細(xì)菌13.0Eb662細(xì)菌6.02.2 茶葉內(nèi)生細(xì)菌的脂肪酸鑒定由

25、茶葉樣本中分離出來(lái)的15株細(xì)菌的脂肪酸氣相色譜檢測(cè)與MIDI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)的結(jié)果見(jiàn)表3。從表中可見(jiàn)，在TSBA50數(shù)據(jù)庫(kù)中，Eb648、Eb650、Eb651、Eb652、Eb653、Eb654、Eb658、Eb660這8株菌株SI在0.500以上，表明為典型菌種，其中Eb648為類(lèi)球紅桿菌（Rhodobacter sphaeroides）；Eb650為放射根瘤菌（Rhizobium radiobacter），Eb651為Microbacterium testaceum，Eb652、Eb658為爭(zhēng)論產(chǎn)堿菌（Variovorax paradoxus）；Eb653為Rhizobium rubi，Eb6

26、54為樹(shù)狀微桿菌（Microbacterium arborescens），Eb660為蛾微桿菌（Microbacterium imperiale）。表3 茶葉內(nèi)生細(xì)菌的脂肪酸氣相色譜檢測(cè)與MIDI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)的結(jié)果Table 3 Comparison results between the fatty-acid GC detections of theasienensis endophytic bacteria and MIDI library 菌種名稱(chēng)LibrarySimilarity Index*Entry NameEb647MOORE50.199Prevotella-loescheiiEb

27、648TSBA500.729Rhodobacter-sphaeroides (Rhodopseudomonas sphaeroides)Eb649TSBA500.328Variovorax-paradoxus-GC subgroup A (Alcaligenes paradoxus)Eb650TSBA500.799Rhizobium-radiobacter (Agrobacterium tumefaciens)Eb651TSBA500.774Microbacterium-testaceum (Aureobacterium, Curtobacterium)Eb652TSBA500.607Vari

28、ovorax-paradoxus-GC subgroup A (Alcaligenes paradoxus)Eb653TSBA500.527Rhizobium-rubi (Agrobacterium)Eb654TSBA500.618Microbacterium-arborescens (Flavobacterium)Eb655CLIN500.253Pseudomonas-fluorescens-biotype A & FEb656CLIN500.454Rhizobium-radiobacter (Agrobacterium tumefaciens)Eb657TSBA400.486Cel

29、lulomonas-flavigena*Eb658TSBA500.740Variovorax-paradoxus-GC subgroup A (Alcaligenes paradoxus)Eb659TSBA500.421Rhizobium-radiobacter (Agrobacterium tumefaciens)Eb660TSBA500.609Microbacterium-imperiale Eb661TSBA500.338Variovorax-paradoxus-GC subgroup A (Alcaligenes paradoxus)Eb662TSBA500.374Rhizobium-

30、radiobacter (Agrobacterium tumefaciens)* 細(xì)菌鑒定儀對(duì)于Similarity Index的詮釋?zhuān)捍笥?.500：說(shuō)明匹配性很高，為典型的菌種， 大于0.300小于0.500：說(shuō)明匹配性較低，為非典型菌種， 小于0.300：說(shuō)明數(shù)據(jù)庫(kù)沒(méi)有此菌種的數(shù)據(jù)，給出的是最接近的相關(guān)菌種。Eb649、Eb656、Eb657、Eb659、Eb661、Eb662這6株菌株分別在TSBA50、TSBA40、CLIN50數(shù)據(jù)庫(kù)里SI介于0.300與0.500之間，匹配性較低，為非典型菌種。結(jié)合平板菌落形態(tài)，除去Eb657以外的其他5株菌的鑒定結(jié)果可確認(rèn)為正確的。而Eb647、

31、Eb655這2株菌在所有數(shù)據(jù)庫(kù)中找到的SI都很低，數(shù)據(jù)庫(kù)沒(méi)有這些菌種的數(shù)據(jù)，有可能為新種。Eb657、Eb647和Eb655菌株有待于進(jìn)一步的鑒定。將上述已確認(rèn)的13株菌株根據(jù)樣本來(lái)源進(jìn)行分類(lèi)的結(jié)果見(jiàn)表4?！按蟀缀痢保颖綢、II、III、VI）帶有紅桿菌屬（Rhodobacter）、微桿菌屬（Microbacterium）、根瘤菌屬（Rhizobium）和貪噬菌屬（Variovorax）這4個(gè)屬的內(nèi)生細(xì)菌?！案Ｔ屏?hào)”（樣本IV）僅含有根瘤菌屬和貪噬菌屬。兩種茶葉品種含有的相同的內(nèi)生細(xì)菌為放射根瘤菌（R. radiobacter）和爭(zhēng)論貪噬菌（V. paradoxus）。表4 茶葉樣本中所含

32、的內(nèi)生細(xì)菌菌株種類(lèi)Table 4 Varieties of endophytic bateria in different theasienensis samples樣本號(hào)Rhodobacter-sphaeroidesMicrobacteriumRhizobiumVariovorax-paradoxus-GC subgroup AtestaceumarborescensimperialeradiobacterrubiEb648Eb650Eb649Eb651Eb653Eb652Eb654Eb656Eb659Eb658Eb660Eb662Eb6612.3 茶葉內(nèi)生細(xì)菌抑菌譜的測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。因

33、有Eb648在在保存中缺失，因此僅有15株茶葉內(nèi)生菌用于抑菌譜的測(cè)定。供試的15株菌中，有11株對(duì)供試病原菌表現(xiàn)出拮抗活性。內(nèi)生菌Eb656、Eb657、Eb658、Eb659都對(duì)番茄青枯雷爾氏菌表現(xiàn)出很強(qiáng)的拮抗作用，抑菌圈大小為33.0043.00 mm，其中抑菌效果最好的是656號(hào)菌株。Eb656、Eb657、Eb659菌株對(duì)號(hào)西瓜細(xì)菌性果斑病菌具有拮抗作用，抑菌圈大小分別為22.50、28.00和53.00 mm。8株內(nèi)生菌Eb652、Eb653、Eb654、Eb655、Eb659、Eb660、Eb661、Eb662對(duì)棉花黃萎病大麗輪枝菌具有拮抗作用，其中抑菌效果最好的是660號(hào)菌株，抑

34、菌圈可達(dá)到35.00 mm。此外，Eb660、Eb661、Eb662菌株對(duì)西瓜枯萎病尖孢鐮刀菌具有拮抗作用；Eb658號(hào)菌株對(duì)番茄枯萎病尖孢鐮刀菌具有拮抗作用。這15株內(nèi)生菌都沒(méi)有表現(xiàn)出對(duì)豬大腸桿菌K88、黃曲霉、甘藍(lán)輪枝菌、澤瀉白斑病菌和苦瓜炭疽菌這5株病原菌的抑制活性。表5 15株茶葉內(nèi)生菌抑菌譜測(cè)定結(jié)果Table 5 Inhibition spectra of the 15 endophytic bacteria against 10 pathogenies 內(nèi)生菌抑菌圈直徑（mm）*番茄青枯雷爾氏菌豬大腸桿菌K88西瓜細(xì)菌性果斑病菌黃曲霉甘藍(lán)輪枝菌西瓜枯萎病尖孢鐮刀菌澤瀉白斑病菌棉花黃

35、萎病大麗輪枝菌番茄枯萎病尖孢鐮刀菌苦瓜炭疽病菌Eb647-Eb649-Eb650-Eb651-Eb652-18.50-Eb653-15.50-Eb654-13.50-Eb655-13.00-Eb65643.00-22.50-Eb65737.00-28.00-Eb65833.00-12.75-Eb65938.00-53.00-25.00-Eb660-13.75-35.00-Eb661-12.75-20.00-Eb662-13.75-21.50-*“-”代表沒(méi)有拮抗活性。在15株供試的內(nèi)生細(xì)菌中，Eb659號(hào)菌株有著最廣的抑菌譜，能夠抑制3種病原菌，番茄青枯雷爾氏菌、西瓜細(xì)菌性果班病菌和棉花黃萎病

36、大麗輪枝菌株；Eb656、Eb657、Eb658、Eb660、Eb661、Eb662這6株菌株各能抑制2種病原菌；Eb652、Eb653、Eb654、Eb655號(hào)這4株菌株各能抑制1株病原菌；而Eb647、Eb649、Eb650、Eb651沒(méi)有對(duì)供試的10株病原菌表現(xiàn)出拮抗活性。3 討論植物內(nèi)生菌生活在活體植物組織中，其生長(zhǎng)代謝受多方面因素制約，包括宿主植物和外界環(huán)境因子等等5。謝麗華等（2006）研究了茶樹(shù)品種、葉片齡期及葉片化學(xué)成份對(duì)茶樹(shù)內(nèi)生真菌分布影響的研究，發(fā)現(xiàn)在供試的毛蟹、鐵觀音、黃旦和福云六號(hào)這4個(gè)茶樹(shù)品種內(nèi)，黃旦的內(nèi)生真菌分離頻率迭100，而福云六號(hào)只有7.5，表明茶樹(shù)品種不同或

37、遺傳背景不同，其葉片中內(nèi)生真菌的發(fā)生存在明顯差異；同時(shí)隨著茶樹(shù)葉片的成熟，葉片中內(nèi)生真菌的種類(lèi)與數(shù)量逐漸增多，與葉片齡期呈正相關(guān)，葉片齡期影響茶樹(shù)內(nèi)生真菌的種群結(jié)構(gòu)。并且還發(fā)現(xiàn)，在成熟的茶樹(shù)葉片組織中，內(nèi)生細(xì)菌的分離頻率很低6。本研究在大白毫中樣本中分離到一株內(nèi)生真菌，但在福云六號(hào)中未分離到內(nèi)生真菌。同樣地，在福云六號(hào)和大白毫的老葉中均未分離到內(nèi)生細(xì)菌，而兩種茶葉品種的芽葉中均分離到3-4種的內(nèi)生細(xì)菌。上述結(jié)論也表明內(nèi)生菌在茶葉的種類(lèi)與分布會(huì)因茶葉品種和葉片齡期的而存在著差異。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)不同的種植方式和殺青工藝也會(huì)影響茶葉的內(nèi)生菌的存在。脂肪酸是生物體內(nèi)不可缺少的能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是生物

38、體的基本結(jié)構(gòu)成分之一，在細(xì)胞中絕大部分脂肪酸以結(jié)合形式存在，構(gòu)成具有重要生理功能的脂類(lèi)，它是構(gòu)成生物膜的重要物質(zhì)；是有機(jī)體代謝所需燃料的貯存形式；作為細(xì)胞表面物質(zhì)與細(xì)胞識(shí)別、種族特異性和細(xì)胞免疫等有密切關(guān)系。脂肪酸和細(xì)菌的遺傳變異、毒力、耐藥性等有極為密切的關(guān)系7,8。細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)中普遍含有的脂肪酸成分與細(xì)菌的DNA具有高度的同源性，各種細(xì)菌具有其特征性的細(xì)胞脂肪酸指紋圖譜9。國(guó)內(nèi)外已有把脂肪酸用于細(xì)菌鑒定的報(bào)道10-12。目前，在各種農(nóng)作物及果樹(shù)等經(jīng)濟(jì)作物中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)生細(xì)菌已超過(guò)120種(隸屬于54個(gè)屬)。這些內(nèi)生細(xì)菌大多為土壤微生物種類(lèi)，其中假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽胞桿菌屬

39、(Bacillus)、腸桿菌屬(Eterobacter)以及土壤桿菌屬(Agrobacterium)為最常見(jiàn)的屬13。洪永聰?shù)龋?005）進(jìn)行了從茶葉上分離篩選對(duì)茶樹(shù)葉斑病防病效果好、對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥降解效能高的內(nèi)生細(xì)菌的研究。對(duì)福建茶樹(shù)優(yōu)良品種鐵觀音、黃旦、毛蟹、肉桂4種茶葉品種的芽葉、老葉和葉斑病的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離和篩選，結(jié)果表明，茶葉內(nèi)存在大量的內(nèi)生細(xì)菌，分離到的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量為2.939.4×l06cfu/g，不同品種間有一定的差異，同一品種間病葉與健葉的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量差異顯著。所有的分離菌株中有l(wèi)4株對(duì)四種茶樹(shù)葉斑病菌都有不同程度的拮抗效果，且在氯氰菊酯平板上生長(zhǎng)良好，但是僅

40、鑒定了其中效果最好的一株菌TL2，為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）14。本研究從福云六號(hào)和大白毫的芽葉中分離到的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量為26.0139.5×106cfu/g，分離到的內(nèi)生細(xì)菌經(jīng)脂肪酸鑒定從屬于帶有紅桿菌屬（Rhodobacter）、微桿菌屬（Microbacterium）、根瘤菌屬（Rhizobium）和貪噬菌屬（Variovorax）這4個(gè)屬的內(nèi)生菌。關(guān)于植物內(nèi)生菌在防治病害、促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育以及固氮方面的作用，國(guó)內(nèi)外都有研究，我國(guó)有從棉花、水稻、馬鈴薯、番茄、辣椒等植物中分離到內(nèi)生菌，并證明了某些內(nèi)生菌對(duì)植物病害具有防治效果的報(bào)道15。吳藹民（2000）

41、報(bào)道了內(nèi)生菌73a和Ala對(duì)棉花黃萎病的田間防效及增產(chǎn)作用，其中73a的田間防效達(dá)51.28，表現(xiàn)出18.15的增產(chǎn)效果16。袁軍等(2002)報(bào)道了防治馬鈴薯環(huán)腐病有益內(nèi)生菌的分離和篩選及防病效果，篩選出5個(gè)比較好的菌株，其中118菌株定殖、促生、拮抗3種作用兼?zhèn)?7。黎起秦等(2003)報(bào)道了番茄青枯病內(nèi)生拮抗細(xì)菌的篩選及防病效果。其中內(nèi)生菌B47對(duì)番茄青枯病的大田防效達(dá)74.9818。何紅等（2004）報(bào)道了辣椒內(nèi)生拮抗細(xì)菌的篩選及防病效果。其中BS-1和BS-2菌株對(duì)辣椒炭疽菌的防效10d以后為57.3494.0819。張立新等（2005）報(bào)道了番茄內(nèi)生真菌對(duì)多種植物病原菌的抑制效果。

42、其中Fq72菌株的培養(yǎng)濾液對(duì)灰霉和菌核病菌的抑制效果分別達(dá)到75.68和66.1120。本研究供試的15株菌中，有11株對(duì)供試10種病原菌表現(xiàn)出拮抗活性。放射根瘤菌Eb659號(hào)菌株有著最廣的抑菌譜，能夠抑制3種病原菌，番茄青枯雷爾氏菌、西瓜細(xì)菌性果班病菌和棉花黃萎病大麗輪枝菌株，尤其是對(duì)西瓜果斑菌具有極好的抑菌效果，抑菌圈能達(dá)到53.00 mm，對(duì)于作為生防菌防治植物病害具有一定的應(yīng)用和開(kāi)發(fā)價(jià)值。其在植株體內(nèi)的定殖效果以及田間防效有待于進(jìn)一步的試驗(yàn)。參考文獻(xiàn)：1 俞曉平，陳列忠，申屠旭，等植物內(nèi)生菌及其代謝物在生物農(nóng)藥創(chuàng)制中的應(yīng)用J浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2006，18(5)：289-2932 何勁，劉

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